Name: Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Keşfedin HepG2 hücrelerinde organoklor pestisitlerin mitokondriyal fonksiyona etkisini değerlendirmek için ATP seviyesi ve oksijen tüketimi ölçüm yöntemlerini. Bu protokol toksikolojik araştırmalarda metabolik bozuklukları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81573174, 81570574) tarafından desteklenmiştir; Jiangsu Eyaleti Üstün Gençlik Fonu (SBK2014010296); Çin Eğitim Bakanlığı Araştırma Projesi (213015A); Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (PAPD) Öncelikli Akademik Program Gelişimi, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Önemli Gelişimi; ve Devlet Kilit Çevre Kimyası ve Ekotoksikoloji Laboratuvarı Açık Proje Programı (KF2015-01).

Tüm deneyler ve deney protokolleri ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi ve Nanjing Tıp Üniversitesi Yerel Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. TEM tarafından Mitokondriyal ultrayapı
<ol><li>HepG2 hücrelerinin toplanması<ol>
<li>100 mm'lik tabaklarda Tohum HepG2 hücreleri. 37 °C ve %5 CO2'desaklayın.</li>
		<li>1,5 mLEP tüpte %0,25 EDTA içeren hücreleri sindirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında (RT) 3 dk için 1000 x g santrifüj. Supernatant atın.</li>
		<li>4-6 x 105 HepG2 hücreleri toplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL%5 glutaraldehit (Solvent: çift distile su) pipetlerle ve 4°C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1 mL fosfat tamponunun 4 mL'lik değişikliklerini ekleyin ve yıkayın (Na2HPO4, KH2PO4, NaCl ve KCl, pH 7.4), her biri 15 dk. Pipetlerle fosfat tamponu em.</li>
	<li>200 μm% 1 osmiyum (Solvent: çift distile su) ekleyin ve 4 °C'de 2 saat siyah numune için kuluçka. Dikkat: Osmiyum son derece zehirli ve uçucu bir maddedir. İlaç dolabında dikkatle çalıştırılmalıdır.</li>
	<li>1 mL fosfat tamponu 2 değişiklik ekleyin ve yıkayın, her biri 5 dakika. Fosfat tamponu em.</li>
	<li>2 saat boyunca 1,5 mL EP tüpte %2 uranyl asetat çözeltisinde (Çözücü: çift distile su ve asetik asit) leke.</li>
	<li>Dehydrate ve% 50 aseton,% 70 aseton, 90% aseton (Solvent: çift distile su), mutlak aseton 2 değişiklik, 15 dakika her yoluyla batırın.</li>
	<li>RT'de 1,5 saat için 2 damla aseton (%100)/gömme maddesi (1:1) nüfuz edin. Epon812 gömme ajan, tarifi aşağıdaki gibidir: A: Epon812, 62 mL ve DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL ve MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, kışın), A:B=1:9 (v:v, yazın). Katıştırma kalıplarına gömme (Damalı ızgaralı yumuşak plastik plaka).</li>
	<li>37 °C'de 12 saat, 45 °C'de 12 saat, 60 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ultraince kesitler (en büyük alan 0,5 mm × 0,3 mm'yi geçemez) ultraince kesitler makinesi ve TEM (2 μm ve 500 nm) ile hazırlayın ve gözlemleyin.</li>
</ol>2. Mitokondriyal floresan yoğunluk tespiti
<ol><li>Tohum 2x 104 HepG2 hücreleri 6-iyi plakalar içinde. Β-HCH'yi 24 saat ekleyebilirsiniz.</li>
	<li>1 mM mitokondriyal yeşil floresan prob son konsantrasyonu formüle etmek için susuz DMSO ekleyin.</li>
	<li>6 kuyulu plakaların her kuyusuna 1 mL mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisi (son konsantrasyon: 200 nM) ekleyin, 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisini çıkarın ve görüntülemeden önce 37 °C'de taze hazırlanmış hücre kültürü ortamını (DMEM) ekleyin.</li>
	<li>Bir floresan mikroskobu (10x) ile mitokondriyal yeşil floresan gözlemleyin. Algılamada maksimum uyarma dalga boyu 490 nm, maksimum emisyon dalga boyu 516 nm'dir.</li>
</ol>3. Hücresel ATP düzeylerinin tsay
<ol><li>Tohum HepG2 hücreleri 6-iyi plakalar. Β-HCH'yi 24 saat ekleyebilirsiniz.</li>
