Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Bu protokolün genel amacı, klinik örneklerden yüksek kaliteli tümör DNA'sı elde etmektir. Bu yöntem, kanser araştırması, tanı ve tedavi kararları gibi temel ve klinik bilimlerdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tümör DNA'sını önceki yöntemlere göre daha basit ve hızlı bir şekilde elde edebilmemizdir.

Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış ve rezeke edilmiş bir dokunun tümör yüzeyine eldivenli ellerle birkaç kez normal bir cam slayt üzerine dokunun. Dokunulan alanın cam sürgünün %80'inden fazlasını kapladığını görsel olarak onaylayın. Normal cam sürgüyü bir Polietilen Naftalat veya PEN membran sürgüsüne hafifçe bastırın ve eldivenli ellerle iki ila üç kez hafifçe ovalayın.

Hücrelerin normal cam slayttan PEN membran slaytına aktarıldığını görsel olarak onaylayın. Hem camı hem de PEN membran slaytlarını oda sıcaklığında beş dakika havayla kurutun. Kuruduktan sonra, doğrudan sitolojik inceleme için normal cam slaytı boyayın.

Cam slaytları beş saniye boyunca sabitleyici solüsyona batırın ve ardından 15 saniye boyunca Giemsa boyama solüsyonu ile boyayın. Hızlı değerlendirme için normal cam slayt üzerindeki tümör içeriğini ve hücreselliği tamamen bir mikroskopla değerlendirin ve tarayın. Tümör hücrelerini çeşitli kriterlere göre değerlendirin.

Numune, önceki bölümden hızlı mikroskobik değerlendirme ile %60'ın üzerinde tümör hücreselliği gösteriyorsa, DNA ekstraksiyonu için PEN membran slaytlarının tümöre dokunmuş filmini bir bıçak ve eldivenli ellerle kesin. Kesilen filmi bir pim seti ve eldivenli ellerle steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Film içeren mikrosantrifüj tüpünü DNA ekstraksiyonuna kadar dört santigrat derecede saklayın.

Yazılımı açın ve çalışma koşulunu planlayın ve yazılım içinde çalıştırma parametresini ayarlayın. Plan sekmesine tıklayın ve şablonu seçin, ardından uygun çalıştırma yöntemini seçin. Uygulama ve teknik türünü seçin ve ileri'ye tıklayın.

Cihazı, numune hazırlama kitini, kitaplık kiti türünü, şablon kitini, sıralama kitini, temel kalibrasyon modunu, çip tipini, kontrol sırasını ve barkod setini seçin ve ileri'ye tıklayın. Eklentileri seçin ve ileri'ye tıklayın. Projeyi seçin ve ileri'ye tıklayın.

Ardından, hedeflenen bölgenin varsayılan referansını ve BED dosyalarını seçin. Örnek adını yazın, barkodu seçin ve çalıştırmayı planla'ya tıklayın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre otomatik bir cihazda şablon hazırlama ve talaş yükleme gerçekleştirin.

Reaktif kartuşunu kullanmadan önce oda sıcaklığında 45 dakika çözdürün. Seyreltilmemiş kütüphaneyi, adım 6.8'de hesaplanan kütüphane konsantrasyonuna göre nükleaz içermeyen su ile seyreltin ve 20 pikolar kütüphane yapın. Sıralama için havuzlanmış bir kitaplık hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.

Numune tüpünün altına 100 mikrolitrelik bir pipet ile havuzlanmış kitaplıktan 25 mikrolitre ekleyin. Gücü açın ve otomatik cihazın kapağını açın. Sıralama çipini, çip adaptörünü, zenginleştirme kartuşunu, uç kartuşunu, PCR plakasını, PCR çerçeve contasını, geri kazanım tüpünü, çözelti kartuşunu ve reaktif kartuşunu otomatik cihazın uygun konumuna yerleştirin.

Dokunmak, ayarlamak, çalıştırmak ve ekranda adım adım. Kapağı kapatın ve ekranda kontrolü başlat'a dokunun. Güverte tarama işleminden sonra ileri'ye dokunun.

