X-ışını arasında çapraz karışma araştırmak için bir ortak kültür yöntemi Caco-2 hücreleri ve PBMC radyasyona maruz

Bu kokültür protokolünün genel amacı, periferik kan mononükleer hücrelerinin varlığında veya yokluğunda iyonlaştırıcı radyasyonun Caco-2 epitel hücresi tek tabaka geçirgenliği ve sıkı bağlantı fonksiyonu üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi ve radyoimmünoterapi alanlarında iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma ve bağışıklık hücresi fonksiyonları arasındaki olası sinerjik etkiler hakkındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, farklı uyaranların ve hücre popülasyonunun test edilebilmesi ve özel amaçlı tamamlayıcı ölçümler yoluyla birbirinden bağımsız fenomenlerin gözlemlenebilmesidir.

Radyasyon prosedürleri, hastada radyoterapide olduğu gibi, tümör hacminin uygun ışın ve doğru dozimetri ile ışınlanması nedeniyle Caco-2 hücre tek tabakasını ele almayı amaçlar. Işınlamadan bir hafta önce, tohumlamadan bir hafta önce, iki mililitre tam ortamda, altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında oyuk başına bir steril, bir mikrometre gözenek çapında hücre kültürü ekine beş kez 10 ila beşinci Caco-2 hücresi tohumlanır. Her bir oyuğun alt bölmesine üç mililitre taze tam ortam ekleyin ve hücreleri yedi gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 Co2'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kuluçka işleminin son gününde, 50 mililitrelik konik bir tüpe 25 mililitre Ficoll ekleyin. Ve 25 mililitre taze toplanmış tam kanı Ficoll'un üzerine dikkatlice yerleştirin. Hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın.

Ve arayüzdeki periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'yi yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Daha sonra izole edilmiş PBMC'yi iki adet 10 mililitrelik PBS yıkamada yıkayın. Ve PBMC'yi hücre kültürü inkübatöründe üç ila beş saatten fazla olmamak üzere taze tam ortamda kültürleyin.

Foton x-ışını enerjisini altı megavoltluk bir tepe noktasına ayarlayın. Ve Caco-2 hücre kültürünü, x-ışınlarının yörüngesi içinde ve radyasyon kaynağından 100 santimetre uzakta 1.4 santimetre kalınlığında bir pleksiglas levha üzerine yerleştirin. Ardından, geri saçılan radyasyon bileşeninin ve yüklü parçacıkların dengesini garanti etmek için her numuneye 0,57 santimetre kalınlığında bir bolus yerleştirin.

Hücreleri ışınlamak için düz ve simetrik 20 x 20 santimetre kare radyasyon alanı ve dakikada üç gri doz oranı kullanın. Caco-2 hücresinin metabolik aktivitesini ve canlılığını değerlendirmek için, 1.25 mililitre tam ortamda ışınlanmadan 24 saat önce 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 10 ila beşinci Caco-2 hücresine iki kez tohumlayın. Daha sonra hücreleri 21 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Ertesi gün, her bir kuyucuğa mililitre MTT çözeltisi başına 100 mikrolitre beş miligram ekleyin ve hücreleri üç saat daha inkübe edin. Hücreleri bir mililitre PBS ile yıkadıktan sonra, Caco-2 hücreleri tarafından salınan formazan kristallerini çözmek için her bir oyuğa 500 mikrolitre dimetil sülfoksit ekleyin ve 570 nanometrelik bir lambda'da çok kuyulu bir plaka okuyucu ile absorbasyonu değerlendirin. Caco-2 hücre canlılığını değerlendirmek için, hücreleri kuyu başına bir mililitre PBS ile yıkayın, ardından hücrelerin 100 mikrolitre Tripsin-EDTA çözeltisi ile 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de iki dakika boyunca ayrılmasını izleyin.

500 mikrolitre tam ortam ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüjleme için ayrı ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Peletleri tüp başına 50 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve elde edilen hücre süspansiyonlarını eşit hacimde Tripan Mavisi canlılık boya çözeltisi ile karıştırın. Oda sıcaklığında üç dakika sonra, hemositometredeki canlı lekelenmemiş ve cansız lekeli hücrelerin sayısını sayın.

Caco-2 hücrelerinin transepitelyal elektrik direncini veya TEER'sini değerlendirmek için, ışınlama transferinden hemen sonra Caco-2 hücre kültürünün yarısı, her bir oyukta üç mililitre taze tam ortam içeren yeni bir plakaya yerleştirilir ve ekleme kültürlerinin yarısı, oyuk başına üç mililitre tam ortam başına iki kez 10 ila altıncı PBMC ile tohumlanmış yeni bir plakaya yerleştirilir. Ardından, hücre kültürü ekine ilk altı saat boyunca her saat başı ve ardından ışınlamadan 48 saat sonrasına kadar her üç saatte bir bir TEER çubuk elektrodu yerleştirin. Western blot analizi için, ışınlamadan 48 saat sonra Caco-2 hücreleri ve PBMC bir kez 40 mikrolitre ile hücre lizis tamponunun 10 ila altıncı hücresine çarpılır.

Caco-2 hücrelerini parçalarken ve sıyırırken, gözenekli zarı ek parçadan ayırmamaya dikkat edin, bu da hücre lizatı kaybına ve önyargılı bir sonuca neden olabilir. Parçalanmış hücre örneklerini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Biskinkoninik asit yöntemi ile her bir hücre lizis numunesindeki toplam protein miktarını ölçtükten sonra, ayrı mikrosantrifüj tüplerindeki her bir toplam protein numunesine eşit hacimlerde beta-merkaptoetanol ile takviye edilmiş Laemmli numune tamponu ekleyin.

Numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Daha sonra denatüre proteinleri santrifüjleme ile toplayın ve her numuneden eşit toplam protein hacimlerini dört ila %20'lik bir prekast jel içinde yükleyin. Numuneleri 120 voltta bir saat çalıştırın.

Daha sonra proteinleri bir poliviniliden florür membranına aktarmak için yarı kuru bir elektrik transfer sistemi kullanın. Daha sonra zarı bir kaba koyun ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca hafif çalkalama ile% 0.2 Tween 20 ile desteklenmiş PBS'de% 5 yağsız kuru sütle bloke edin. Bloke edici inkübasyonun sonunda, membranı yıkama başına beş dakika boyunca 10 mililitre% 0.2 PBS Tween 20 ile üç kez yıkayın ve membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun primer antikorlarla hafifçe çalkalayarak etiketleyin.

Hafif çalkalama ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübasyondan sonra, zarı gösterildiği gibi% 0.2 PBS Tween 20 ile üç kez yıkayın ve zarı uygun yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. Üç PBS yıkamasından sonra, membranı gelişmiş bir kemilüminesan solüsyon kiti ile inkübe edin. Daha sonra elde edilen filmi uygun bir tarama sistemi ile görüntüleyin ve sonuçları uygun bir görüntü analiz programı ile ölçün.

10 griye kadar ışınlama, ışınlamadan 24 veya 48 saat sonra Caco-2 hücre metabolik aktivitesini değiştirmez, ancak hücre canlılığı her iki dozda da zamanla azalır. İki gri ışınlamaya maruz kaldıktan sonra kokültüre edilmemiş Caco-2 hücrelerinin TEER değerlendirmesi, ışınlamadan 48 saat sonrasına kadar tutarlı TEER değerleri ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, 10 gri ışınlamadan sonra, hücreler ışınlamadan üç saat sonra başlayarak TEER'de uzun süreli bir azalma gösterir.

PBMC'lerle kokültür, her iki dozda ışınlamadan üç saat sonrasından ışınlamadan 30 saat sonrasına kadar belirgin olan TEER'de bir azalmaya neden olur, bu noktada TEER değerlerinin nispeten tutarlı kaldığı görülmektedir. Sıkı bağlantı proteinlerinin Western blot analizi, ışınlama ve/veya PBMC kokültürüne yanıt olarak Claudin-1 veya Occludin ekspresyonunda hiçbir fark göstermezken, çeşitli iskele proteinlerinde büyük dalgalanmalar gözlenir. Ayrıca, NF-kappa B toplam proteini her iki ışınlama dozunda da etkilenmezken, XIAP protein seviyeleri her iki dozda da dört kat yukarı regüle edilir.

Bu prosedürü kullanarak, farklı biyolojik uyaranların iyi tek tabakanın iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmasına tepkisini nasıl değiştirebileceğine dair ek soruları yanıtlamak için Enterobacteria gibi diğer biyolojik uyaranlar eklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, iyonlaştırıcı radyasyonun ve bağışıklık hücrelerinin Caco-2 hücre geçirgenliği ve sıkı bağlantı kompleksi ekspresyonu üzerindeki etkisinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.