	<li>Luciferase-luciferin ATP isp kitinden 6 kuyunun her kuyuya 200 μL lysis tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dk için 12.000 x g centrifuge, yeni tüpler içine pipetler ile supernatant toplamak.</li>
	<li>ATP algılama arabelleği olarak ATP seyreltme oranı ile ATP algılama reaktifini 1: 5 oranında seyreltin.</li>
	<li>Standart eğri tayinini hazırlayın: 0,5 mM ATP standart çözeltisini ATP lisis tamponları ile 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM'ye seyreltin.</li>
	<li>RT'de 5 dakika boyunca 96 kuyulu bir plakaya 100 μL ATP algılama tamponu ekleyin ve bir luminometre (kemilüminesans dedektörü) tarafından tespit edilen 100 μL'lik hücre süpernatantını ekleyin. Standart eğri olmasına rağmen ATP konsantrasyonu (nmol/L) hesaplayın.</li>
	<li>Çok modlu okuyucu ile bca protein ispon kiti ile protein konsantrasyonunu sapta.<ol>
<li>Standart eğri tayininin hazırlanması: Protein standardı çözeltinin 5 mg/mL'sini 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ve 0,5 mg/mL'lik protein standart çözeltisini çift distile su ile seyreltin.</li>
		<li>96 kuyulu bir tabağa 1 μL'lik süpernatant hücre ekleyin ve 19 μL çift distile su ekleyin.</li>
		<li>Her kuyu için 200 μL BCA algılama çözümleri ekleyin. 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın. 562 nm ile çok modlu bir okuyucu tarafından OD (optik yoğunluk) değerini algıla. Standart eğriolsa da protein konsantrasyonu (mg/mL) hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mg protein konsantrasyonu başına ATP içeriğini düzeltin (ünite: ATP konsantrasyonu/protein konsantrasyonu, nmol/mg).</li>
</ol>4. JC-1 tarafından mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) değerlendirmesi
<ol><li>6 kuyu plakaları tohumlu HepG2 hücreleri toplamak. 1,5 mL EP tüpte %0,25 EDTA ile hücreleri sindirin, 1000 x g'de 3 dk santrifüj, süpernatantı atın ve hücreleri toplayın.</li>
	<li>Girdap ve karıştırmak için 8 mL distile su 50 μL JC-1 (200X) ekleyin. JC-1 algılama çözeltisi olarak 2 mL JC-1 (5X) boyama tamponu ekleyin.</li>
	<li>37 °C'de 20 dk için 0,5 mL hücre kültürü orta ve 0,5 mL JC-1 algılama çözeltisi karışımı ile inkübat hücreleri.</li>
	<li>Santrifüj 600 x g için 3 dk 4 °C'de. Supernatant atın.</li>
	<li>1 mL JC-1 (1X) boyama tamponu, santrifüj 600 x g'de 4 °C'de 3 dk'da 2 mL'lik 2 değişiklikle durulayın. Ve supernatant atın.</li>
	<li>JC-1 (1X) boyama tampon0,5 mL hücreleri askıya, yeşil ve kırmızı floresan tespit etmek için akış sitometri ile analiz. JC-1 polimeri algılandığında, uyarma ışığını 490 nm'ye, emisyon ışığını ise 530 nm'ye ayarlayın. JC-1 polimeri algılandığında, uyarma ışığını 525 nm'ye, emisyon ışığını ise 590 nm'ye ayarlayın.</li>
</ol>5. Oksijen tüketim oranları (OCR) ölçümleri
<ol><li>Tohum HepG2 hücreleri hücre kültürü mikroplakaları 96-iyi bir yoğunlukta 4500 hücre/100 μL başına. 24 saat sonra her kuyu ile kaplı hücreleri emin olun.</li>
	<li>Önceki literatüre göre, hazırlanan reaktiflerin uygun hacimli uygun enjeksiyon portu içine ekleyin13. Port A: 25 μL 1 μM oligomisin (ATP Coupler); Port B: 25 μL 0.75 μM FCCP (Elektronik Gaz Kontrolü, ETC Hızlandırıcı); Port C: 25 μL 0.5 μM antimisin A/rotenone (mitokondriyal inhibitör A ve mitokondriyal inhibitör B).</li>
	<li>Kartuşu kullanıma hazır olana kadar CO2 olmadan 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde saklayın.</li>
	<li>Çalışan ortamı her kuyudan çıkarıp yeni DMEM'e ekleyerek hücre plakasını orta bir şekilde değiştirin. Her kuyu için son hacim 180 μL'dir.</li>
	<li>Hücre plakasını 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde, tramadan önce 1 saat boyunca CO2 olmadan saklayın.</li>