Ekran içeriğini, kit tipini, çip kimliğini, numune kimliğini, çip türünü, planları kontrol edin. Saati ayarlayın ve Tamam'a dokunun. Talaş yüklemeyi bitirdikten sonra ileri'ye dokunun ve kapağı açın. Eldivenli ellerle sıralama çipini çip adaptöründen çıkarın.

Çipi çip kabına yerleştirin, parafilm ile sarın ve dizileme reaksiyonuna kadar çipi dört santigrat derecede saklayın. Ardından zenginleştirme kartuşunu, PCR plakasını, PCR çerçeve contasını, geri kazanım tüpünü, çözelti kartuşunu ve reaktif kartuşunu eldivenli ellerle otomatik cihazın uygun konumundan çıkarın. Boş bir uç kartuşunu eldivenli ellerle otomatik cihazın atık uç konumuna aktarın.

İleri'ye dokunun ve kapağı kapatın. Ardından başlat'a dokunun ve otomatik cihazı ultraviyole ışınlarıyla dört dakika boyunca temizleyin. Bir sodyum klorit tableti 1.000 mililitre ultra saf suda çözün ve çözeltiyi 0.22 mikronluk bir filtre ile filtreleyin.

Sıralama aleti ısındıktan sonra, sıralama enstrümanının ekranında temize ve ileri'ye dokunun. Sıralama aletini 250 mililitre filtreyle sterilize edilmiş sodyum klorit çözeltisi, ardından 250 mililitre ultra saf su ile temizleyin. Ardından başlat'a dokunun ve ekranda uygun sıralama kitini seçin.

Eldivenli ellerle gri bir nakliyeci takın. Sıralama cihazını yıkama solüsyonu, pH ayarlama solüsyonu ve pH standart solüsyonu ile başlatın. Ardından, 100 mikrolitrelik bir pipetle 50 mililitrelik tüplere 20 mikrolitre DATP, DGTP, DCTP ve DTTP nükleotidi ekleyin.

Eldivenli ellerle uygun yere gri bir gönderici takın. 50 mililitrelik tüpü yükleyin ve sıralama aletine vidalayın. Başlatma adımını başlatmak için ekranda ileri'yi seçin.

Başlatma adımını tamamladıktan sonra, ekranda çalıştır'a dokunun ve uygun kitaplık hazırlama aracını seçin. Çipin iki boyutlu barkodunu tarayın. Sıralama çipini uygun konuma yerleştirin.

Çip kelepçesini ve alet kapağını kapatın ve sıralama çalıştırmasını başlatmak için ekranda talaş kontrolü, ardından ve Tamam'a dokunun. Sıralama reaksiyonundan sonra, verileri aktarın ve sıralama sunucusunda veri analiz boru hattı gerçekleştirin. Mutlak DNA miktarları ve genomik DNA'nın bozunma seviyesinin bir göstergesi olan RQ değeri, FFPE örneklerine kıyasla TIC örnekleri kullanılarak daha yüksek bir DNA verimi elde edildiğini göstermektedir.

Ek olarak, TIC DNA'dan elde edilen RQ değerleri, farklı tümör tiplerinde FFPE DNA'nınkine kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. APC Q1367*, birinci bölgeden ekstrakte edilen hem FFPE hem de TIC DNA'da ve APC S1356*KRAS G12D'de tanımlandı ve TP53 M237i, iki, üç ve dördüncü bölgeden ekstrakte edilen hem FFPE hem de TIC DNA'da tespit edildi, bu da aynı tümör bölgesinden hazırlanan eşleştirilmiş FFPE ve TIC DNA örneklerinde aynı somatik mutasyonların tanımlandığını düşündürmektedir. Özellikle, primer kolorektal kanser ile iki metastatik karaciğer kanseri örneği arasında aynı somatik mutasyonlar tespit edildi, bu da tümörün ikinci bölgeden karaciğere metastaz yaptığını düşündürdü.

Geliştirildikten sonra bu teknik, moleküler ve tıbbi araştırmalar alanındaki araştırmacıların genetik kanserleri tanımlamasının önünü açtı.