Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Bu biyo-tabaka interferometrisi veya BLI testinin genel amacı, saflaştırılmış hEAG1 iyon kanalı proteini ile küçük moleküllü lipitler arasındaki potansiyel etkileşimi ölçmektir. Bu yöntem, iyon kanalı farmakolojisi alanında, ilgilenilen küçük molekülün bu iyon kanalıyla doğrudan etkileşime girip giremeyeceği ve etkileşimin kinetiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, emek gerektirmeyen ve yüksek verimli bir yöntem olmasıdır.

Sadece az miktarda hareketsiz proteine ihtiyaç vardır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü başarılı bir tahlil, protein ekspresyonu, saflaştırma, etiketleme, doğru ayarlanmış sensör ve veri analizi dahil olmak üzere birden fazla adımı içerir. İki ila üç gün boyunca hEAG1'i eksprese eden HEK293 T hücrelerini kültürledikten sonra, büyüme ortamını çıkararak hücreleri hasat edin ve hücreleri iki kez yıkamak için dört mililitre PBS kullanın.

PBS'yi atın. Hücreleri tabak başına iki mililitre PBS'ye yerleştirin ve hücrelere 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 420 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı boşaltın ve peleti yeniden süspanse etmek için dört mililitre lizis tamponu kullanın. Süspansiyonu buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, her 10 dakikada bir lizatı iyice girdaplayın. Daha sonra, hücre lizatını 10 dakika boyunca 12.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve hemen kullanım için buz üzerinde tutun. Anti-FLAG M2 afinite reçinesini hazırlamak için, anti-FLAG M2 ffinity jel şişesinin tek tip bir jel boncuk süspansiyonu olduğundan emin olmak için reçineyi hafifçe ters çevirerek iyice askıya alın. Hemen 400 mikrolitre süspansiyonu soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından, süspansiyonu 30 saniye boyunca 8.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve depolama tamponunu yıkamak için süpernatanı dikkatlice atın. Reçine peletini yeniden süspanse etmek için, reçineye 500 mikrolitre protein özü süpernatant ekleyin ve süspansiyonu yeni, soğutulmuş, beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Kalan boncukları toplamak için orijinal tüpe 500 mikrolitre protein özü daha pipetleyin ve özü beş mililitrelik tüpe aktarın.

FLAG füzyon proteinini reçineye bağlamak için karışımı gece boyunca sekiz rpm ve dört santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Ardından, karışımı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede yerçekiminin 1.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 500 mikrolitre bir x PBS ile üç kez yıkayın.

Hemen kullanım için buz üzerinde tutun. Mikrolitre başına 200 nanogramlık bir nihai konsantrasyon için 390 mikrolitre PBS'ye 10 mikrolitre üç x FLAG elüsyon çözeltisi ekleyin. Ardından, önceden hazırlanmış jel boncuklara 400 mikrolitre üç x FLAG elüsyon çözeltisi ekleyin.

Numuneyi çalkalanan bir inkübatörde sekiz rpm'de ve dört santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Daha sonra reçineyi 30 saniye boyunca yerçekiminin 8000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hemen kullanım için dört santigrat derecede saklayın.

Saflaştırılmış proteinin konsantrasyonunu belirlemek için üreticinin talimatlarına göre BCA protein tahlilini kullanın. Daha sonra, ilgilenilen proteinin saflaştırıldığını doğrulamak için bir anti-Flag antikoru ile Western Blot analizi için 30 mikrolitrelik bir numune kullanın. Saflaştırılmış proteini biyotin ile etiketlemek için, PBS'de mililitre biyotin stok çözeltisi başına beş miligram hazırlayın.

İki biyosensörün her bir testi için, PBS'de saflaştırılmış proteinin tercih edilen bir N-terminal biyotinilasyonunu elde etmek için 20 mikrogram saflaştırılmış proteine üç kat molar fazla biyotin ekleyin. Numuneyi karanlıkta buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. Bağlanmamış biyotini ve tamponu çıkarmak için, proteini SD tamponuna değiştirin.

Proteini, 30 kilodaltonluk bir moleküler kesim ile bir ultrafiltrasyon cihazına aktarın. Ardından, SD tamponu ekleyin ve numuneyi 12.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ultrafiltratı santrifüj tüpünden çıkarın.