	<li>OCR'yi yazılımla otomatik olarak kaydedin.<ol>
<li>OCR yazılımını açın.</li>
		<li>Uygulamalar açılır menüsünden Hücre Mito Stres Test Kiti'ni seçin.</li>
		<li>Uygulamayı Başlat düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Stres Testini Çalıştır düğmesini tıklatın. Hücre Vurgutesti Kurulum ekranı görüntülenir.</li>
		<li>Aşağıdaki adımları yapın:<ol>
<li>Hücre tohumlama # kutusuna iyi başına tohumlanmış hücre sayısını girin.</li>
			<li>Ortalama bazal OCR kutusuna ortalama OCR girin.</li>
			<li>Her reaktif için son çalışma konsantrasyonu girin ve reaktifler enjekte. NOT: Hücre tohumlama konsantrasyonu için optimizasyon yaparken optimizasyon tahtını çalıştırmadan önce hücre için ortalama bazal OCR değeri tespit edilmelidir.</li>
			<li>İleri düğmesini tıklatın. Grup bilgi ekranı görüntülenir.</li>
			<li>Bir renk seçerek ve bir ad vererek ve uygun kuyuları tıklatarak atanmamış kuyulara bir grup atayın. NOT: Hücre Mito Stres Testi'nin çalıştırılması öncesinde farklı gruplar farklı tedaviler olarak tanımlanır. Stres testi yapıldığında mikroplakaların tüm kuyuları aynı reaktif enjeksiyonları alırsınız.</li>
			<li>İleri düğmesini tıklatın. Stres Testi Enjeksiyon Düzeni ekranı görüntülenir.</li>
			<li>Başlat'ı tıklatın. Stres Testi artık Analyzer'da çalıştırılır. Çalıştırma bittiğinde, yazılımdaki noktayı takip edin, kartuş ve hücre plakasını çıkarın ve atın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79(2015).</li>
<li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li>
<li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+persistent+organic+pollutants%3A+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li>
<li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hydrogen+affects+body+composition%2C+metabolic+profiles%2C+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li>
<li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified%2C+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li>
<li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+%28IDH1%29+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li>
<li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes%3A+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339(2017).</li>
<li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells%3A+Implications+for+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li>
<li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853(2017).</li>
<li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5216043/">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295(2016).</li>
<li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li>
<li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li>
<li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+kinase+2+%28GRK2%29+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li>
<li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319(2017).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li>
<li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li>
<li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li>
<li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Algılama protokolünün başarısı için kritik olan, fenotipten mekanizmaya kadar çalışma kapsamında yer alan çeşitli deneysel yöntemlerin kullanılmasıdır. Bu çalışmada DMEM'de HepG2 hücreleri penisilin ve streptomisin ve %10 fetal sığır serumu ile kültürlendi. Hücreler %40-50 birleştiğinde β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) eklenmiş ve 24 saat kuluçkaya yatırıldı. İlk olarak, temsilci OKP'lerin neden olduğu hepatositteki ultrastrüktürel değişiklikleri gösteren TEM'i kullandık, β-HCH, mitokondri yapısının bozulmasını gösterdi ...

