4.10: Fotometrik Protein Tayini

Konsantrasyonun ölçülmesi, birçok biyokimyasal analizin temel bir adımıdır. Fotometrik protein tayini, bir numune ne kadar çok ışık emici madde içerirse, ışığın içinden o kadar az geçeceği gerçeğinden yararlanır. Konsantrasyon ve absorpsiyon arasındaki ilişki doğrusal olduğundan, bu fenomen, bilinmediği numunelerdeki konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.

Bu videoda fotometrik protein tayininin temelleri açıklanmakta ve Bradford Deneyi ile Lowry Metodu tanıtılmaktadır. Videodaki prosedür tipik bir Bradford testini kapsayacaktır. Kapsanan uygulamalar arasında, konsantrasyon ve saflığı karakterize etmek için çok küçük hacimlerde nükleik asitlerin doğrudan ölçümü, bir biyomimetik malzemenin birleştirme verimliliğinin belirlenmesi ve Remazol boyası kullanılarak fotometrik protein tayininin başka bir varyasyonu yer alır.

Numunelerdeki bir proteinin konsantrasyonunun belirlenmesi, birçok biyokimyasal analizde temel bir adımdır. Fotometrik belirleme küçük numune boyutları ile yapılabilir. Bir numune ne kadar çok ışık emici madde içeriyorsa, ışık içinden o kadar az geçecektir. Bu, emici maddelerin kantitatif bir ölçümünü sağlar. Bu kavramlar bilim için o kadar temeldir ki, tekniklerden ikisini tanıtan makaleler tüm zamanların en çok alıntı yapılan üç makalesinde yer almaktadır. Bu video, en yaygın fotometrik protein belirleme tekniklerinden bazılarının arkasındaki kavramları, bunların nasıl gerçekleştirildiğini ve toplanan verilerin nasıl analiz edildiğini gösterecektir.

Fotometrik protein tayini, konsantrasyon ve ışık emiciliği arasındaki ilişkiye dayanmaktadır. Bu, ışığı emen bir türün konsantrasyonunun absorbansı ile orantılı olduğunu belirten Beer-Lambert Yasası olarak bilinir.

Bu ilke, tüm fotometrik protein belirleme yöntemlerinin temelini oluşturur.

Doğrudan absorpsiyon analizi için, değiştirilmemiş protein numunelerinin absorbans değerleri ölçülür. Aromatik yan zincirleri nedeniyle, triptofan ve tirozin kalıntıları, 280 nm dalga boyunda en yüksek absorbans okumalarını verir.

Bununla birlikte, proteinlerde en az bulunan iki amino asit, her proteinde farklı miktarlarda bulunur, bu nedenle her belirleme benzersizdir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu amino asitlere bağımlı olmayan daha karmaşık tahliller geliştirilmiştir.

Bir örnek, numuneye renkli boyanın eklendiği Bradford Testi'dir. Coomassie Blue olarak bilinen boya, orantılı olarak yanıt verir - ne kadar fazla protein varsa, boya ile o kadar fazla bağlanma olayı olur.

Daha sonra, protein konsantrasyonu, 594 nm'de ışığı emen bağlı Coomassie Blue boyasının absorbansı ölçülerek belirlenir. Bununla birlikte, Bradford testi kısa bir konsantrasyon aralığında doğrusaldır, bu nedenle analizden önce genellikle seyreltmeler gereklidir.

Lowry Yöntemi, peptit bağlarıyla reaksiyona giren alkali bir bakır iyonu çözeltisi olan Biuret reaktifini ve aromatik protein kalıntılarını oksitleyen Folin-Ciocłteu reaktifini birleştirir. Numunenin ortaya çıkan renk değişimi, protein konsantrasyonu ile orantılıdır.

İndirgenmiş Folin reaktifinin emilimi 750 nm'de belirlenebilir. Doğrudan absorpsiyon gibi, her proteinin benzersiz bir tepkisi vardır ve ilgilenilen protein için kalibre edilmesi gerekir. Artık en yaygın tahlillerden bazılarının arkasındaki temel ilkeleri gözden geçirdiğimize göre, doğrudan absorpsiyon ve Bradford tahlilinin nasıl yapıldığına bakalım.

Doğrudan absorpsiyon analizine başlamak için, spektrofotometre sıfır absorbansı belirlemek için bir boşluk ile kalibre edilir. Kalibrasyon eğrisinin oluşturulmasında kullanılmak üzere standart çözeltiler hazırlanır. Daha sonra, birinci standardın bir alikotu bir küvete eklenir ve spektrofotometreye yerleştirilir.

