Tandem Kütle Spektrometresi

Tandem kütle spektrometresi, önce bir biyomolekülü izole etmek ve daha sonra kimyasal yapısının yönlerini belirlemek için kütle spektrometrisinin birden fazla aşamasını birbirine bağlar. Biyomoleküller büyük, karmaşık yapılara sahiptir ve bu da moleküler bileşimlerini belirlemeyi zorlaştırır. Tandem kütle spektrometresi, daha sonra birden fazla alt birime ayrılan bir ilgilenilen molekülü seçer, bu da tanımlanmasını ve sırasını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Bu video, tandem kütle spektrometresi, genel bir prosedür ve biyokimyadaki bazı kullanımları kavramlarını gösterecektir.

Tandem kütle spektrometresi, tipik bir kütle spesifikasyon cihazı olarak başlar: numuneyi iyonlara dönüştüren bir iyon kaynağı ve iyonları kütle-yük oranlarına göre ayıran bir kütle analizörü ile. Yaygın bir kütle analizörü olan dört kutuplu, yalnızca belirli bir orana sahip iyonların geçmesine izin verirken, diğerleri aparatın çubuklarına çarpar. Öncü iyon olarak adlandırılan, geçmesine izin verilen tür, ilgilenilen biyomoleküldür. İyon, iyonu öngörülebilir bir düzende parçalamak için enerjinin uygulandığı, tipik olarak başka bir dört kutuplu olan bir çarpışma hücresine hareket eder.

Bu fragmanlar, bu “ürün iyonlarını” ayıran uçuş süresi gibi başka bir kütle analizörüne taşınır. Ürün iyonları daha sonra normal bir MS cihazında olduğu gibi dedektöre gönderilir. Bilinmeyen bir protein söz konusu olduğunda, ortaya çıkan spektrum çok sayıda örtüşen parça içerir ve bu da biyomolekülün kesin bir tam dizisinin oluşturulmasını zorlaştırır. Bununla birlikte, spektral model, belirli bir protein için benzersizdir. Analiz yazılımı, spektrumu bilinen peptit dizilerinin bir veritabanıyla karşılaştırır ve bilinmeyen proteini üst üste binen parçalardan aydınlatır.

Numuneye ve istenen parçalanma derecesine bağlı olarak, çoklu parçalanma yöntemleri mümkündür. Parçalanma modelleri, enerjinin nasıl aktarıldığına, miktarına ve öncü iyon boyunca nasıl dağıtıldığına bağlıdır. Enerji, nötr parçacıklar, radyasyon veya elektronlar yoluyla aktarılabilir. Nötr atomların kullanılması, çarpışma kaynaklı ayrışma veya CID adı verilen bir işlem, öncelikle amino asitler arasındaki peptit bağını parçalar, bunların tanımlanması için idealdir.

Artık tekniğin temelleri ele alındığına göre, bakteri hücre zarflarının bir bileşenini incelemek için kullanılan CID tandem kütle spektrometresine bakalım.

Tüm kütle spektrometrik deneylerinde olduğu gibi, ilk adım numuneyi iyonize etmektir. Biyomoleküller için bu tipik olarak matris destekli lazer desorpsiyonu veya elektrosprey iyonizasyonu ile yapılır. Öncü iyon sinyali daha sonra iyon optiğinin ayarlanmasıyla optimize edilir. Yapıldıktan sonra hedef izole edilir ve CID gibi parçalanma yöntemi seçilir.

Öncü iyonu çarpışma hücresine hızlandıran uygulanan bir voltajın gücü, parçalanma derecesini etkiler. Bu voltaj, öncü, en yüksek ürün iyonuna kıyasla kabaca %10 bolluk olana kadar artırılır. Yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde edilene kadar çoklu spektrumlar elde edilir ve ortalaması alınır. İhtiyaç duyulan tarama sayısı, orijinal öncü iyonun sinyal yoğunluğuna bağlıdır ve 3 ila 300 arasında değişebilir.

Bu örnekteki analit, Escherichia coli K-12’den lipid A, CID’den sonra 19 ana fragmana sahipti. Lipid A’nın genel yapısı iyi bilinmektedir ve yazılımın numuneden spesifik bileşimi yeniden oluşturmasına izin verir.

Şimdi prosedürü incelediğimize göre, tandem kütle spektrometresinin biyokimyada kullanıldığı bazı yollara bakalım.

Tandem kütle spektrometrisinde yaygın bir tarama modu, seçilen reaksiyon izleme veya SRM’dir. SRM’de, her iki kütle analizörü de belirli öncü ve ürün iyonlarına odaklanarak seçilen bir kütle-yük oranına sabitlenir. SRM’nin yüksek hassasiyet derecesi nedeniyle, bilinen konsantrasyondaki peptit standartlarının spektrumları kullanılabilir ve bilinmeyen numunelerinkiyle karşılaştırılabilir, bu da ilgilenilen proteinlerin ölçülmesine izin verir.

Proteinler genellikle translasyondan sonra, tipik olarak metil grupları, fosfat grupları veya glikanlar olarak bilinen şekerler gibi fonksiyonel grupların eklenmesiyle modifiye edilir. Bunlar, hücrelerin birbirleriyle nasıl iletişim kurduğunu aydınlatan hücre sinyalleme süreçlerinde önemlidir. Tandem kütle spektrometresi proteinleri daha küçük bileşenlere ayırdığından, PTM’nin spesifik fragmana veya hatta bir amino aside olan konumunu belirlemek mümkündür. Asetilasyon ve trimetilasyon gibi bazı modifikasyonların tek başına kütle ile ayırt edilmesi zordur, bu nedenle kromatografik ayırma kütle spektrometresinden önce gerçekleştirilir.

Hastanın kanındaki birçok analit, tipik kütle spektrometresi için tespit sınırının altındaki konsantrasyonlarda bulunur. SRM’nin bir diğer avantajı, bir ürün iyonu hariç tüm ürün iyonlarını atması, hassasiyeti artırması ve alt tespit sınırını 100 kata kadar artırmasıdır. Bu örnekte, immünosupresan ilaç olan takrolimus 1 ng/mL seviyelerinde tespit edilebilir.

Az önce JoVE’nin tandem kütle spektrometresi ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, enstrümanın teorisini tanımladı, genel bir prosedürün üzerinden geçti ve tekniğin şu anda kullanılmakta olduğu bazı yolları açıkladı. İzlediğiniz için teşekkürler!