Organoklorin pestisitlerinin (OKS) sağlık üzerindeki etkileri, örneğin üreme paraziti, immünolojik toksisite, metabolik değişiklikler daha önce incelenmiştir1,2,3. Hücresel metabolizmayı saptamak ve mitokondriyal disfonksiyon bulmak için yöntemler bilim adamları mitokondriyal fonksiyonun rolünü anlamak için etkin(yani., mitokondriyal STAT3 düzeyleri, laktat, pirüvat, laktat-pirüvat oranı, koenzim Q10, mitokondriyal proton sızıntısı, biyoenerjit, biyogenez ve dinamikler) yaşlanma gibi alanlarda, obezite, diyabet, kardiyovasküler fonksiyon, kanser, ve güvenlik toksisitesi4,5,6,7. Bu yazıda OKP'lerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyonudeğerlendirme yöntemleri ni açıklanmıştır.
HepG2 hücrelerini, insan iç maruziyetine eşdeğer bir dozda 24 saat boyunca, bir temsilci OKP olan β-heksaklorosikloheksan (β-HCH) maruz bıraktık. Öncelikle, TEM nükleus, mitokondri ve endoplazmik retikulum 8 gibi hepatositlerin8ultrayapısını gözlemlemek için uygulanmıştır. Tem, sıradan mikroskoplarla karşılaştırıldığında, hücre ve hücre bileşenlerinin (hücre hatları veya doku), morfolojisi, kimyasal bileşimi ve modern bilim ve teknolojide önemli bir rol oynayan doğal veya yapay malzemelerin işlevinin 2D ve 3Boyutlu ultra yapısını keşfetmeyi mümkün kılmıştır. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon daha fazla mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5'-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mito-tracker yeşil canlı hücre mitokondri-spesifik floresan boyama için kullanılabilecek bir mitokondri yeşil floresan sonda. Hepatositlerde mitokondri mito-izci yeşil çözeltisi ile boyandı ve mitokondriyal floresan yoğunluğu, sayısı ve paterni konfokal mikroskopi ile gözlendi9. Mitokondriyal yeşil floresan sonda canlı hücreleri lekelemek için kullanılabilir. Rhodamine 123 veya JC-1 ile karşılaştırıldığında, mitokondriyal yeşil floresan prob mitokondriyal boyama için mitokondriyal membran potansiyeline bağlı değildir. ATP düzeyleri luciferase-luciferin kiti ile belirlendi ve protein konsantrasyonu ile normalleştirildi. ATP tsay kiti ortak çözümler, hücreler veya dokularda ATP düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir. Bu kit floresan oluşturmak için floresan tarafından katalize firefly luciferase dayanmaktadır, ATP enerji sağlamak için gerekli olduğunda. Ateş böceği luciferase ve floresan aşırı olduğunda, belirli bir konsantrasyon aralığında, floresan üretimi ATP konsantrasyonu ile orantılıdır. Buna ek olarak, bu kit özel ATP kemilüminesans optimize etmek için tasarlanmıştır. ATP, en önemli enerji molekülleri olarak, hücrelerin çeşitli fizyolojik veya patolojik süreçlerinde önemli bir rol oynar. ATP düzeylerindeki değişiklikler hücre fonksiyonundaki kusurları, özellikle mitokondriyal enerji üretimini yansıtabilir. Genellikle apoptoz altında, nekroz veya bazı toksik durumda, hücresel ATP düzeyleri azaltılmış 10. JC-1'li MP'ler teşp kiti, hücreleri, dokuları veya saflaştırılmış MDP'leri hızlı ve hassas bir şekilde tespit etmek için JC-1'i floresan sonda olarak kullanan bir kittir. Apoptozun erken teşhisi için kullanılabilir. Katyonik boya JC-1, yeşil ve kırmızı floresan oranı değişiklikleri ile gösterilen akış sitometrisi altında analiz edilebilen MMP'yi tespit etmek için kullanılan bir floresan sondadır. MMP yüksek olduğunda, JC-1 kırmızı floresan üreten bir polimer (J-agregalar) oluşturmak için mitokondri matris toplanır. MMP düşük olduğunda, JC-1 birikemez ve yeşil floresan11üreten monomer oluşturur. Yani kırmızı ve yeşil floresan oranı MMP düzeyini yansıtabilir. Hücrelerin OCR normal hücresel fonksiyonun önemli bir göstergesidir12. Mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için bir parametre olarak kabul edilir. Hücre mito stres test kiti mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerini analiz etmek için kararlı bir yöntem sağlar. Kit, hücre mitokondriyal stres testi yapmak için standart bir yöntemin yanı sıra kalite kontrol ve prediktif reaktifler sağlar. Birincil hücreler, hücre hatları, askıda hücreler ve adacıklar, nematodlar, mayalar ve izole mitokondriler de dahil olmak üzere tüm hücre türlerini tespit etmek için kullanılabilir.
OCR ölçümü, hücrelerin fizyolojik durumu veya değişiklikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Solunum taban çizgisi, proton sızıntısı, maksimal solunum, ATP cirosu ve rezerv kapasitesini saptamak için hücre dışı akı analizörü ile belirlendi. Kısacası, OCR'nin bazal ölçümlerinden sonra, ocr ardışık olarak oligomisin (ATP Coupler), FCCP (mitokondriyal oksidatif fosforilasyon uncoupler) ve antimisin A/rotenone (oksijen tüketiminin inhibitörü) ekolarak eklendikten sonra saptandı.
Hepatositlerde in vitro olarak mitokondriyal fonksiyonun saptanması için daha spesifik protokolün geliştirilmesini kolaylaştırmak amacıyla, burada TEM, konfokal mikroskopi, luminometre, akış sitometrisi ve hücre dışı akı analizörü ile mitokondri hasarına bağlı yan etkilerin incelenmesinde ileride uygulama ile deneyler sokuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>Yüksek kontrastlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme, Düşük doz gözlem ve görüntüleme, Düşük sıcaklık gözlemi, Olağanüstü analitik performans, Kolaylık ve performans için otomasyon</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Green, canlı hücre mitokondriyal spesifik floresan boyama için kullanılabilen mitokondriyal yeşil bir floresan probdur.</td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>Tasarım kompakt, kararlı, ışık yolu en kısa, yüksek ışık hassasiyeti, yaratıcı teknoloji ve gelişmiş tarama teknolojisi birlikte mükemmel bir 3 boyutlu numune görüntüsü üretir.</td></tr><tr><td>Geliştirilmiş ATP Test Kiti</td><td>Beyotime</td><td>S0027</td><td>Geliştirilmiş ATP Test Kiti, yaygın çözeltilerde, hücrelerde veya dokularda ATP (adenozin 5'-trifosfat) seviyelerini tespit etmek için kullanılabilir. Hücreler ve doku numuneleri, numune hazırlığını tamamlamak için bölünebilir, 0.1nmol / L'ye kadar algılama hassasiyeti, kemilüminesans 30 dakika boyunca sürdürülebilir.</td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>Berthold</td><td>Centro LB 960</td><td>Luminometre kemilüminesans dedektörüdür, test numunesinin kendisi hafif olabilir, uyarılmasına gerek yoktur. Luminometre, kemilüminesansı tespit eden cihazdır.</td></tr><tr><td>BCA Protein Test Kiti</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>BCA Protein Test Kiti, protein konsantrasyonlarını tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir.</td></tr><tr><td>Çok modlu okuyucu</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>Çok modlu okuyucu, protein rızasını tespit etmek için kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