280 nm'deki absorbans değeri daha sonra kaydedilir. Bu işlem, her çalışma için temiz bir küvet kullanılarak her standart için tekrarlanır. Tamamlandığında, absorbansa karşı konsantrasyon çizilerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Bu çizginin eğimi, absorbansı konsantrasyonla ilişkilendiren molar zayıflama katsayısıdır.

Daha sonra, bilinmeyen numune bir küvete eklenir ve absorbans değeri kaydedilir. Farklı fotometrik belirleme yöntemleri için veri analizi benzer olduğundan, Bradford testine baktıktan sonra bunu ele alacağız.

Burada, Bradford protein testi, 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir BSA standardı ile gerçekleştirilir. Başlangıç olarak, BSA stok çözümleri hazırlanır.

Bilinmeyen çözeltiler, konsantrasyonların tahlil aralığında olduğundan emin olmak için deiyonize su ile seyreltilir. Kite bağlı olarak, Coomassie boyasının seyreltilmesi de gerekebilir. Daha sonra, 96 oyuklu plakaya BSA standartları eklenerek kalibrasyon eğrisi oluşturulur.

Standart bir eğri oluşturmak için gerekli konsantrasyona ulaşmak için deiyonize su eklenir. Doğru bir ölçümün alındığından emin olmak için bilinmeyen numune plakaya üç nüsha halinde eklenmelidir. Coomassie boyası daha sonra pipetle karıştırılarak her bir oyuğa eklenir.

Deiyonize su, emiciliği ölçmek için boş bir kuyuya boş olarak eklenir. Boyanın bağlanması için 5 dakika bekledikten sonra, absorbans 590 nm'de bir plaka okuyucuda ölçülür.

Şimdi birkaç tahlil yaptığımıza göre, verileri nasıl analiz edeceğimize bakalım. Her fotometrik protein belirleme yöntemi, Beer-Lambert Yasasına dayanmaktadır.

Standartların ölçülen absorbansı, daha sonra bilinmeyen numunelerin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılır. Bu eğri manuel olarak çizilebilir, ancak daha yeni spektrofotometrik araçlar, tüm standartlar ölçüldükten sonra kalibrasyon eğrisini oluşturacaktır. Bu sistemler, bilinmeyen numuneler analiz edilirken protein konsantrasyonunu da hesaplayacaktır.

Fotometrik protein belirleme verilerinin nasıl analiz edileceğini gözden geçirdiğimize göre, bu prosedürlerin kullanıldığı bazı yollara bakalım.

Fotometrik protein tayininin ilkeleri, nükleik asit konsantrasyonunu doğrudan ölçmek için de kullanılabilir. Nanodrop spektrofotometresi, optik olarak aktif bir kaide üzerine çok küçük hacimli numuneleri kabul eder. Absorbans daha sonra ölçülür ve sistem otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonunu belirler. Proteinler ve diğer kaynaklar ölçümlerle çakışabileceğinden, numune saflığı 260 ila 280 nm ve 260 ila 230 nm absorbans oranları analiz edilerek belirlenir. Saf nükleik asitler tipik olarak DNA ve RNA için sırasıyla yaklaşık 1.8 ve yaklaşık 2.0 oranları verir.

Fotometrik protein tayini, belirli hücresel tepkileri ortaya çıkarmak için doğadan ilham alan biyomimetik malzemelerin üretiminde de kullanılabilir. Rekombinant adezinler, konakçı hücrelere bakteri bağlanmasını simüle etmek için polistiren boncuklara bağlanır. Bradford testi, biyomimetik malzemenin üretiminde boncuklara rekombinant yapışmanın birleştirme verimliliğini belirlemek için kullanılır.

Alternatif fotometrik protein tahlilleri, protein antimikrobiyallerinin tespiti ve karakterizasyonunda kullanılabilir. Remazol parlak mavi R boyası, ısıyla öldürülen bakterilere kovalent olarak bağlanır. Antimikrobiyal protein, boyalı çözelti içinde inkübe edilir. Daha sonra numune santrifüjlenir ve süpernatantın 595 nm'deki emilimi bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak ölçülür. Etiketli bakterilerden süpernata salınan çözünür boya ile artan absorbans, enzimatik aktivitenin kantitatif bir ölçümüdür.

Az önce JoVE'nin fotometrik protein tayini ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, fotometrik belirlemenin altında yatan ilkeleri açıkladı, bazı yaygın tahliller için genel prosedürleri gözden geçirdi ve tekniklerdeki bazı yeni gelişmeleri kapsıyordu. İzlediğiniz için teşekkürler!