Diyaliz, biyokimyada difüzyona dayalı molekülleri ayırmak için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu prosedürde, yarı geçirgen bir zar, boyuta bağlı olarak belirli moleküllerin hareketine izin verir. Bu yöntem, tuzdan arındırma olarak bilinen tamponun çıkarılmasına veya bir protein çözeltisinden tampon moleküllerinin veya iyonlarının değiştirilmesine uygulanabilir.
Bu video, genel bir prosedürle birlikte diyalizin ilkelerini kapsar. Ultrasantrifüjlemeyi takiben gradyan reaktiflerin uzaklaştırılması, bir membran proteini ekstraksiyonundan sonra deterjanın uzaklaştırılması ve çözelti ortamını değiştirerek proteinlerin sulandırılması dahil olmak üzere çeşitli diyaliz uygulamaları gözden geçirilmiştir.
Diyaliz, biyokimyada difüzyona dayalı molekülleri ayırmak için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu prosedürde, yarı geçirgen bir zar, boyuta bağlı olarak belirli moleküllerin hareketine izin verir. Bu yöntem, tuzdan arındırma olarak bilinen tamponun çıkarılmasına veya bir protein çözeltisinden tampon moleküllerinin veya iyonlarının değiştirilmesine uygulanabilir.
Bu video, genel bir prosedürle birlikte diyalizin ilkelerini kapsar. Ultrasantrifüjlemeyi takiben gradyan reaktiflerin uzaklaştırılması, bir membran proteini ekstraksiyonundan sonra deterjanın uzaklaştırılması ve çözelti ortamını değiştirerek proteinlerin sulandırılması dahil olmak üzere çeşitli diyaliz uygulamaları gözden geçirilmiştir.
Biyokimyasal numuneler tipik olarak, sonraki işleme ve analizi bozabilecek yüksek tampon konsantrasyonlarına sahiptir. Diyaliz, molekülleri difüzyona dayalı olarak ayırmak için kullanılan yaygın, ucuz bir tekniktir. Yöntem, boyuta bağlı olarak belirli bileşenlerin hareketine izin veren yarı geçirgen bir zar kullanır. Bu videoda diyaliz kavramları, genel bir prosedür ve biyokimyadaki bazı kullanımları gösterilecektir.
Diyalizin en önemli yönü, belirli bir boyutun altındaki moleküllerin geçmesine izin veren, moleküler ağırlık kesimi uygulayan gözeneklere sahip yarı geçirgen bir zardır. Örneğin, 10k'lık bir zar genellikle 10 kilodaltondan daha büyük molekülleri tutacaktır. Bununla birlikte, moleküler ağırlık kesimi ayrı veya kesin bir sınır değildir. Membran tipik olarak çok çeşitli gözenek boyutları içerir, bu nedenle kesmeye yakın moleküllerin küçük bir kısmı kaybolabilir.
Moleküler ağırlık kesimi, küresel proteinler kullanılarak tanımlandığından, DNA veya RNA gibi benzer kütleye sahip doğrusal moleküller kayabilir. Membranlar tipik olarak istenen molekülün moleküler ağırlığının yarısı ila üçte biri arasında seçilir.
Prosedürü gerçekleştirmek için, zarın içine bir numune yerleştirilir ve bu da diyalizat adı verilen büyük miktarda bir çözeltiye eklenir. Zamanla, daha büyük biyomoleküller içinde tutulurken, daha küçük moleküller numune ile diyalizat arasındaki zar boyunca serbestçe yayılır. Diyaliz yavaş ilerleyen bir süreçtir. Gece boyunca, hatta birden fazla gün boyunca çalışmasına izin vermek yaygındır.
Diyalizat saf su ise, genel tampon konsantrasyonu azalacaktır, bu da tuzdan arındırma olarak bilinen bir işlemdir. Çözelti başka küçük parçacıklar içeriyorsa, bazıları numuneye hareket edecek ve tampon değişimine yol açacaktır. Diyaliz bir denge süreci olduğundan, diyalizat küçük molekülleri daha fazla yer değiştirmek için birçok kez yenilenebilir. İşlem tamamlandıktan sonra, numune daha sonraki işlemler için yeniden toplanır.
Artık diyalizin temellerini gördüğünüze göre, genel bir prosedüre göz atalım.