organoklor intarımlarına maruz kalan hepatositlerde mitokondriyal fonksiyonun saptanması için deneysel protokol

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Bu yazı, hepatositlerde çevresel organoklorin pestisitlerinin (OCP) neden olduğu metabolik bozuklukların nedenini daha iyi anlamak için hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması için ayrıntılı yöntemler sunmaktadır. HepG2 hücreleri β-heksaklorosiklohekza (β-HCH) 24 saat boyunca genel popülasyonda eşdeğer bir iç maruziyet dozuyla maruz kaldı. Hepatositlerde ultrayapı iletim elektron mikroskobu (TEM) tarafından incelendi ve mitokondrinin hasarını gösterdi. Β-HCH ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon mitokondriyal floresan yoğunluğu, adenozin 5'-trifosfat (ATP) düzeyleri, oksijen tüketim hızı (OCR) ve mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ile değerlendirildi. Mitokondriyal yeşil floresan sonda ile lekelendikten sonra mitokondri floresan yoğunluğu floresan mikroskopi ile gözlendi. ATP düzeylerini belirlemek için luciferin-luciferase reaksiyonu kullanıldı. MMP katyonik boya JC-1 tarafından tespit edildi ve akış sitometrisi altında analiz edildi. OCR hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü. Özetle, bu protokoller hepatositlerde mitokondriyal fonksiyonun saptanmasında ve mitokondri hasarlarının araştırılmasında kullanılmıştır.