Filtre cihazına 200 mikrolitre SD tampon ekleyin ve numuneyi tekrar santrifüjleyin. İşlemi en az üç kez tekrarlayın. Filtrasyon cihazını çevirerek tampon değişimi yapılan numuneyi toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Numuneyi beş dakika boyunca 2.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Numuneyi hemen kullanım için buz üzerinde tutun. BLI testini gerçekleştirmek için, çalışmadan 30 dakika önce, cihazı açarak ekipmanı önceden ısıtın.

Başlamadan önce makinenin hazır durumda olduğunu doğrulamak için cihaz durumu penceresini kontrol edin. Veri toplama yazılımını açmadan önce cihazın kapısının kapalı olduğundan emin olun ve deney sihirbazında Yeni Kinetik Deneyi'ni seçin. Tamponu, yükü ve numuneyi seçmek için sağ tıklayarak 96 kuyulu plaka üzerinde kullanılacak kuyuları tanımlayın.

Numune kuyucukları için, PIP2 konsantrasyon birimi molar olarak girilmelidir. Test adımlarını tanımlamak için bir adım seçin ve ilgili sütuna çift tıklayın. Kontrol sensörleri için tahlil tanımının bir kopyası ayarlanır.

rpm'yi 1.000 olarak ayarlayın. Temel adım için bir dakika ve yükleme, ilişkilendirme ve ayrıştırma için sırasıyla beş ila 10 dakika seçin. Testi oda sıcaklığında gerçekleştirin.

Sensörleri içeren sütunları tıklatın ve sensör tepsisindeki algılayıcıların konumunu belirtmek için doldur'u tıklatın. Hataları kontrol etmek ve düzeltmek için geri dönmek için planlanan tüm adımları gözden geçirin. BLI testinin tüm işleyişinde, planlanan tüm adımların gözden geçirilmesi adımı araştırmacı tarafından ihmal edilebilir.

Ancak, planlanan tüm adımların doğru olup olmadığını kontrol etmek çok önemlidir. Veri dosyalarının konumunu ayarlayın ve tahlili başlatmak için git'e tıklayın. Tahlili çalıştırın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin.

Bir HEK293 T hücresinde bu yama kelepçesi deneyinde görüldüğü gibi, hEAG1'i kararlı bir şekilde ifade eden, voltaja bağlı dışa doğru potasyum akımları, fonksiyonel hEAG1 kanallarının hücrelerde yüksek oranda eksprese edildiğini göstermektedir. Anti-FLAG antikorunu kullanarak, saflaştırılmış protein örneklerinden elde edilen bu Western Blot of hEAG1, saflaştırılmış proteinin kalitesini ve özgüllüğünü gösterir. Saflaştırılmış kanal proteini, gerçek zamanlı BLI testi kullanılarak lipid PIP2 ile bir etkileşim testi gerçekleştirmek için biyotinile edildi.

hEAG1 ve PIP2 arasındaki tipik bir bağlanma eğrisi burada gösterilmiştir. hEAG1, konsantrasyona bağlı bir şekilde PIP2'ye bağlıdır. Birikmiş PIP2 konsantrasyonları, biyosensörün veri izlerine karşılık gelir.

Bu temsili tahlil, farklı PIP2 konsantrasyonlarında optik girişimdeki değişiklikleri gösterir. Son olarak, farklı PIP2 konsantrasyonlarında ölçülen optik girişim sinyalinin tepe değerinden Hill denklemi ile uyumlu bir eğri elde edilmiş ve hEAG1 ile PIP2 arasındaki denge ayrışma sabitleri belirlenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık bir saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürün doğru olduğundan emin olmak için planlanan tüm adımları gözden geçirmeyi unutmamak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, küçük molekülü bağladıktan sonra bu iyon kanalının işlevini belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak için yama kelepçesi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, iyon kanallarının ligand taraması alanındaki araştırmacıların, iyon kanalı ilaç keşfinde yeni ligandları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, BLI yöntemi ile iyon kanalı proteininin nasıl hazırlanacağını ve küçük moleküllerle etkileşiminin nasıl test edileceğini iyi anlamış olmalısınız.