Prosedüre başlamadan önce, zar diyalizat içinde önceden ıslatılır. Bu, kullanımı kolaylaştırır ve herhangi bir koruyucuyu ortadan kaldırır. Hazır olduğunda, numune tipik olarak bir şırınga ile toplanır ve daha sonra diyaliz kabına eklenir. Bu, çıplak boru olabilir veya bir kaset içinde bulunabilir. Numunenin membran ile yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak için diyaliz kurulumundan fazla hava çıkarılır. Kurulum daha sonra difüzyonu en üst düzeye çıkarmak için karıştırılarak diyalizat içine yerleştirilir. Karıştırmayı engellememek için yüzmelidir.
Numune ve diyalizat arasındaki dengeye ulaşıldığında diyalizat ilgili aralıklarla değiştirilir. Son değişiklikten sonra, reaksiyon tipik olarak gece boyunca çalışmaya bırakılır. Yeterli bir süre sonra, tamponsuz veya değiştirilen numune kasetten çıkarılır. Numune toplandıktan sonra, deneyin niteliğine bağlı olarak analiz edilebilir veya daha fazla işlenebilir.
Şimdi genel bir diyaliz prosedürüne baktığımıza göre, bu tekniğin biyokimyada kullanıldığı yollardan bazılarını görelim.
Yoğunluk gradyanları, karmaşık biyolojik numuneleri ayırmanın yaygın bir yoludur. Bu kavram, tipik olarak sakaroz veya sezyum klorür iyonları olan küçük parçacıklar üzerindeki dağılıma dayanır. Tamamlandıktan sonra, toplanan numune işlenmeden önce bu reaktiflerin tipik olarak çıkarılması gerekir. Diyaliz, saflaştırılmış numunenin gelecekteki analizler için kullanılmasını mümkün kılar.
Bazı proteinler, bir hücrenin lipid çift tabakası içinde bulunur ve genellikle lipozomlar olarak bilinen küresel lipid veziküllerine serpiştirilerek incelenir. Proteinler ve lipitler önce bir deterjanla ekstrakte edilir. Diyaliz, deterjanı yavaşça çıkarmak ve proteolipozomlar oluşturmak için kullanılabilir.
Saflaştırmadan sonra, bazı proteinler yanlış katlanır veya denatüre edilir, bu da işlevsellikte bir kayba yol açar. Yapıdaki bu değişikliklere neden olan bileşikler diyaliz ile uzaklaştırılabilir ve bu da işlevsel analitlerin yeniden oluşumuna yol açar.
Az önce JoVE'nin diyaliz hakkındaki videosunu izlediniz. Artık bu difüzyon tabanlı yöntemi, basit bir deneysel prosedürü ve bu tekniğin kullanımını anlamalısınız.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Diyaliz, biyokimyada difüzyona dayalı molekülleri ayırmak için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu prosedürde, yarı geçirgen bir zar, boyuta bağlı olarak belirli moleküllerin hareketine izin verir. Bu yöntem, tuzdan arındırma olarak bilinen tamponun çıkarılmasına veya bir protein çözeltisinden tampon moleküllerinin veya iyonlarının değiştirilmesine uygulanabilir.
Bu video, genel bir prosedürle birlikte diyalizin ilkelerini kapsar. Ultrasantrifüjlemeyi takiben gradyan reaktiflerin uzaklaştırılması, bir membran proteini ekstraksiyonundan sonra deterjanın uzaklaştırılması ve çözelti ortamını değiştirerek proteinlerin sulandırılması dahil olmak üzere çeşitli diyaliz uygulamaları gözden geçirilmiştir.
Biyokimyasal numuneler tipik olarak, sonraki işleme ve analizi bozabilecek yüksek tampon konsantrasyonlarına sahiptir. Diyaliz, molekülleri difüzyona dayalı olarak ayırmak için kullanılan yaygın, ucuz bir tekniktir. Yöntem, boyuta bağlı olarak belirli bileşenlerin hareketine izin veren yarı geçirgen bir zar kullanır. Bu videoda diyaliz kavramları, genel bir prosedür ve biyokimyadaki bazı kullanımları gösterilecektir.
Diyalizin en önemli yönü, belirli bir boyutun altındaki moleküllerin geçmesine izin veren, moleküler ağırlık kesimi uygulayan gözeneklere sahip yarı geçirgen bir zardır. Örneğin, 10k'lık bir zar genellikle 10 kilodaltondan daha büyük molekülleri tutacaktır. Bununla birlikte, moleküler ağırlık kesimi ayrı veya kesin bir sınır değildir. Membran tipik olarak çok çeşitli gözenek boyutları içerir, bu nedenle kesmeye yakın moleküllerin küçük bir kısmı kaybolabilir.
