Name: Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin, tümör dokularından yüksek kaliteli genomik DNA elde etmek için dokunma izi sitolojisi yöntemini. Bu teknik, kanser araştırmalarında genetik analizi hızlandırır ve basitleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hastane ve hastaların tüm tıbbi ve yardımcı personel katılmayı kabul etmiş için teşekkür ediyoruz. Gabrielle White Wolf, doktora, Edanz bu raporu taslağını düzenlemek için Grup (www.edanzediting.com/ac) teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada genom araştırma projesinden Yamanashi İli (YH ve tarzı) ve bir hibe üzerinden YASUDA tıbbi Vakfı (YH) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir.

1. TIC hazırlık Normal cam kullanarak hızlı mikroskopik değerlendirmesi için slaytlar
<ol><li>Klinik Patolojik doku malzemelerin mevcut olacağı sonra en kısa zamanda TIC hazırlık gerçekleştirin. TIC numuneler hemen hazır değil, serum ıslatılmış kaplı doku malzemeler steril gazlı bez tutmak ve dokuları kurutma önlemek için buzdolabında saklamak.</li>
	<li>Klinik olarak cerrahi veya endoskopi tarafından elde edilen 5 mm3 doku malzeme solid tümör (örneğin, karaciğer, akciğer ve meme dokuları) gibi hazırlayın.<ol>
<li>Yavaşça doku fizyolojik serum kaplı steril gazlı bezle silin ve kan, doku yüzeyi çok kan varsa kaldırın.</li>
		<li>Biyopsi malzeme gibi mikroskobik örnekleri için fizyolojik serum içinde batırılmış steril gazlı bezle nemlendirilmiş örnek tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kesmek ve normal doku düzeltme bıçakla trim ve tümör kitleleri fena halde görünür değilse tümör lezyon yüzeyine karşı karşıya.</li>
	<li>Eldivenli ellerle birkaç kez normal cam slayda rezeke örneklerin tümör yüzeye dokunun. Görsel olarak dokundu alan üzerinde normal cam slayt % 80'i olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Hafifçe karşı bir polietilen Naftalin (PEN) membran slayda normal cam slayt tuşuna basın ve 2 - 3 kez eldivenli elleriyle hafifçe ovalayın. Görsel olarak hücreleri kalem membran slayda normal cam slayttan aktarılır onaylayın.</li>
	<li>Cam ve kalem membran slaytlar oda sıcaklığında 5 min için kuruması.</li>
	<li>Doğrudan saytolojik muayene için normal cam slayt leke. 5 s için sabitleştirici çözüm ile cam slaytlar ve çözüm 15 boyama Giemsa ile sonra leke daldırma s.</li>
	<li>Değerlendirmek ve tamamen hızlı değerlendirme için mikroskop ile tümör içeriği ve cellularity normal cam slayt üzerinde ekran. Tümör hücreleri çeşitli ölçütlere göre değerlendirmek; Nükleer genişleme, anormal karyotip, bol Kromatin, hücre eşitsiz dağılımı, nükleer bileşen/sitoplazmik bileşeni, hücre boyutunu ve hücre polarite oranı.</li>
</ol>2. genetik test için hazırlık kalem membran Slayt Film
<ol><li>Örnek tümör cellularity gösteriyorsa hızlı mikroskopik değerlendirme (1.8. adım) üzerinden % 60 oranında tümör dokundu filmin DNA ekstraksiyon kalem membran slaytların bir bıçak ile kesmek ve eldivenli elleri. Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.</li>
	<li>Tümör cellularity düşük (az %60 tümör içindekiler) hızlı mikroskopik değerlendirme (Adım 1.8) tarafından tespit edildi, lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanın ve tümör örneklerini almak.<ol>
<li>Standart protokolleri kullanarak tümör hücreleri değerlendirmek için boyama Giemsa gerçekleştirin.</li>
		<li>PEM membran slayt uygun lazer yakalama mikrodiseksiyon tarafından film kesti.</li>
		<li>Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.</li>
		<li>Film içeren microcentrifuge tüp 4 ° C'de (protokol burada duraklatılmış) DNA ekstraksiyon kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyon
<ol><li>DNA çekme--dan küçük değişiklikler ile FFPE DNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak TIC veya FFPE doku örnekleri gerçekleştirin. FFPE DNA ekstraksiyon adım için eşdeğer bir takımdır.</li>
	<li>Doku lizis arabelleği 180 µL eklemek (pH = 8,3) el ile 200-µL pipet ile film içeren microcentrifuge Tube. 5 için maksimum hızda (yaklaşık 2500 rpm) bir girdap karıştırıcılı vortexing tarafından İndinavir K bir el ile 20 µL pipet ve karıştırmak ile 20 µL eklemek s.</li>
	<li>56 ° C'de örnekleri gecede bir hava kuluçka ile kuluçkaya.</li>
	<li>90 ° c ısı blok için 1 saat 10 dk, FFPE ve TIC örnekleri sırasıyla kuluçkaya. Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.</li>
	<li>200 µL lizis arabelleği için örnek bir 200-µL pipet ve karıştırmak ile iyice vortexing 5 için maksimum hızda tarafından ekleyin s.</li>
	<li>Etanol (96-%100) 200-µL pipet ile 200 µL ekleyip iyice karıştırın kısaca 5 için maksimum hızda vortexing tarafından s. spin microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.</li>
	<li>Dikkatle 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun için tüm lysate aktarma</li>
	<li>Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.</li>
	<li>Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin</li>
	<li>Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.</li>
	<li>Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin</li>
	<li>Akış-aracılığıyla bir plastik atık kutusuna içeren koleksiyon tüp atmak. Spin sütun eldivenli ellerle temiz 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 20.000 x g 3 dk membran kuruması için 25 ° c de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Spin sütun bir DNA-düşük bağlama tüp eldivenli ellerle yerleştirin.<ol>
<li>40-50 µL elüsyon arabelleği membran 100 µL pipet ile Merkezi ekler.</li>
		<li>5 min ve 25 ° C'de 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj için oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>DNA örnekleri-20 ° c (protokol burada duraklatılmış) sonraki adım kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. nicel gerçek zamanlı PCR ile DNA kalitesinin tahmini
<ol><li>Aşağıdaki gibi bir pipet ile steril microcentrifuge tüp ana karışımda hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon boyutu: 87 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.</li>
	<li>Bir steril microcentrifuge tüp ikinci ana karışımda gibi hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon Boyut: 268 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.</li>
	<li>Seri dilutions (kit ile sağlanan) insan kontrolü genomik DNA'ın beş maddelik standart eğri için 4 kez gerçekleştirmek ve mutlak DNA konsantrasyonları13belirlemek.</li>
	<li>19 µL iki hazır ana karışımları (4.1 ve 4.2 adımda hazırlanan) bir optik 96-iyi tepki plaka 20 µL pipet ile ayrı kuyu içine ekleyin.</li>
	<li>FFPE DNA veya TIC DNA 2-µL pipet ile reaksiyon karışımı içeren wells ayırmak için 1 µL ekleyin. Hiçbir şablon kontrolü için tepki karışımı içeren ayrı bir kuyuya 1 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.</li>
	<li>Optik bir yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma. Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.</li>
	<li>96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s 2000 devirde oda sıcaklığında. Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip s,</li>
	<li>DNA (göreli miktar; oranıyla DNA fragmantasyonu değerlendirmek RQ) elde edilen uzun amplicon için (268 bp) kısa amplicon için (87 bp). RQ kısa amplicon13uzun amplicon / ortalama değeri ortalama değeridir.</li>
</ol>5. bir sonraki nesil sıralama kitaplığı hazırlanması
<ol><li>Sıralama kitaplığı üreticinin yönergeleri doğrultusunda sonraki nesil sıralama için hazır olun.</li>
	<li>Steril microcentrifuge tüp örnek başına çoklu PCR ana karışımda gibi hazırlamak: 4 µL Multiplex PCR reaksiyon çözüm, 4 µL astar Havuzu, ≤6 µL TIC veya FFPE DNA (1-100 ng), x 5 x 5 ve 20 µL kadar nükleaz ücretsiz su ekleyin.<ol>
<li>Çoklu PCR ana karışımı bir PCR tüp için hafifçe tüp dokunarak ekleyip karıştırın.</li>
		<li>Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 99 ° C için 2 dk, 99 ° C 20 döngüsü tarafından takip için 15 s ve 60 ° C 4 dk ve holding için adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında. Not: astar çiftleri sayısına göre devir sayısını belirleyin.</li>
	<li>PCR tüp kapağını açın ve restriksiyon enzimi 2-µL pipet ile 2 µL ekleyin. Kapağı PCR tüp ve karışımı yavaşça PCR tüp dokunarak Giriş Paneli'ni kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 10 min, 55 ° C 10 min, 60 ° C 20 dk için için için 50 ° C ve holding adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Her şey bir pipet ile sindirilir PCR amplicons aşağıdaki gibi içeren içine adaptörü ligasyonu ana karışımı ekleyin: 4 µL adaptör ligasyonu çözüm, barkod 0.5 µL, 0.5 µL bağdaştırıcısının, nükleaz ücretsiz su 2 µL ve DNA ligaz 2 µL. PCR tüp ve mix kapağı hafifçe dokunarak kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 30 dk, 5 dk, 5 dk, 72 ° C için 68 ° C için 22 ° C ve holding adım 10 ° c</li>
	<li>Sıralama kitaplığı üreticinin talimatlarına göre manyetik boncuklar ile arındırmak.</li>
	<li>Adaptör bakmaksızın kitaplığı Çözüm 1.5 mL DNA düşük-bağlama tüp içine aktarın. Manyetik boncuklar 45 µL 1st arıtma için DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA-düşük bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>5.11 ikinci bir yıkama için yineleyin.</li>
	<li>Kısaca 5 için 1.500 x g de mini santrifüj ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.</li>
	<li>Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>50 µL süpernatant, yeni DNA düşük-bağlama tüp içine aktarmak ve manyetik boncuklar 2nd arıtma 100 µL pipet ile 75 µL ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>5,18 için ikinci bir yıkama arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.</li>
	<li>Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Yeni DNA düşük-bağlama tüp 100 µL pipet ile içine arıtılmış kitaplığı içeren süpernatant ile 45 µL aktarın.</li>
</ol>6. Kütüphane konsantrasyon nicel gerçek zamanlı PCR tarafından ölçmek
<ol><li>Her kitaplık üreticisinin yönergeleri13göre konsantrasyonu belirlemek.<ol>
<li>Aşağıdaki gibi bir 20-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 2 µL arıtılmış Kütüphanesi ve nükleaz ücretsiz su bir DNA düşük-bağlama tüp 38 µL 2-µL ve 100 µL pipet ile karıştırın.</li>
		<li>-20 ° c su katılmamış kitaplıkları adım 7,3 kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki gibi bir 200-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 20-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.1 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi bir 2,000-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 200-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.2 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi tepki ana karışım hazırlamak: 2 ana mix çözüm x 10 µL ve astar-sonda tahlil çözüm steril microcentrifuge tüp x 20 1 µL bir pipet ile karıştırın, sonra karışımı tüp dokunarak. 11 µL optik bir 96-şey reaksiyon kuyu içine tepki ana karışımı ekleyin.</li>
	<li>Her şey 10 µL pipet ile 9 µL 2,000-fold seyreltilmiş Kütüphanesi, standart her denetimin 9 µL veya 9 nükleaz ücretsiz su µL ekleyin.</li>
	<li>Optik yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma.<ol>
<li>Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.</li>
		<li>96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s, oda sıcaklığında.</li>
		<li>Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 50 ° C için 2 dk, 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip s,</li>
	<li>Su katılmamış Kütüphane konsantrasyon qPCR ile 2.000 tarafından belirlenen konsantrasyon çarparak hesaplar.</li>
</ol>7. sonraki üretimi sıralaması
<ol><li>Çalışma durum planı ve yazılım içinde çalışma parametresini ayarlayın.<ol>
<li>[Planı sekmesini] ve [] şablon ve uygun çalışma yöntemini seçin.</li>
		<li>Uygulama ve teknik türü seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Enstrüman, örnek hazırlama takımı (isteğe bağlı), kitaplığı seti türü, şablon seti, sıralama seti seçin, kalibrasyon modu temel, türü chip, sıra (isteğe bağlı) ve barkod kümesi kontrol ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Eklentileri seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Projeyi seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Varsayılan başvuru ve hedef bölgenin yatak dosyaları seçin.</li>
		<li>Örnek adı yazın, barkod seçin ve [planı Run]'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şablon hazırlama gerçekleştirmek ve üreticinin yönergelerine göre otomatik bir araç yükleme çip. Reaktif kartuşu kullanmadan önce 45 dk için oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Su katılmamış kütüphanede 6,8 adımda hesaplanan Kütüphane konsantrasyon göre nükleaz ücretsiz suyla seyreltik ve 20 pM kitaplıkları olun.<ol>
<li>Havuza alınan bir kütüphane sıralama ve buz üzerinde mağaza hazırlayın.</li>
		<li>100 µL pipet ile havuza alınan Kütüphanesi 25 µL örnek tüp altýna ekleyin. 48 saat içinde havuzlu kitaplığı kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Güç ve otomatik araç kapağını açın.<ol>
<li>Sıralama çip, fiş adaptörü, zenginleştirme kartuş, ipucu kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu otomatik araç uygun konuma yerleştirin.</li>
		<li>Dokunmatik çalışma [Kurulum] ve [adım adım] üstünde belgili tanımlık perde.</li>
		<li>Kapağı kapatın ve [Başlat onay] dokunmatik ekran üzerinde.</li>
		<li>Sonra güverte tarama işlemini, [ileri] dokunmatik ekran üzerinde.</li>
		<li>(Kit, yonga türü, çip ID, örnek kimliği, planları) ekran içeriğini denetleyin, saati ayarlamak ve [OK] dokunmatik ekran üzerinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çip yükleme bittikten sonra:<ol>
<li>[İleri] dokunmatik ekran üzerinde ve kapağını açın.</li>
		<li>Sıralama küçük parça--dan fiş adaptörü eldivenli ellerle kaldırıldı.</li>
		<li>Çip çip kapsayıcıya yerleştirmek rap parafilm ve sıralama tepki kadar 4 ° C'de mağaza ile.</li>
		<li>Zenginleştirme kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu eldivenli ellerle otomatik enstrümanın uygun konumdan kaldırıldı.</li>
		<li>Bir boş-ipucu kartuş otomatik araç eldivenli elleri ile atık ipucu konumunu aktarın.</li>
		<li>[İleri] dokun ve kapağı kapatın.</li>
		<li>[Başlat] dokunma ve 4 dk için ultraviyole ışınları tarafından otomatik araç temiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultrasaf su ve filtre çözüm 0,22-µm filtre akış filtresi birimi olan 1000 ml sodyum klorit tablet geçiyoruz.<ol>
<li>Sıralama araç gücüyle.</li>
		<li>Dokunma [temiz] ve [ileri] sıralama enstrümanın ekranda.</li>
		<li>Sıralama araç 250 mL filtre sterilize sodyum klorit çözüm ve daha sonra 250 mL ultrasaf su ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>[Başlat] dokunun ve ekrandaki uygun sıralama seti seçin.<ol>
<li>Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.</li>
		<li>(Kit ile sağlanan) yıkama çözüm, (100 mM sodyum hidroksit 350 µL içeren) pH ayarlama çözüm ve (kit ile sağlanan) pH standart çözüm ile sıralama aracı başlatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Kit ile sağlanan) dATP, dGTP, dCTP ve dTTP nükleotit (Seti'nde sağlanan) 50 mL tüpler 20 µL 100 µL pipet ile ekleyin.<ol>
<li>Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.</li>
		<li>50 mL tüp ve vida sıralama araç üzerine yükleyin.</li>
		<li>[İleri] dokunmatik ekran üzerinde yaklaşık 25 dakika sürer başlatma adım başlamak için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başlatma adımı tamamladıktan sonra:<ol>
<li>[Run] dokunmatik ekran üzerinde ve uygun Kütüphane hazırlık aracı seçin.</li>
		<li>Çipin iki boyutlu barkod tarama.</li>
		<li>Uygun konumu sıralama çipte yerleştirin.</li>
		<li>Çip kelepçe ve enstrüman kapıyı kapat.</li>
		<li>[Çip onay] [ileri], dokunma ve [sıralama çalışma başlatmak için ekrandaki OK].</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıralama reaksiyon sonra veri aktarımı ve veri analiz boru hattı üzerinde sıralama sunucu13,17gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Path+to+Cancer+-+Three+Strikes+and+You%27re+Out%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out.</a> N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).</li>
<li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome+atlas+pan-cancer+analysis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The cancer genome atlas pan-cancer analysis project.</a> Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li>
<li>Nagasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variant+discovery+by+deep+whole-genome+sequencing+of+1%2C070+Japanese+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals.</a> Nat Commun. 6 (8018), (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genome+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer genome landscapes.</a> Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).</li>
<li>Zehir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+landscape+of+metastatic+cancer+revealed+from+prospective+clinical+sequencing+of+10%2C000+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients.</a> Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).</li>
<li>Garraway, L. A., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+the+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from the cancer genome.</a> Cell. 53 (1), 17-37 (2013).</li>
<li>Chalkley, R., Hunter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-histone+propinquity+by+aldehyde+fixation+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).</li>
<li>Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixation+on+the+amplification+of+nucleic+acids+from+paraffin-embedded+material+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction.</a> J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>Adhya, A. K., Mohanty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+touch+imprint+cytology+in+the+preoperative+diagnosis+of+malignancy+in+low+resource+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting.</a> Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).</li>
<li>Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+Imprint+Cytology+and+Frozen-section+Analysis+for+Intraoperative+Evaluation+of+Sentinel+Nodes+in+Early+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer.</a> Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).</li>
<li>Sumiyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+intraoperative+touch+smear+cytology+in+breast-conserving+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery.</a> Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).</li>
<li>Amemiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+imprint+cytology+with+massively+parallel+sequencing+%28TIC-seq%29%3A+a+simple+and+rapid+method+to+snapshot+genetic+alterations+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors.</a> Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+multiple+lung+cancers%3A+Discrimination+between+primary+and+metastatic+lung+cancers+by+genomic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile.</a> Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+tumor-derived+DNA+dispersed+in+the+airway+improves+the+diagnostic+accuracy+of+bronchoscopy+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer.</a> Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, tümör DNA TIC kullanarak klinik patolojik numunelerin elde etmek için alternatif bir yöntem mevcuttur. TIC hazırlık çok basittir ve FFPE yöntemleri, özel aletleri10zorunluluğu olmadan ile karşılaştırıldığında daha az zaman ihtiyacı var. TIC hazırlık DNA ekstraksiyon için yordamlar (şekil 1) iki gün içinde tamamlanabilir. Bu yöntem böylece genetik test gerçekleştirmek için geri dönüş süresini kısaltır. Özellikle, bu moleküler analiz için gereken gün sayıs...

Yeni nesil sıralama teknolojisi araştırmacılar genetik varyasyonları, Mendel hastalığı, kalıtsal yatkınlık ve kanser 1,2,3 genom bilgileri analiz önemli gelişmeler sağlamıştır . Kanser genom Atlas (TCGA) ve uluslararası kanser genom Konsorsiyumu (ICGC) genetik değişiklikler çeşitli yaygın kanserlerin4tanımlaması yakalamışlardır. Temel kanser sürücü genler yüzlerce başarıyla tespit edilmiştir ve bu moleküllerin bazıları ilaç geliştirme1,5,6için hedef alınmaktadır.
Klinik ortamda FFPE numuneler Patolojik tanı ve moleküler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için test için yaygın olarak kullanılır. Ancak, formalin ile fiksasyon sürecinde DNA-protein veya DNA-DNA cross-linking oluşur ve DNA fragmantasyonu indüklenen. Böylece, FFPE DNA örnekleri her zaman düşük kalite ve miktar DNA7,8,9nedeniyle genetik analiz için uygun değildir. Ayrıca, o FFPE numuneler hazırlamak için birkaç gün sürer ve teknik beceri doğru bölümleri hazırlamak gereklidir. Bu nedenle, bu yüksek kaliteli bozulmamış DNA elde etmek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirmek için arzu edilir.
Sitoloji Patolojik tanı için alternatif bir yöntemdir. Daha basit, daha az pahalı ve daha hızlı yaklaşım FFPE hazırlık10ile karşılaştırıldığında saytolojik örnek hazırlıktır. TIC tekniği sentinel lenf düğümleri ve meme kanserli hastalarda bir yıl11,12için intraoperatif hızlı tanı için marjinal dokulardan yapıldı. Ancak, yüksek kaliteli genomik DNA-ebilmek var olmak hulâsa TIC örnekler incelenmiştir ve sonraki genetik analiz için kullanılan birkaç raporları vardır. Saytolojik örnekler yaygın özelikle (Pap) veya Giemsa boyama ile lekeli ve biz daha önce miktarı ve kalitesi TIC örnekler (özellikle Giemsa lekeli örnekleri) çıkarılan DNA'ın FFPE elde edilen örnekler daha üstün olduğunu bildirdi doku13. PAP boyama ile karşılaştırıldığında, Giemsa boyama boyama daha az prosedürleri gerektiren bir avantaja sahiptir. Sonra örnekleri sabit ve lekeli, Pap boyama, onlar orta (örneğin, Malinol) tümör hücreleri, normal hücreleri ve inflamatuar hücrelerin mikroskop altında gibi örnek içeriği ayırt için montaj ile monte edilmesi gerekir. Pap numune montaj adım hazırlanan örnek kurutulur çünkü hücrelerin mikroskop altında gözlemlemek neredeyse imkansız. İçinde karşılaştırma, Giemsa boyama kurutulmuş durumda görülebilir, bu nedenle, montaj adım hızlı hücresel değerlendirme için gerekli değildir. Kuru numune gerektirdiğinden mikrodiseksiyon için Giemsa boyama daha uygundur.
Bu raporda, biz Giemsa boyama ile TIC numunelerin hazırlanması için basit ve hızlı bir yöntem tanıtmak ve TIC FFPE numuneler ile karşılaştırıldığında DNA için daha iyi bir kaynak olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST white20 mikro sürgülü cam</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membran Cam Slaytlar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Hızlı A çözümü</td><td>Muto Saf Kimyasallar</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Hızlı B çözümü</td><td>Muto Saf Kimyasallar</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>Mayıs-Grunwald Çözümü</td><td>Muto Saf Kimyasallar</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa çözümü</td><td>Muto Saf Kimyasallar</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE doku kiti</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Hızlı Gelişmiş Master Mix</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P Algılama Reaktifleri Kiti</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>FFPE DNA QC Testi v2'den</td> <td>TaqMan TestiThermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optik Yapışkan Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>İyon Kütüphanesi TaqMan Kantitasyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>İyon AmpliSeq Kanser Sıcak Nokta Paneli v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Kütüphane Kiti 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress Barkod Adaptörleri 1-16 Takımı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>İyon PGM Hi-Q View Sıralama Kiti (200 taban)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>İyon Şef Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 kuyulu Termal Döngüleyici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>İyon 318 Çip Kiti v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>İyon PGM Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>İyon PGM Yıkama 2 Şişe kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt ve ticaret; AMPür ve ticaret; XP Kiti</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>16 konumlu Manyetik Stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmaz, RNaz içermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL (Düşük bağlayıcı tüp)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp ve ticaret; Optik 96 kuyulu Reaksiyon Plakaları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp & trade; Şeffaf Yapışkan Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt & trade; AMPür ve ticaret; XP Kiti</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (10M)</td> <td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>küçük değişim</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>Mini santrifüj</td></tr><tr><td>küçük inkübatör</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Hava inkübatörü</td></tr><tr><td>SensiCare Pudrasız Nitril Muayene Eldivenleri</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Steril gazlı bez</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Buzdolabı MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>TÜY DÜZELTME BLAD</td><td>TÜY</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>TÜY DÜZELTME BLAD</td><td>TÜY</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>TÜY S</td><td>TÜY</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Vorteks karıştırıcı</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrotüp</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

yüksek kaliteli tümör dna klinik-patolojik numunelerin touch künye sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Yönetim ve belirli moleküler hedefli uyuşturucu tedavisi kanser hastaları için önce kanser mutational durumunu belirlemek için önemlidir. Klinik ortamda parafin gömülü (FFPE) doku formalin sabit genetik test etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, FFPE DNA genellikle zarar görmüş ve formalin ile fiksasyon işlemi sırasında parçalanmış. Bu nedenle, FFPE DNA bazen düşük kalite ve DNA miktarı nedeniyle genetik test için yeterli değildir. Burada mikroskop altında gözlenen dokunmatik Künye Sitoloji (TIC) genomik DNA kanser hücrelerinden elde etmek için bir yöntem mevcut. Hücre morfolojisi ve kanser hücre sayıları TIC numuneler kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, genomik DNA ekstraksiyon TIC örneklerinden iki gün içinde tamamlanabilir. Toplam miktar ve kalite TIC bu yöntemi kullanarak elde edilen DNA FFPE DNA daha yüksek. Araştırmacılar yüksek kaliteli DNA (örneğin, sonraki nesil sıralama analizi, dijital PCR ve nicel gerçek zamanlı PCR) genetik test için elde etmek için ve sonuçları raporlama için dönüş süresini kısaltmak için bu hızlı ve basit bir yöntem sağlar.

Şekil 1 TIC numuneler DNA ekstraksiyon için hazırlanıyor üzerinden tüm süreci gösterir. Özellikle, yordamı genomik DNA TIC örneklerinden elde etmek için sadece iki gün alır. Biz herhangi bir etkisi tümör depolama slayt işlemeden önce değerlendirildi. Tümör hücreleri doku örnekleri hemen slayt dokundu vardı ve dokular serum fizyolojik nemli steril-gazlı bez için 1 h (Şekil 2) tutuldu cam slayt bağlı olduğunu bulduk. Dokulara oda s...

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Bu protokolün genel amacı, klinik örneklerden yüksek kaliteli tümör DNA'sı elde etmektir. Bu yöntem, kanser araştırması, tanı ve tedavi kararları gibi temel ve klinik bilimlerdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tümör DNA'sını önceki yöntemlere göre daha basit ve hızlı bir şekilde elde edebilmemizdir.Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış ve rezeke edilmiş bir dokunun tümör yüzeyine eldivenli ellerle birkaç kez normal bir cam slayt üzerine dokunun. Dokunulan alanın cam sürgünün %80'inden fazlasını kapladığını görsel olarak onaylayın. Normal cam sürgüyü bir Polietilen Naftalat veya PEN membran sürgüsüne hafifçe bastırın ve eldivenli ellerle iki ila üç kez hafifçe ovalayın.Hücrelerin normal cam slayttan PEN membran slaytına aktarıldığını görsel olarak onaylayın. Hem camı hem de PEN membran slaytlarını oda sıcaklığında beş dakika havayla kurutun. Kuruduktan sonra, doğrudan sitolojik inceleme için normal cam slaytı boyayın.Cam slaytları beş saniye boyunca sabitleyici solüsyona batırın ve ardından 15 saniye boyunca Giemsa boyama solüsyonu ile boyayın. Hızlı değerlendirme için normal cam slayt üzerindeki tümör içeriğini ve hücreselliği tamamen bir mikroskopla değerlendirin ve tarayın. Tümör hücrelerini çeşitli kriterlere göre değerlendirin.Numune, önceki bölümden hızlı mikroskobik değerlendirme ile %60'ın üzerinde tümör hücreselliği gösteriyorsa, DNA ekstraksiyonu için PEN membran slaytlarının tümöre dokunmuş filmini bir bıçak ve eldivenli ellerle kesin. Kesilen filmi bir pim seti ve eldivenli ellerle steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Film içeren mikrosantrifüj tüpünü DNA ekstraksiyonuna kadar dört santigrat derecede saklayın.Yazılımı açın ve çalışma koşulunu planlayın ve yazılım içinde çalıştırma parametresini ayarlayın. Plan sekmesine tıklayın ve şablonu seçin, ardından uygun çalıştırma yöntemini seçin. Uygulama ve teknik türünü seçin ve ileri'ye tıklayın.Cihazı, numune hazırlama kitini, kitaplık kiti türünü, şablon kitini, sıralama kitini, temel kalibrasyon modunu, çip tipini, kontrol sırasını ve barkod setini seçin ve ileri'ye tıklayın. Eklentileri seçin ve ileri'ye tıklayın. Projeyi seçin ve ileri'ye tıklayın.Ardından, hedeflenen bölgenin varsayılan referansını ve BED dosyalarını seçin. Örnek adını yazın, barkodu seçin ve çalıştırmayı planla'ya tıklayın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre otomatik bir cihazda şablon hazırlama ve talaş yükleme gerçekleştirin.Reaktif