Β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinin mitokondri cristae'si belirgin şekilde hasar görmüştür. Dağınık mitokondri ler belirgin bir şekilde genişletildi, düzensiz şekilli ydi ve mitokondriyal sırt nispeten anormal mitokondriyal mimari ile kayboldu(Şekil 1).
Mitokondriyi temsil eden ortalama mitokondriyal yeşil floresan yoğunluğu β-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinde(Şekil 2),<...

Çevresel organoklorin pestisitlerinin (OKP) hepatositlerde mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisinin anlaşılması metabolik bozukluklara neden olan OKP'lerin mekanizmasının araştırılmasında önemlidir. Bu yazıda hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması nda ayrıntılı yöntemler yer alıyor.

Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Atp seviyesi ve oksijen tüketim oranları gibi alanın bir fonksiyonu nda da sahip olduğunuz önemli bir soruya cevap veren bir karmaşadır. Yeni ya da bir sayfa eski, bu teknik gerçekleştirmek kolay ve hücresel mitokondriyal fonksiyonun özel bir değerlendirme için çok şey var. Bu deneyi başlatmak için, tohum 20, 000 HepG2 hücreleri bir cam alt Petri çanak.24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de kuvözde beta-hekzachlorcyclohexane veya B-HCH ekleyin. DMEM hücre kültürü ortamına susuz DMSO ekleyerek bir milimolar mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisi hazırlayın. Sonra cam alt Petri kapları hücrelere bu çözeltinin çanak başına bir mililitre ekleyin.Ve 45 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, hücrelerden mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisini çıkarın. Taze hazırlanan çanak başına bir mililitre ekleyin 37 santigrat derece DMEM hücre kültürü orta.Mitokondriyeşil floresan tespit etmek için, bir konfokal mikroskop altında hücreleri gözlemlemek. Hücresel ATP düzeylerini değerlendirmek için, tohum 20, 000 HepG2 hücreleri altı kuyu plakaları. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede beta-HCH ve kuluçka ekleyin.Her kuyudaki hücrelere 200 mikrolitre lysis

experimental-protocol-for-detecting-mitochondrial-function

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Model organizma Caenorhabditis elegans'ta mitokondriyal inhibitörlerin etkilerinin in vivo tespiti ve potansiyel arttırıcı bileşiklerin tanımlanması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonu modüle eden bileşikler için ilaç kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS'de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.

İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Taze tümör homojenatlarında mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve elektron transfer kapasitesini değerlendirmek için pratik bir protokol ve analitik yaklaşım geliştirdik. Bu protokol, kanser başlangıç, ilerleme ve tedavi yanıtına katkıda bulunan çeşitli mitokondriyal işlevleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Protokol, bitkilerde triazol pestisitlerinin metabolitlerinin integral sitotoksisitesini değerlendirmek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.

Bitkilerde Tipik Triazol Pestisitlerin Metabolitlerinin Sitotoksisitesinin Değerlendirilmesi

Bu çalışma, respirometrik ve enzimatik testler yoluyla mitokondriyal fonksiyon üzerindeki ksenobiyotik etkileri incelemek için bir metodoloji sunmaktadır. Çeşitli türlerde elektron taşıma zinciri modülasyonunu inceleyerek, böcek vektörü kaynaklı hastalıklara karşı hedeflenen biyopestisit gelişimi için içgörüler sunar.

İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler

Keşfedin HepG2 hücrelerinde organoklor pestisitlerin mitokondriyal fonksiyona etkisini değerlendirmek için ATP seviyesi ve oksijen tüketimi ölçüm yöntemlerini. Bu protokol toksikolojik araştırmalarda metabolik bozuklukları anlamaya yardımcı olur.

Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol

Daha fazla video keşfet