Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Bu deneysel prosedürün genel amacı, tümör ve mezenkimal kök hücreler arasındaki hücre dışı vezikül aracılı iletişimin rolünü incelemek için klinik öncesi bir fare modeli geliştirmektir. Bu yöntem, tümör ve mezenkimal kök hücrelerin hücre dışı veziküller aracılığıyla nasıl iletişim kurduğu ve bunun kanserin ilerlemesini destekleyip desteklemediği gibi kanser biyolojisi alanındaki birkaç önemli soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kanser EV'leri tarafından mezenkimal kök hücre adaptasyonunun, in vivo ilerleme ve metastaz oluşumu üzerindeki rolünü incelemeye izin vermesidir.

Bu prosedürün anlamı, kanser tedavimize kadar uzanır, çünkü GSA'yı EV iletişimine müdahale etmek ve kanserin ilerlemesini engellemek için androjen sinyalizasyonuna müdahale etmek için kullanabiliriz. Osteosarkomda EV aracılı iletişim hakkında bilgi vermenin yanı sıra, bu yöntem diğer birçok kanser türüne de uygulanabilir. Gerçekten de, mezenkimal kök hücrelerden türetilen kemik iliği, kanseri destekleyen hücrelere farklılaşabilecekleri daha fazla bölgeye kolayca alınır.

Her biri 3 milyon 143B hücreli sekiz adet 175 santimetre karelik şişeyi tohumlayarak başlayın. Hücreleri 36 ila 48 saat boyunca EV tükenmiş ortam kullanarak kültürleyin. Hücreler %80 ila %90 birleştiğinde, EV izolasyonu için süpernatanları sekiz şişeden toplayın.

Ardından, süpernatanttan tüm hücreleri ve hücre kalıntılarını çıkarmak için diferansiyel santrifüjleme kullanın. Bu, maksimum hızlanma ve yavaşlama ile dört santigrat derecede tekrarlanan santrifüjlemelerden oluşur. Her santrifüjleme adımından sonra, süpernatanı toplayın ve santrifüj tüpünde bir mililitre süpernatanı geride bırakın.

Şimdi, önceden temizlenmiş bir süpernatanı, tüp başına 38,5 mililitre olacak şekilde ultrasantrifüj tüplerine yükleyin. Ardından, EV'leri bir saat boyunca 70.000 g'da bir ultrasantrifüj kullanarak, yavaş bir mola ile ve dört santigrat derecede izole edin. Ultrasantrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve yaklaşık bir mililitre geride bırakın.

Ardından, kalan hacimde EV içeren peletleri yeniden askıya alın. Tüm süspansiyonları bir araya getirin. Ve havuzlanmış süspansiyonları PBS ile yıkayın.

Tüpü 38,5 mililitreye kadar doldurun. Ardından, ultrasantrifüj döngüsünü tekrarlayın, ancak ara vermeyin. Rotor yaklaşık bir saat sonra dönmeyi durdurmalıdır.

Daha sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 100 ila 200 mikrolitre çözelti bırakın. Son olarak, EV peletini yeniden askıya alın ve son hacmi PBS ile 200 mikrolitreye ayarlayın. EV'ler daha sonra TEM ile karakterize edilebilir, alım deneyleri için boyalarla etiketlenebilir veya in vivo deneyler için mezenkimal kök hücreleri eğitmek için kullanılabilir.

Birincil MSC'lerin kanser EV'lerine maruz kalmadan önce doğru hücre yoğunluğunda olması çok önemlidir. Optimal hücre EV oranını elde etmek ve ayrıca eğitim dönemlerinde aşırı büyümeyi önlemek için hücre yaklaşık %70 oranında birleşik olmalıdır. Bu deneyde alıştırılmış yetişkin Athymic Nude-Foxn1nu fareleri kullanılmaktadır.

Cerrahi işlemden bir gün önce, içme suyu yoluyla parasetamol sağlayın. Ameliyat gününde, PBS'de mikrolitre başına 200.000'de 143B hücresi hazırlayın. Ameliyattan 20 dakika önce, hayvana buprenorfin sağlayın.

Anesteziden hemen önce, konsantre 143B hücreleri ile 10 mikrolitrelik bir şırınga yükleyin. Uygun anesteziyi onayladıktan ve göz merhemi uyguladıktan sonra, hayvanı arka bacakları operatöre bakacak şekilde sırt üstü yatırın. Ardından, hayvana bir anestezi maskesi takın.

Ardından, sol dizinizi esnetin ve cildi üç alternatif %70 etanol ve povidon-iyot fırçasıyla silin ve ardından lokal analjezik olarak %2 lidokain uygulayın. Şimdi, kaval kemiğini ortaya çıkarmak için dizin hemen altındaki deriye küçük bir kesi yapın. Ardından, 0,8 mililimiter mikro bükümlü bir matkap kullanarak, kaval kemiğinde dizin yaklaşık 2 milimetre altında bir iğne deliği açın.

Her iki tibia korteksini delmekten kaçının. Yaklaşık beş saniye boyunca deliğe bir mikrolitre hücreyi yavaşça enjekte ederek devam edin. Ardından, süspansiyonun geri akışını önlemek için deliği bir damla doku yapıştırıcısı ile kapatın.

Cildi dikişler ve bir damla doku yapıştırıcısı ile kapatarak ameliyatı tamamlayın. Hayvanın ısıtma ile iyileşmesine izin verin ve 24 saat boyunca parasetamol ile muamele edin. İki gün sonra, MSC'leri kuyruk damarına enjekte etmek için 0,5 milimetrelik bir insülin şırıngası kullanın.

Kuyruk damarı enjeksiyonu sırasında doğru uygulama görsel olarak doğrulanabilir. Beyaz bir alan belirirse veya dirençle karşılaşırsanız, lütfen önceki enjeksiyon bölgesinin üzerindeki bir alana tekrar enjekte edin. Daha sonra, haftada iki kez, biyolüminesans kullanarak tümör büyümesini takip edin.

Farelere bir insülin şırıngası yoluyla D-lusiferin enjekte edin ve 10 dakika sonra, bir görüntüleme sistemi kullanarak tümör hücrelerinden üretilen foton akışını ölçün. Bir hayvanın tümör çapı 15 milimetreden daha büyük olduğunda veya kilo kaybı% 15'i aştığında, hayvana ötenazi yapın ve ilgili tüm dokuları toplayın. Ötenaziden 10 dakika önce, görüntülemeden önce yapıldığı gibi D-lusiferin enjekte edin.

Ötenaziden sonra, sterilize edilmiş makas ve cımbız kullanarak akciğerleri, karaciğeri, dalağı ve böbrekleri toplayın. PBS kullanarak organlardaki kanı yıkayın ve görüntüleme için bir Petri kabına yerleştirin. Bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanarak, organların her iki tarafını da belgeleyin.

Görüntüler çekildikten sonra, gelecekteki histolojik analizler için organları hemen sabitleyin. Fotoğraf belgelerini işlemek için manuel eşikleme uygulamanız ve her fotoğraftaki nodül sayısını saymanız yeterlidir. Her fotoğraf için aynı eşiği kullandığınızdan ve dokuları, özellikle akciğerler olmak üzere her yönden belgelediğinizden emin olun.

Fare kaval kemiğini kireçten arındırdıktan sonra, dehidrasyon ve parafin gömme işlemine devam edin. Ardından, altı mikronluk parafin bölümleri hazırlamak için bir mikrotom kullanın ve bölümleri cam slaytlar üzerinde toplayın. Slaytlar kuruduktan sonra gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.

Ertesi gün, sitrat tamponu kullanarak ısı aracılı bir antijen alımı gerçekleştirin. Daha sonra, dokuları bir ila 900 arasında anti-GFP antikoru ile boyayın ve ardından bir DAPI karşı boyası uygulayın. Son olarak, lekeli doku kesitlerini floresan mikroskobu kullanarak belgeleyin.

İzole edilmiş EV'lerin saflığı elektron mikroskobu ile doğrulandı. Müstahzarlar, çapı 40 ila 100 nanometre arasında veziküller içeriyordu. Kanser EV'lerinin MSC'lerle etkileşime girip girmediğini değerlendirmek için, EV'ler yeşil bir floresan lipofilik bağlayıcı boya ile etiketlendi ve gece boyunca MSC'lerle inkübe edildi.

MSC'ler tarafından verimli EV alımı böylece doğrulandı. EV'lerin MSC'ler üzerindeki immünomodülatör bir özelliği, multipleks B bazlı bir sitokin immünolojik testi kullanılarak doğrulandı. Tümör EV'leri, insan fibroblast kontrol EV'lerine kıyasla MSC'lerde IL-8 ve IL-6 üretiminin artmasına neden oldu.

Daha sonra, osteosarkomun ortotopik bir ksenogreft fare modelinde, EV eğitimli MSC'lerle tedavi edilen farelerin tümör büyümesini hızlandırdığı gösterilmiştir. GFP eksprese eden MSC'lerin sistemik enjeksiyonundan dört gün sonra, kemik iliğinde ve tümör dokusunda GFP eksprese eden hücreler tespit edildi ve bu da MSC'nin tümör bölgesine yöneldiğini gösterdi. Çeşitli organların ex vivo görüntülemesi akciğer nodülü oluşumunu vurgulamıştır.

Sonuçta, EV eğitimli MSC'leri alan farelerde daha fazla akciğer metastazı vardı. Bu videoyu izledikten sonra, stromal hücreleri ex vivo kanser EV'leri ile nasıl eğiteceğinizi iyi anlamalı ve eğitimli stromal hücrelerin etkilerini in vivo olarak preklinik fare modellerini kullanarak incelemelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür yeterli kanser EV'sinin mevcut olması koşuluyla dört hafta içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, önceden plan yapmak ve kanser hücre dışı veziküllerinin tekrarlanabilir bir şekilde saflaştırılmasını sağlamak ve ayrıca düşük geçişli proliferatif mezenkimal kök hücreleri kullanmak önemlidir.