Moleküler ağırlık kesimi, küresel proteinler kullanılarak tanımlandığından, DNA veya RNA gibi benzer kütleye sahip doğrusal moleküller kayabilir. Membranlar tipik olarak istenen molekülün moleküler ağırlığının yarısı ila üçte biri arasında seçilir.
Prosedürü gerçekleştirmek için, zarın içine bir numune yerleştirilir ve bu da diyalizat adı verilen büyük miktarda bir çözeltiye eklenir. Zamanla, daha büyük biyomoleküller içinde tutulurken, daha küçük moleküller numune ile diyalizat arasındaki zar boyunca serbestçe yayılır. Diyaliz yavaş ilerleyen bir süreçtir. Gece boyunca, hatta birden fazla gün boyunca çalışmasına izin vermek yaygındır.
Diyalizat saf su ise, genel tampon konsantrasyonu azalacaktır, bu da tuzdan arındırma olarak bilinen bir işlemdir. Çözelti başka küçük parçacıklar içeriyorsa, bazıları numuneye hareket edecek ve tampon değişimine yol açacaktır. Diyaliz bir denge süreci olduğundan, diyalizat küçük molekülleri daha fazla yer değiştirmek için birçok kez yenilenebilir. İşlem tamamlandıktan sonra, numune daha sonraki işlemler için yeniden toplanır.
Artık diyalizin temellerini gördüğünüze göre, genel bir prosedüre göz atalım.
Prosedüre başlamadan önce, zar diyalizat içinde önceden ıslatılır. Bu, kullanımı kolaylaştırır ve herhangi bir koruyucuyu ortadan kaldırır. Hazır olduğunda, numune tipik olarak bir şırınga ile toplanır ve daha sonra diyaliz kabına eklenir. Bu, çıplak boru olabilir veya bir kaset içinde bulunabilir. Numunenin membran ile yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak için diyaliz kurulumundan fazla hava çıkarılır. Kurulum daha sonra difüzyonu en üst düzeye çıkarmak için karıştırılarak diyalizat içine yerleştirilir. Karıştırmayı engellememek için yüzmelidir.
Numune ve diyalizat arasındaki dengeye ulaşıldığında diyalizat ilgili aralıklarla değiştirilir. Son değişiklikten sonra, reaksiyon tipik olarak gece boyunca çalışmaya bırakılır. Yeterli bir süre sonra, tamponsuz veya değiştirilen numune kasetten çıkarılır. Numune toplandıktan sonra, deneyin niteliğine bağlı olarak analiz edilebilir veya daha fazla işlenebilir.
Şimdi genel bir diyaliz prosedürüne baktığımıza göre, bu tekniğin biyokimyada kullanıldığı yollardan bazılarını görelim.
Yoğunluk gradyanları, karmaşık biyolojik numuneleri ayırmanın yaygın bir yoludur. Bu kavram, tipik olarak sakaroz veya sezyum klorür iyonları olan küçük parçacıklar üzerindeki dağılıma dayanır. Tamamlandıktan sonra, toplanan numune işlenmeden önce bu reaktiflerin tipik olarak çıkarılması gerekir. Diyaliz, saflaştırılmış numunenin gelecekteki analizler için kullanılmasını mümkün kılar.
Bazı proteinler, bir hücrenin lipid çift tabakası içinde bulunur ve genellikle lipozomlar olarak bilinen küresel lipid veziküllerine serpiştirilerek incelenir. Proteinler ve lipitler önce bir deterjanla ekstrakte edilir. Diyaliz, deterjanı yavaşça çıkarmak ve proteolipozomlar oluşturmak için kullanılabilir.
Saflaştırmadan sonra, bazı proteinler yanlış katlanır veya denatüre edilir, bu da işlevsellikte bir kayba yol açar. Yapıdaki bu değişikliklere neden olan bileşikler diyaliz ile uzaklaştırılabilir ve bu da işlevsel analitlerin yeniden oluşumuna yol açar.
Az önce JoVE'nin diyaliz hakkındaki videosunu izlediniz. Artık bu difüzyon tabanlı yöntemi, basit bir deneysel prosedürü ve bu tekniğin kullanımını anlamalısınız.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Videos from this collection: