2.15: Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Spektroskopisi

1. NMR Başlangıç Malzemesinin Hazırlanması

1. Temiz bir NMR tüpüne ~ 10 mg başlangıç materyali ekleyin.
2. Başlangıç malzemesini ~ 0.7 mL döteryumlu çözücü içinde çözün (örnek CDCl₃ verilmiştir). İyi bir spektrum için uygun bir çözücü yüksekliği 4,5-5 cm'dir.
3. NMR tüpünü dikkatlice kapatın ve numune adını kapağın üzerine yazın.
4. Tüm malzemenin çözündüğünden emin olmak için numuneyi hafifçe çalkalayın. Solvent ile kapak arasında, numunenin olası kontaminasyonuna yol açabilecek temastan kaçınmaya dikkat edin.
5. NMR tüpünü dikkatlice bir döndürücüye yerleştirin. Döndürücü, tüm numunenin homojen bir manyetik alana maruz kalmasını sağlamak için mıknatısa yerleştirildikten sonra dönecektir. Parmak izlerini ve kiri temizlemek için NMR tüpünün ve döndürücünün dışını 2 propanol ve laboratuvar mendilleriyle temizleyin.
6. Spektrometreye zarar verebileceği için NMR tüpünün alt kısmının NMR probuna çok fazla yerleştirilmediğinden emin olmak için döndürücüyü bir numune derinlik ölçere yerleştirin. Farklı probların farklı numune derinlikleri vardır ve kullanıcı belirli derinlik ölçerin farkında olmalıdır.
7. Numuneyi NMR spektrometresine yerleştirin. Burada bir otomatik örnekleyici ile donatılmış bir Varian 400 MHz spektrometresi kullanıldı.
8. NMR ölçümünün tamamlanmasından sonra, spektrumu işleyin ve spektrumdaki tepe noktalarını atayın.

2. 3 M NaOH Hazırlanması ve Kalkon Sentezi

1. 50 mL'lik bir hacimsel şişeye 60 mg NaOH ekleyin.
2. Şişenin yarısına deiyonize su ekleyerek NaOH'yi çözün. İşarete ulaşılana kadar daha fazla su ekleyerek çözeltiyi daha da seyreltin.
3. Manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış 50 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye 10 mL etanol ekleyin.
4. Daha sonra, aynı şişeye adım 2.1'de hazırlanan 680.5 mg 4-metoksibenzaldehit ve 5 mL NaOH çözeltisi ekleyin.
5. Karıştırılan çözeltiye daha sonra 671 mg 4-metilasetofenon ekleyin ve şişeyi kapatın ve oda sıcaklığında karıştırın.
6. Başlangıç malzemelerinin tam olarak tüketilmesine kadar 30 dakikalık aralıklarla ¹H NMR ile reaksiyonun ilerlemesini izleyin (bkz. adım 3).
7. Reaksiyon tamamlandığında (~ 3 saat) 5 mL su ekleyin. Elde edilen çökeltiyi süzün ve 20 mL 1: 2 etanol / su ile yıkayın. Çökeltinin kurumasını bekleyin.
8. Elde edilen ürünün verimini hesaplayın. Adım 1.2.2.7'ye göre bir NMR numunesi hazırlayın. ¹H NMR ile saflığı kontrol edin. Saf değilse, ürünü etanol ile yeniden kristalleştirme yoluyla saflaştırın.
9. Bir Pasteur pipeti kullanarak bir NMR tüpüne yaklaşık 3 damla reaksiyon karışımı ekleyin ve pipeti döteryumlu çözücü ile durulayın.
10. 1.2–1.8 arasındaki adımları tekrarlayın.

3. Bir NMR Spektrumunun Kısa Yorumu

1. Spektrumu uygun bir programla işleyin (örnek MestReNova verildi).
2. Tablo 1'deki NMR kaymalarıyla farklı zirveleri ilişkilendirin. Kimyasal değişimler, protonların ne tür bir ortamda var olduğuna dair bir ipucu verir.
3. Her bir tepe noktasına karşılık gelen hidrojen sayısını vermek için tepe noktalarını entegre edin. Tüm tepe noktalarının entegrasyonu, göreceli bir toplam proton sayısı verir.
4. Komşuların sayısını gösteren proton tepe noktalarının bölünmesini değerlendirin.
5. Protonların birbirine nasıl bağlandığını görmek için J-kuplajını ölçün.

Nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopisi, organik kimyada numunelerin moleküler yapısını ve saflığını belirlemek için önemli bir yöntemdir.

NMR spektroskopisinde numuneler güçlü bir manyetik alana maruz bırakılır. Maruz kaldıktan sonra, belirli çekirdekler gizli enerji seviyeleri arasında geçiş yapar veya rezonansa girer. Bu seviyeler arasındaki enerji boşluğu spektrum olarak ölçülebilir ve görselleştirilebilir. Bu veriler, numunenin kimyasal yapısını aydınlatmak için kullanılabilir.

Tüm çekirdekler NMR-aktif olmak için gerekli özelliklere sahip değildir. İncelenen yaygın izotoplar 1H, 2H, 13C, 19F ve 31P'dir.

Bu video, NMR'nin arkasındaki ilkeleri tanıtacak, bir kimyasal reaksiyonun farklı aşamalarından NMR örneklerinin örnek hazırlıklarını adım adım inceleyecek ve çeşitli uygulamaları tartışacaktır.

NMR cihazında, süper iletken bir mıknatısı soğutmak için sıvı nitrojen ve helyum kullanılır. Mıknatıs, bir numuneye sabit bir manyetik alan uygular. Numunenin içinde, tek sayıda proton ve/veya nötron içeren atom çekirdeği, ya düşük enerjili bir durumu benimseyerek alanla hizalanacak ya da ona karşı, yüksek enerjili bir durumu benimseyecektir.

İki seviye arasındaki enerji farkı, uygulanan alanın gücüne ve çekirdeğin tipine bağlı olan rezonans frekansıdır. NMR'de kullanılan mıknatıslar için değer, radyo frekansı veya RF aralığındadır.

Bir RF bobini, numuneyi bir radyo frekansı darbesi ile uyarır ve düşük enerjili çekirdekleri geri dönmeden önce daha yüksek duruma hareket ettirir. Bobin, tepe noktaları olarak görüntülenen manyetizasyondaki bu değişiklikleri algılar.

NMR'nin gücü, çekirdekleri, bu durumda hidrojeni, kimyasal ortamlarına göre ayırt etme yeteneğinde yatmaktadır. Komşu atomlardaki elektronlar, çekirdeği manyetik alanın bir kısmından bloke edecek veya "koruyacaktır". Bu etkili alan, kimyasal kayma adı verilen belirli çekirdekler için rezonans frekansını değiştirir. Etanolde metilen, hidroksil ve metil protonların hepsi benzersiz rezonans frekanslarına sahiptir. Her bir tepe noktasının altındaki alanı belirlemek, her bir proton türünün sayısını aydınlatır.

Farklı manyetik kuvvetlere sahip aletler rezonans frekanslarını değiştireceğinden, numuneye eklenen standart bir moleküle, genellikle tetrametilsilan veya TMS'ye atıfta bulunulur. Frekansların kimyasal kayması çok küçüktür, genellikle milyonda parça veya ppm olarak rapor edilir.

Yüksek çözünürlüğe sahip güçlü bir mıknatıs kullanırken, tepe noktaları bazen alt tepelere bölünür. Buna, bazıları manyetik alanla hizalanmış, bazıları karşı olan komşu çekirdekler neden olur; çekirdeğe uygulanan etkili alanı daha da değiştirmek. Etanolde, 2 metilen protonu, metil zirvesini iki kez üçlüye böler ve 3 metil proton, metilen zirvesini üç kez bir dörtlüye böler. Bölünmenin veya J-eşleşmesinin mesafesi, çekirdeğin mesafesi ile ilgilidir ve kalitatif keşfe yardımcı olur.

Artık NMR'nin arkasındaki temel ilkeleri anladığınıza göre, bir aldehit ve ketondan kalkon sentezini izlemek için proton NMR kullanan örnek bir prosedürü gözden geçirelim.

Bir behere küçük bir miktar başlangıç malzemesi eklemek için bir Pasteur pipeti kullanarak başlayın. Çeker ocak içine geçin ve başlangıç malzemesini 0,7 mL döteryumlu çözücü ile seyreltin. Döteryumun rezonans frekansı proton aralığının dışında olduğu için döteryumlu çözücüler kullanılır.

Seyreltilmiş başlangıç malzemesinden 0,7 mL temiz bir 5μmm NMR tüpüne eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın ve alt kısmı 4,5?5 cm doldurun. NMR tüpünü kapatın ve etiketleyin. Numune ile kapak arasında temastan kaçınmaya dikkat ederek tüpü hafifçe sallayın. Ardından, tüpü döndürücüye yerleştirin.

2-propanol ve laboratuvar dokuları kullanarak tüpün ve döndürücünün dışını temizleyin. Ardından numune düzeneğini derinlik ölçere yerleştirin ve yerleştirme derinliğini kalibre edin.

Kalibrasyondan sonra, numune düzeneğini manuel olarak veya bir otomatik numune alma cihazı kullanarak NMR spektrometresine yükleyin. Son olarak, NMR spektrumunu elde etmek için bir bilgisayar iş istasyonu kullanın.

Reaksiyonun başlangıç malzemelerinin her biri için bu prosedürü kullanarak NMR spektrumları oluşturun. Kalkon sentezi için, hem metoksibenzaldehit hem de metilasetofenon için spektrumlar oluşturulmalıdır.

Ardından, reaksiyonu başlatmak için başlangıç malzemelerini ve reaktifleri bir şişede birleştirerek numune sentezini gerçekleştirin.

30 dakikalık aralıklarla, bir Pasteur pipeti kullanarak reaksiyon karışımının küçük bir alikotunu çıkarın ve temiz bir NMR tüpüne 3 damla ekleyin.

Bu ham reaksiyon ürününü döteryumlu çözücü ile seyreltin ve daha önce açıklanan prosedürü kullanarak NMR için hazırlayın.

Reaksiyon ilerledikçe sarı bir çökelti oluşacaktır. Reaksiyon tamamlandığında, çökeltiyi yıkayın ve süzün ve saflaştırılmış reaksiyon ürünü için NMR spektrumları oluşturun.

Artık kimyasal reaksiyonun her aşamasında NMR spektrumları oluşturduğumuza göre, bunları analiz edelim.

Başlangıç malzemelerinin her biri için NMR spektrumlarının tepe noktaları, kimyasal kaymalarına ve her bir tepe noktasına katkıda bulunan proton sayısına göre molekül içindeki farklı proton gruplarına atanır. Burada, metilasetofenon ve metoksibenzaldehit için 4 ana proton grubunu atıyoruz ve aldehit tepe noktasını 9.5 ile 10.5 ppm arasında not ediyoruz. Ham reaksiyon ürünlerinin NMR spektrumlarını farklı zaman noktalarında karşılaştırarak, kalkon sentezleyen kimyasal reaksiyonun evrimi aydınlatılır. Örneğin, başlangıç malzemesi metoksibenzaldehitten gelen aldehit zirvesi, 30 dakikalık reaksiyondan sonra hala mevcuttur, ancak 3 saat sonra tamamen kaybolur, bu da reaksiyonun tamamlandığını gösterir.

Saflaştırılmış ürünün spektrumunu inceleyerek, her bir zirveyi kalkonun yapısındaki bir proton grubuna atayabiliriz. Örneğin, 3 ve 4 numaralı zirveleri incelediğimizde, integrallerinin her ikisinin de bir olduğunu ve sadece bir proton içeren gruplara karşılık geldiğini görürüz.

Tepe 3 ve 4, bir komşu protonu gösteren çiftler olarak adlandırılır. Her ikisinin de 16 Hz'lik J-eşleşme sabitleri vardır, bu da protonların bir E-çift bağ boyunca yer aldığını düşündürür. Saflaştırılmış reaksiyon ürününün tüm NMR tepe noktalarını atayarak, saf bir kalkonun sentezini doğrularız.

NMR spektroskopisi geniş bir uygulama alanına sahiptir ve birçok bilimsel ve tıbbi alanda kullanılmaktadır.

Bu uygulamada, proton NMR, NMR spektrumları farklı tepe bölme modellerine sahip olan hem diamidokarben hem de mononoamidokarbinin sentezini ve yapısını doğrulamak için kullanılır. Bu karbenler ayrıca beyaz fosfor ile birleştirildiğinde görünüşte farklı reaksiyon ürünleri üretti; DAC1 parlak kırmızı bir reaksiyon ürünü üretirken, MAAC2 parlak turuncu bir ürün üretti. Reaksiyon ürünlerindeki bu farklılıklar, ikinci bir NMR uygulaması olan 31P kullanılarak doğrulandı. Fosfor çekirdeklerinin rezonans frekansındaki farklılıklara dayalı olarak spektrumlar üreten NMR.

Burada, beynin anatomik bir haritasını oluşturmak ve ilgilenilen beyin bölgelerini seçmek için nükleer manyetik rezonans görüntüleme veya MRI kullanıldı. Daha sonra anahtar metabolitlerin spektrumlarını oluşturmak için NMR spektroskopisi kullanıldı. Son olarak, MRG kullanılarak farklı deneysel koşullarda beyin metabolizmasındaki değişiklikler değerlendirildi.

Bu uygulamada, bağlanma özelliklerini analiz etmek ve bakır bağlayıcı bir peptitin 3 boyutlu bir yapısını önermek için NMR kullanıldı. İlk olarak, NMR spektrumları, peptidin bağlanmamış ve bakıra bağlı durumları için karşılaştırıldı. Daha sonra, daha gelişmiş 2 boyutlu NMR teknikleri kullanılarak, peptit yapısının farklı potansiyel konformasyonları değerlendirildi. Son olarak, bu NMR'den türetilen yapısal kısıtlamalar, bağlanmamış peptit için önerilen bir 3 Boyutlu yapı geliştirmek için kullanıldı.

JoVE'nin NMR Analizine girişini az önce izlediniz. Artık NMR spektrumları oluşturma ve analizinin arkasındaki temel ilkelerin yanı sıra NMR numune hazırlama prosedürünü anlamalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler!