4.3: MALDI-TOF Kütle Spektrometresi

Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI), biyomoleküllerin analizi için ideal olan bir kütle spektrometresi iyon kaynağıdır. Gaz halindeki iyonlaştırıcı bileşikler yerine, numuneler bir lazer tarafından vurulan bir matris içine gömülür. Matris enerjinin çoğunu emer; Bu enerjinin bir kısmı daha sonra numuneye aktarılır ve sonuç olarak iyonize olur. Numune iyonları daha sonra bir uçuş süresi analizörü (TOF) kullanılarak tanımlanabilir.

Bu video, matris seçimi ve TOF'un kütle-yük oranlarını açıklamak için nasıl kullanıldığı dahil olmak üzere MALDI-TOF ilkelerini kapsar. Bu prosedür, bir MALDI plakasının hazırlanmasını, numunelerin plakaya yüklenmesini ve TOF kütle spektrometresinin çalışmasını gösterir. Son bölümde, tam hücre analizi, karmaşık biyolojik numunelerin karakterizasyonu ve elektron sprey iyonizasyonu dahil olmak üzere uygulamalar ve varyasyonlar gösterilmektedir.

Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu veya MALDI, biyomoleküllerin analizi için ideal bir kütle spektrometresi iyon kaynağıdır. Çoğu iyon kaynağı, büyük, kırılgan biyomoleküllerden yapısal bilgileri uzaklaştırır. MALDI, molekülleri kütle analizörüne hızlandırırken yapısal bütünlüğü ve dolayısıyla bilgiyi korur, bu da bileşikleri boyut ve yüke göre ayırır. MALDI ile en yaygın olarak birleşen, uçuş süresi veya TOF, kütle analizörüdür. Bu video, MALDI iyonizasyonu kavramlarını, genel bir prosedürü ve biyokimyadaki bazı kullanımlarını gösterecektir.

Kütle spektrometresinin çalışması için moleküllerin gaz haline iyonize edilmesi gerekir. MALDI'de numune, tipik olarak aromatik ve konjuge çift bağlar içeren organik bir bileşik olan bir matrise gömülür.

Bir lazer darbesi bu karışıma çarptığında, matris enerjinin çoğunu emer, hızla ısınır ve yüzeyden emilir veya serbest bırakılır. Enerji verilmiş matris, enerjisinin bir kısmını biyomoleküllere aktarır, onları desorbe eder ve sonra iyonize eder.

MALDI tipik olarak bir uçuş süresi veya TOF kütle analizörü ile eşleştirilir. Bir elektrik alanı, iyonlara kinetik enerji uygular ve onları sürüklenme tüpü adı verilen alansız bir bölgeye hareket ettirir. İyonların tüp içinde hareket ederken hızları, kütle-yük oranlarıyla ilgilidir, bu nedenle daha ağır parçacıklar alette daha yavaş hareket eder. Tüpün ucundaki bir dedektör, her iyonun uçuş süresini ölçer. Bu bilgiyle, tüp uzunluğu ve uygulanan alan kuvvetinin yanı sıra, her bir iyonun kütle-yük oranı açıklanabilir.

Kütle spektrumu olarak bilinen bu sinyal yoğunluğunun kütle-yük oranına oranı, toplanan spektrumlardan oluşan bir kütüphane ile karşılaştırılabilir. Eşleşme bulunamazsa, tandem kütle spektrometresi gibi daha ileri tekniklerle moleküller tanımlanabilir. Daha fazla bilgi için bu koleksiyonun konuyla ilgili videosuna bakın.

MALDI-TOF'un temelleri tartışıldığına göre, şimdi laboratuvardaki sürece bakalım.

Bir deneye başlamadan önce, numunelerin desorbe edileceği matris seçimini göz önünde bulundurmak önemlidir. Lazer enerjisini emmeli, vakumda stabil olmalı, hedef moleküllerle reaksiyona girmemeli ve desorbe edebilmelidir. Örneğe bağlı olarak farklı matrisler tercih edilir. Büyük bir protein için, CHCA ve DHB'nin bir kombinasyonu, çözünürlük adı verilen tepe noktalarının tek tek matrislerden daha iyi ayrıldığını göstermiştir.

Numune hazırlamanın birkaç yolu vardır. "Çift katmanlı" veya "sandviç" yöntemi olarak bilinen yöntemi göstereceğiz. Başlamak için, kütle spektrometresi kontaminasyona karşı çok hassas olduğu için MALDI plakasını ultra saf reaktiflerle temizleyin. Plakayı bir inert gaz akışı ile kurutun.

Daha sonra, tipik olarak organik bir çözücü ile doymuş bir matris çözeltisi yapılır. Çözelti MALDI plakasına çizilir ve kurutulur. Trifloroasetik asit veya TFA içeren ikinci bir doymuş matris çözeltisi hazırlanır. TFA, iyonların gaz fazına geçmesine yardımcı olur.

Daha sonra, numune çözeltisi kurutulmuş matris noktasının üzerine eklenir. Numunenin üzerine TFA içeren matris çözeltisini ekleyin, böylece matris "sandviçini" tamamlayın. Noktanın homojenliği, düşük güçlü bir mikroskop altında doğrulanabilir.

Plaka - Bilinen çok çeşitli kütlelere sahip bir karışım olan ve uçuş süresini m/z ile ilişkilendirmek için kullanılan bir kalibrasyon standardı. Son olarak, matrisi tek başına negatif bir kontrol olarak plakalayın.

Noktaları analiz etmek için hedef plakayı cihaza yerleştirin. Sıkı bir vakum oluşumuna izin veren kalıntı olmadığından emin olun. Yazılımda standardı, negatif kontrolü ve ilgilenilen örnekleri seçin. Noktaları doğru kimlikle etiketleyin.

İyon kaynağı ve lens voltajları, analizin performansını artırmak için manipüle edilebilir. Bu, cihazın ve numunenin özelliklerine bağlı olacaktır. Standart noktaya odaklanın ve cihazı yazılımla kalibre edin.

Ardından, numune noktalarının her birinden spektrum toplayın. Toplanan verilerin kalitesini en üst düzeye çıkarmak için yerinde birkaç farklı konum deneyin. Bittiğinde, MALDI plakası temizlendikten sonra toplanabilir ve tekrar kullanılabilir.

Artık bir prosedürü gözden geçirdiğimize göre, MALDI'nin bazı kullanım yollarına ve farklı bir iyonizasyon tekniğine bakalım.

Biyomoleküllere ek olarak, MALDI canlı hücreleri analiz etmek için kullanılabilir. Makrofajlar, mikro çevrelerine bağlı olarak birkaç farklı formdan birini alan bağışıklık hücreleridir. Hücreleri çeşitli sinyal moleküllerine veya sitokinlere maruz bıraktıktan sonra, doğrudan plakaya eklenebilir ve analiz edilebilirler. MALDI spektrumları, kullanılan sitokine bağlı olarak benzersiz "parmak izleri" olarak kullanılabilir.

Memeli yağ salgıları gibi karmaşık biyolojik numuneler, MALDI analizinden önce bir saflaştırma adımı gerektirir. İnce tabaka kromatografisi, bileşenlerin polaritesine dayanan böyle bir tekniktir. Bileşikler TLC ezmesinden toplanır, saflaştırılır ve bir MALDI matrisine aktarılır. Elde edilen spektrumlar, memeli yağ salgılarından ayrılan biyomoleküllerin kimliğini ve saflığını doğrular.

Biyomoleküller için başka bir yaygın iyon kaynağı, elektrosprey iyonizasyonu veya ESI'dir. Bu yöntemde numune, yüksek voltajın uygulandığı cihaza enjekte edilir ve yüklü damlacıklardan oluşan bir aerosol oluşturulur. Damlacıktaki çözücü buharlaştıkça, yük tamamen gaz haline gelene kadar numune moleküllerine taşınır. ESI, lekelenme prosedürü gerektirmez ve numune doğrudan cihaza enjekte edilebilir. Öte yandan, ESI tampon bileşenlerinin ve diğer kirleticilerin varlığına karşı daha hassastır, bu da MALDI'nin daha sağlam olduğu anlamına gelir.

Az önce JoVE'nin MALDI kütle spektrometresi hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, enstrümanın arkasındaki teoriyi tanımladı, genel bir prosedürün üzerinden geçti ve tekniğin bazı kullanımlarını kapsıyordu. İzlediğiniz için teşekkürler!