Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Bu protokolün genel amacı, immünofloresan boyamayı 3D işlevselleştirilmiş bir tel üzerinde DNA floresan in situ hibridizasyon ile birleştirmek ve geleneksel bir geniş alan floresan mikroskobu kullanarak destek üzerindeki immünofenotip ve FISH sinyallerini tanımlamaktır. Bu yöntem, dolaşımdaki küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücreleri üzerinde tedaviyle ilgili hedeflerin belirlenmesi gibi tümör hücresi karakterizasyonunun salgılanması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, varsayılan CTC'leri tespit etmek için EpCAM pozitifliği gibi fenotipik parametrelerin ve ARC gen durumu gibi sitosomatik değişikliklerin aynı anda tanımlanmasına izin vermesidir.

Bu yöntem, in situ insülin kanseri CTC özelliklerini sağlamak için benzersiz bir şekilde tasarlanmış olsa da, meme kanseri gibi diğer kanserlerin çalışmasına da uygulanabilir. Bu protokolü, doğrudan immünofenotipleme ve CTC tespiti için teli tutarken geliştirdik. Daha fazla veri elde etmek için, bir immünofenotipleme protokolünü bir DNA floresan in situ hibridizasyon protokolü ile ilişkilendirdik.

Telin kullanımı kolay değildir, çünkü işlevselleştirilmiş uç kırılgandır. Görsel bir gösteri, okuyucuların adımları yeniden üretmesini sağlayacaktır. Deneye başlamak için, dört mililitre tam ortam kullanarak beş mililitrelik bir şişede% 80 birleşim noktasında olan bir T75 şişesinin tüm içeriğini yeniden süspanse edin.

Ardından, teli cam ambalajından çıkarın. Telin işlevselleştirilmiş altın kısmını şişeye batırın ve tel durdurucunun beş mililitrelik bir şişeye su geçirmez şekilde oturduğundan emin olun. Kabloyu laboratuvar filmi ile kapatın.

Ardından, teli oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir tüp döndürücüde inkübe edin. Döndürmeden sonra, üç farklı temiz flakon kullanarak teli tek katlı PBS solüsyonunda üç kez durulayın ve telin kurumasını bekleyin. Teli bir davlumbazda 10 dakika havayla kuruttuktan sonra, teli oda sıcaklığında 10 dakika boyunca beş mililitrelik bir tüpte% 100 aseton çözeltisine batırarak hücreleri sabitleyin.

İşlevselleştirilmiş uçta aseton izi olmadığından emin olun. Teli oda sıcaklığında beş dakika havayla kurutun. Daha sonra, beş mililitrelik bir tüpte, teli bir kat PBS'de iki kez yıkayın.

Teli antikor seyreltme tamponunda inkübe edin. Veri sayfasında belirtilen florokrom ve antikor seyreltme tamponu ile konjuge edilmiş monoklonal birincil antikor seyreltmesi ile 150 mikrolitre antikor karışımı hazırlayın. Ardından, teli tel durdurucudan çıkarmak için bir P200 ucu kullanın ve teli ucun daha büyük deliğinden yavaşça sokun.

Önce işlevselleştirilmemiş ucu yerleştirin ve altın parça daha büyük deliğin hemen ötesine gelene kadar teli daha küçük delikten yavaşça çekin. Yavaşça 150 mikrolitre antikor karışımını uca ekleyin. Kabarcık oluşumu riskini önlemek için, işlevsel uç tamamen daldırılana kadar teli hafifçe döndürün.

Ucun deliğini kapatın ve deliğin etrafına laboratuvar filmi sarın. Teli gece boyunca karanlıkta dört santigrat derecede dikey olarak inkübe edin. İkinci gün, teli tek katlı PBS'de iki kez yıkayarak antikor inkübasyonunu bloke edin.

Kabloyu tel durdurucusuna yeniden takın. DNA-FISH protokolünden üç saat önce, hibridizasyon fırınını 75 santigrat dereceye ayarlayın ve kuru ısı fırınını 37 santigrat dereceye ayarlayın. 0,4 kat SSC çözeltisini dört santigrat dereceye kadar soğutun.

Teli buz gibi 0,4 kat SSC solüsyonunda üç kez yıkayın. Kabloyu karanlıkta çeker ocak dolabının altında 10 dakika kurutun. 10 dakika sonra, probu girdap haline getirin ve beş saniye döndürün.

