Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Bu protokolün genel amacı, onkolitik virüs tedavisini geliştirmek için manipüle edilebilecek konak hedeflerini belirlemektir. Bu yöntem, onkolitik virüs tedavisi alanında, hangi spesifik konak faktörlerinin ve hücresel yolların onkolitik virüs replikasyonunu modüle ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, onkolitik virüs tedavisini kapsamlı ve tarafsız bir şekilde geliştirmek için manipüle edilebilecek konakçı hedeflerinin belirlenmesine izin vermesidir.

Bu protokol, genel olarak virüs replikasyonunu modüle eden konak faktörlerini tanımlamak için de kullanılabilir. Metin protokolüne göre yüksek verimli bir tarama testi geliştirdikten sonra, dondurucudan bir grup mikrotitre plakasını çıkarın ve 20 ila 30 dakika boyunca buzlarının çözülmesine izin verin. Bu arada, iki şişeyi% 70 etanol ile doldurun, ardından iki adet 50 mL konik tüpü PBS ve birini damıtılmış su ile doldurun.

Sıvı dağıtıcı hortumunu %70 etanol içeren bir şişeye daldırın, ardından borunun steril olarak kabul edilebileceği noktayı işaretlemek için borunun etrafına bir parça maskeleme bandı yerleştirin. Boruyu astarlamak için yaklaşık 25 mL %70 etanol kullanın. Kayıp hacmi değiştirmek için şişeye ilave etanol dökün, ardından boruyu en az beş dakika etanol içinde bekletin.

Hücre kültürü başlığını hazırladıktan sonra, kapalı plakaları santrifüjleyin ve iki dakika boyunca oda sıcaklığında 1026 kez G'ye ayarlayın. Ardından, contaları plakalardan çıkarın. Ardından, gerekli miktarda transfeksiyon reaktifini, önceden ısıtılmış transfeksiyon reaktifi seyrelticisini içeren konik tüplere pipetleyin.

Ortamı her plakadan aspire ederek hücreleri tripsinizlemeye başlayın. Hücreleri durulamak için dokuz mL PBS kullanın, ardından plaka başına üç mL tripsin pipetleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede yaklaşık beş dakika inkübe edin.

Ardından, hücreleri 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse etmek için 22 mL ortam kullanın. Her bir doku kültürü plakasından alınan hücre süspansiyonunu steril bir şişede birleştirin ve şişeyi ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın. Daha sonra hücre süspansiyonundaki bir mL alikuatları iki ayrı mikrofüj tüpüne pipetleyin.

Numuneyi her bir mikrofüj tüpünden çıkarın ve hücreleri sayın. Ardından, gereken yoğunluk için gereken hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın ve bir plaka partisine dağıtmak için yeterli seyreltilmiş hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücreler hazırlanırken, etanolün sıvı dağıtıcı borusunu boşaltın.

Boruyu doldurmak için yaklaşık 25 mL PBS kullanın ve ardından boruyu boşaltın. Borunun transfeksiyon reaktifine ve daha sonra hücre süspansiyonuna daldırılacak kısmının steril tutulduğundan emin olun. Bir konik transfeksiyon reaktif çözeltisi tüpü ile güvenli bir şekilde yapılabilen plakaları ayırın.

Transfeksiyon reaktif çözeltilerini 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, kuyucuk başına 5 mikrolitre dağıtmadan önce boruyu astarlamak için çözeltiyi kullanın. Plakaları oda sıcaklığında 1026 kez G'de bir dakika santrifüjleyin.

Daha sonra plakaları, kullanılan transfeksiyon reaktifi için öngörülen süre boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyon sırasında, transfeksiyon reaktif çözeltisinin borusunu boşaltın ve PBS içeren tam 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin. Ardından, boruyu astarlayarak ve ardından boşaltarak durulamak için yaklaşık 25 mL PBS kullanın.

Hücre süspansiyonunu içeren şişeyi karıştırın, ardından boruyu süspansiyona yerleştirin ve her bir ucun düzgün bir şekilde dağıtıldığını görmek için boruyu yeterince doldurun. Tüm plakalar boyunca hücre süspansiyonunun oyuğu başına 30 mikrolitre dağıtın. Hücre süspansiyonunu tüpten boşaltın, ardından tüpü yaklaşık 25 mL PBS ve ardından yaklaşık 50 mL damıtılmış su ile durulayın.

Plakaların hücre tohumlama zamanından itibaren 45 ila 60 dakika oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Daha sonra, istenen gen susturma uzunluğu için plakaları bozulmamış bir inkübatörde inkübe edin. Zaman kazanmak için, hücreleri enfekte etmeden bir gün önce, enfekte olmamış kuyucuklar için ortam da dahil olmak üzere her bir plaka grubunu enfekte etmek için gereken kesin ortam miktarını steril şişelere pipetleyin.

Ortamı 37 santigrat derecede ısıtın, ardından iki şişeyi %70 etanol, iki adet 50 mL konik tüpü PBS ve birini damıtılmış su ile doldurun. Boruyu daha önce gösterildiği gibi% 70 etanol ile sterilize edin. Boru etanol içinde otururken, önce virüsü girdaplayın ve ardından gereken kesin virüs hacmini enfeksiyon ortamı şişesine pipetleyin.

Ardından, doldurmak için 25 mL PBS kullanarak tüpü durulayın ve ardından boşaltın. Plakaları inkübatörden çıkardıktan sonra, doku kültürü başlığına yerleştirin. Boruyu astarlamak için orta kullanın, ardından enfekte olmamış kontrol kuyularına 40 mikrolitre ortam dağıtın.

Ortamın borusunu boşaltın ve durulamak için 25 mL PBS kullanın. Virüsü karıştırdıktan sonra, tüpü virüsü içeren şişeye yerleştirin, plakalara 40 mikrolitre virüs dağıtın. Plakaları oda sıcaklığında 400 kez G'de 30 dakika santrifüjleyin.

Plakaları önceden belirlenen süre boyunca inkübe edin. Sabitlemeden bir gün önce, her plaka grubu için yüzde dört formaldehit ve PBS içeren bir şişe sabitleme ve ayakta durma çözeltisi hazırlayın, ancak Hoechst lekesini atlayın. Solüsyonu yanıcı dolapta ışıktan uzakta saklayın.

Ertesi gün, daha önce gösterildiği gibi boruyu durulamak için% 70 etanol ve PBS kullanın. Tüm plakalara 30 mikrolitre çözelti dağıtın, ardından plakaları 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, contaları plakalara uygulayın ve ışıktan koruyarak dört santigrat derecede saklayın.

Metin protokolüne göre görüntüleme ve analiz yapın. Burada, tek başına transfeksiyon reaktif seyrelticisi ile 72 saatlik bir inkübasyonun ardından Hoechst 33342 ile boyanmış 786 O hücresi gösterilmektedir. Transfeksiyon reaktifi ve seyreltici, hedeflemeyen siRNA ve PLK1'i hedefleyen siRNA ile.

Burada görülen sağkalım grafiği, PLK1 siRNA ile transfekte edilen hücrelerin %22'sinin hayatta kaldığını ve hedeflemeyen siRNA ile transfekte edilen hücrelerin %94'ünün hayatta kaldığını göstermektedir. Bu grafik, çeşitli MOI'lerde gelişmiş GFP'yi eksprese eden onkolitik aşı virüsü ile enfekte olmuş 786 O-hücresinin canlı zaman seyrinin sonuçlarını göstermektedir. Canlı bir zaman kursu boyunca 0.05'lik bir MOI'de enfekte olmuş hücrelerin temsili görüntüleri burada gösterilmektedir.

21 saatlik bir kuluçka süresi, zaman noktası doğrusal bir aralıkta olduğu için yayılmadaki artış ve azalışların tespit edilmesine izin verecektir. Üç tümör hücre dizisi boyunca genom çapında RNAi taramalarının ardından, MAD yöntemi kullanılarak üç kanser hücresi dizisinden en az ikisinde ortak olan 1008 isabet tespit edildi. UPR ve ERAD yolakları içindeki 10 isabet, farklı hedefleme dizilerine sahip siRNA aracılığıyla ikincil doğrulama için seçildi.

Reaktifleri dağıtırken, doğru plaka partisine sahip olmanız, dağıtım için doğru hacmi seçmiş olmanız ve borunun doğru reaktifle doldurulmuş olması ve her zaman reaktife tamamen daldırılmış olması çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, onkolitik virüs tedavisini geliştirmek için manipüle edilebilecek konak hedeflerini belirlemek veya genel olarak virüs replikasyonunu modüle eden konak faktörlerini belirlemek için yüksek verimli bir RNAi taramasının nasıl yürütüleceğini iyi anlamış olmalısınız.