Nicel gıda alımı deneyleri birleştirerek ve zorla iştah Drosophila içinde çalışmaya nöronların aktive

Bu prosedürün genel amacı, nöronların termogenetik ve optogenetik aktivasyonları gibi genetik manipülasyonların etkilerini değerlendirmek için bir araç sağlayan yetişkin Drosophila'nın gıda alımını kantitatif olarak ölçmektir. Bu önlemler, açlık, tokluk ve iştahın nöromekaniği gibi beslenme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birden fazla sinek grubunun gıda alımını aynı anda ölçmesi ve genetik taramalarda anormal şekilde beslenen sinekleri tanımlamayı özellikle yararlı hale getirmesidir.

Başlamak için, dış kabı hazırlamak için malzemeleri toplayın. 0.5 gram agaroz ve 50 mililitre çift damıtılmış suyu askıya alın. Sık sık çalkalama ile ısıtın ve bir ısı plakalı manyetik bir karıştırıcı üzerinde tamamen çözünmesi için kaynatın.

% 1 agaroz yaklaşık 60 santigrat dereceye kadar soğuduğunda, beş mililitreyi boş bir dış kaba aktarın ve bir agaroz pedi elde etmek için agaroz oda sıcaklığına soğuyana kadar kabı açık tutun. Daha sonra, 50 mililitre çift damıtılmış suya 0.5 gram agaroz ekleyin. Sık sık çalkalama ile ısıtın ve bir ısı plakalı manyetik bir karıştırıcı üzerinde tamamen çözünmesi için kaynatın.

% 1 agaroz yaklaşık 60 santigrat dereceye soğuduğunda, 100 milimol sükroz elde etmek için agaroza 1.71 gram sükroz ekleyin. Boyalı etiketli gıda hacmi başına% 0.5 ağırlık elde etmek için agaroz çözeltisine 0.25 gram mavi boya ekleyin. Ardından iç kabı hazırlayın.

Boş iç kapları düz bir yatay yüzeye koyun. Daha sonra 750 mikrolitre mavi boya etiketli yiyecekleri ayrı ayrı yiyecek kaplarına ekleyin. En az beş dakika katılaşmasına izin verin.

Doldurulmuş bir iç kabı hazırlanmış bir dış kaba aktarın ve agaroz pedinin ortasına yerleştirin. Arka planda çıkarma için boya içermeyen yiyeceklerle besleme odaları hazırlayın. Besleme odalarını oda sıcaklığında, dış kabın duvarında yoğuşma kalmayana kadar 40 dakika açık bırakın.

Davranışsal deneylerden önce, sıcaklığın besleme odalarında nispeten eşit olmasını sağlamak için hazırlanan besleme odalarını iki saat boyunca 30 santigrat derece deneysel sıcaklıkta dengeleyin. Besleme işlemini başlatmak için, 20 sineği ev şişelerinden hafifçe vurarak önceden ısıtılmış bir besleme odasına dikkatlice aktarın. Besleme işlemine 30 santigrat derecede 60 dakika devam edin.

Besleme odalarını eksi 80 santigrat derecede 30 dakika dondurarak beslemeyi durdurun. Bir şişeden 20 sineği hafifçe vurarak dikkatlice bir besleme odasına aktarın. Ardından odayı aydınlatma kurulumunun üzerine yanlamasına yerleştirin.

Optogenetik manipülasyon için, ışık stimülasyonu kaynağı olarak bir dizi turuncu LED kullanın ve aydınlatma sırasında besleme odalarını desteklemek için LED'lerin üzerine yatay bir pleksiglas plaka sabitleyin. Kurulumu %60 nem ile 25 santigrat derecede bir inkübatörde tutun. Taotie-GAL4 UAS CsChrimson sineklerine paralel olarak genetik kontrol sineklerini uyarın, ancak farklı besleme odalarında.

Turuncu ışıkla arkadan aydınlatma ile 60 dakika boyunca besleme işlemine devam edin. Daha sonra besleme odalarını eksi 80 santigrat derecede 30 dakika dondurun. Beslemeyi durdurduktan sonra, besleme haznesindeki 20 sineğin tamamını bir tartı kağıdına dökün.

Daha sonra yumuşak bir fırça kullanarak 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpe 500 mikrolitre PBST ekleyin ve beş saniye boyunca 60 hertz'de bir öğütme değirmeni kullanarak sinekleri homojenize edin. Ardından, vücut parçalarının tespit edilebilir parçaları olmadığında gözlem yaparak yeterli homojenizasyonu onaylayın.

Kalıntıları temizlemek için tüpleri homojenatlarla 1300 RPM'de 30 dakika döndürün. Santrifüjlemeden sonra, 100 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Döküntülerin neden olduğu emicilerin yanlış hesaplanmasını önlemek için, kullanılan tüpü nazikçe santrifüjden çıkarın ve paleti bozmadan süpernatanı dikkatlice bırakın.

Tüm numuneler yüklendikten sonra, numunelerin emicilerini 630 nanometrede ölçmek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. Beslenme tepkisi, bağırsakta tespit edilebilir boya ile sineklerin görsel olarak incelenmesi ve puanlanmasıyla ölçüldü. Taotie nöronlarının aktivasyonundan sonra, Taotie dTRPA1 sineklerinin yaklaşık% 58'i güçlü beslenme davranışları sergiledi.

Bunların %23'ü ise hafif beslenme davranışları gösterdi. TRPA1 tarafından akut aktive edilmiş Taotie-GAL4 nöronları, gıda alımını önemli ölçüde artırdı, bu da Taotie-GAL4 etiketli nöronların yetişkin Drosophila'nın gıda alımının düzenlenmesine katıldığını düşündürdü. Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin Drosophila melanogaster'de beslenme kontrolünün nöro mekanizmalarını araştırmak için nöronların aktivitesini manipüle ettikten sonra gıda alım miktarını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.