Probun 10 mikrolitresini cam mikrotüplere bırakın, ardından üzerlerini laboratuvar filmi ile kaplayın. Mikrotüpleri kuru emici kağıda sarın. 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve kısa bir süre döndürün.

Kurumuş teli dikkatlice mikrotüpe yerleştirin ve tel durdurucuyu yerleştirin. Ardından, tel durdurucuyu kauçuk çimento ile kapatın. Tam DNA denatürasyonu elde etmek için teli hibridizasyon fırınında 75 santigrat derecede sekiz dakika boyunca koyu nemli bir odaya yerleştirin.

Sekiz dakika sonra, nemli odayı gece boyunca 37 santigrat derecede kuru bir ısı fırınına taşıyın. 0,4 kat SSC solüsyonlu slayt boyama kavanozunu 72 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin. 0,4 kat SSC çözelti sıcaklığını 72 artı veya eksi bir santigrat dereceye ulaşana kadar kontrol edin.

Sonra, iki cam beher hazırlayın. Biri iki katlı SSC artı %0.05 Tween çözeltisi ve ikincisi damıtılmış su ile. Kuru ısı fırını için nem haznesini çıkarın.

Kauçuk çimentoyu tel durdurucudan dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın ve işlevselleştirilmiş uca zarar vermemeye dikkat ederek telin kaplanmamış ucunu uç durdurucudan çekin. Kabloyu 72 santigrat derecede iki dakika boyunca 0,4 katlı SSC çözeltisine batırın. Teli iki katlı SSC artı %0,05 Tween solüsyonunda oda sıcaklığında 30 saniye yıkayın.

Ardından teli oda sıcaklığında damıtılmış suda yıkayın. Çeker ocak altındaki teli karanlıkta 10 dakika kurutun. Telin işlevselleştirilmiş ucunu iki mililitrelik bir şişede önceden hazırlanmış DAPI çözeltisi ile inkübe edin.

Teli tek katlı PBS'de iki kez durulayın ve teli havayla kurutun. Teli tel tutucuya yerleştirin ve işlevselleştirilmiş ucu, uç bağlantı noktasıyla eşleşene kadar özel tutucunun giriş noktasından dikkatlice sokun. Özel tutucuyu mikroskop tablasına yerleştirin.

20 katlı bir lens kullanarak mikroskobun odağını ayarlayın. İlk olarak, özel desteğe kabaca odaklanın ve ardından DAPI kanalında parlak görünen hücrelere ince bir şekilde ayarlayın. Yalnızca lensin merkezindeki hücreleri odaklayın ve kırmızı, yeşil ve mavi problar için uygun filtrelere sahip 20x ve 40x objektiflerde 12 bitlik bir dijital kamera kullanarak görüntüler elde edin.

Son olarak, teli işlevsel ucun yanına paketleyerek teli uzun süreli saklama için hazırlayın ve teli dikkatlice bir cam tüpe yerleştirin. Teli dikey veya yatay olarak eksi 20 santigrat derecede saklayın. İmmünofloresan boyama DNA-FISH sinyallerine müdahale etmedi.

İmmüno-DNA-FISH testi, 3D destekli işlevselleştirilmiş tel üzerinde gerçekleştirildiğinde, EpCam boyaması açıkça görüldü. ALK sondası gen delesyonunu ortaya çıkardı. NCI-H3122 hücre hattı, vahşi tip ALKG ile NCI-H1975'in aksine anormal bir LAK gen durumu gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol üç gün boyunca toplam dokuz çalışma saatinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, herhangi bir hasarı önlemek için telin işlevsel kısmına dokunmamak önemlidir. Bu protokolü takiben, diğer fenotipik belirteçlere sahip hücrelerin tanımlanması ve NAT veya HAR2 gen amplifikasyonu gibi diğer sitogenetik değişiklikler gibi ek soruları yanıtlamak için farklı antikorlar ve FISH probları kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, EpCAM pozitifliği gibi fenotipik parametreler aracılığıyla eşzamanlı olarak varsayılan CTC'leri nasıl tanımlayacağınızı ve ARC gen durumu gibi sitogenetik değişiklikleri nasıl tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Aseton ve fırınla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken asetonu kapüşonda tutmak ve koruyucu eldiven giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.