kartuşunu kullanmadan önce oda sıcaklığında 45 dakika çözdürün. Seyreltilmemiş kütüphaneyi, adım 6.8'de hesaplanan kütüphane konsantrasyonuna göre nükleaz içermeyen su ile seyreltin ve 20 pikolar kütüphane yapın. Sıralama için havuzlanmış bir kitaplık hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.Numune tüpünün altına 100 mikrolitrelik bir pipet ile havuzlanmış kitaplıktan 25 mikrolitre ekleyin. Gücü açın ve otomatik cihazın kapağını açın. Sıralama çipini, çip adaptörünü, zenginleştirme kartuşunu, uç kartuşunu, PCR plakasını, PCR çerçeve contasını, geri kazanım tüpünü, çözelti kartuşunu ve reaktif kartuşunu otomatik cihazın uygun konumuna yerleştirin.Dokunmak, ayarlamak, çalıştırmak ve ekranda adım adım. Kapağı kapatın ve ekranda kontrolü başlat'a dokunun. Güverte tarama işleminden sonra ileri'ye dokunun.Ekran içeriğini, kit tipini, çip kimliğini, numune kimliğini, çip türünü, planları kontrol edin. Saati ayarlayın ve Tamam'a dokunun. Talaş yüklemeyi bitirdikten sonra ileri'ye dokunun ve kapağı açın. Eldivenli ellerle sıralama çipini çip adaptöründen çıkarın.Çipi çip kabına yerleştirin, parafilm ile sarın ve dizileme reaksiyonuna kadar çipi dört santigrat derecede saklayın. Ardından zenginleştirme kartuşunu, PCR plakasını, PCR çerçeve contasını, geri kazanım tüpünü, çözelti kartuşunu ve reaktif kartuşunu eldivenli ellerle otomatik cihazın uygun konumundan çıkarın. Boş bir uç kartuşunu eldivenli ellerle otomatik cihazın atık uç konumuna aktarın.İleri'ye dokunun ve kapağı kapatın. Ardından başlat'a dokunun ve otomatik cihazı ultraviyole ışınlarıyla dört dakika boyunca temizleyin. Bir sodyum klorit tableti 1.000 mililitre ultra saf suda çözün ve çözeltiyi 0.22 mikronluk bir filtre ile filtreleyin.Sıralama aleti ısındıktan sonra, sıralama enstrümanının ekranında temize ve ileri'ye dokunun. Sıralama aletini 250 mililitre filtreyle sterilize edilmiş sodyum klorit çözeltisi, ardından 250 mililitre ultra saf su ile temizleyin. Ardından başlat'a dokunun ve ekranda uygun sıralama kitini seçin.Eldivenli ellerle gri bir nakliyeci takın. Sıralama cihazını yıkama solüsyonu, pH ayarlama solüsyonu ve pH standart solüsyonu ile başlatın. Ardından, 100 mikrolitrelik bir pipetle 50 mililitrelik tüplere 20 mikrolitre DATP, DGTP, DCTP ve DTTP nükleotidi ekleyin.Eldivenli ellerle uygun yere gri bir gönderici takın. 50 mililitrelik tüpü yükleyin ve sıralama aletine vidalayın. Başlatma adımını başlatmak için ekranda ileri'yi seçin.Başlatma adımını tamamladıktan sonra, ekranda çalıştır'a dokunun ve uygun kitaplık hazırlama aracını seçin. Çipin iki boyutlu barkodunu tarayın. Sıralama çipini uygun konuma yerleştirin.Çip kelepçesini ve alet kapağını kapatın ve sıralama çalıştırmasını başlatmak için ekranda talaş kontrolü, ardından ve Tamam'a dokunun. Sıralama reaksiyonundan sonra, verileri aktarın ve sıralama sunucusunda veri analiz boru hattı gerçekleştirin. Mutlak DNA miktarları ve genomik DNA'nın bozunma seviyesinin bir göstergesi olan RQ değeri, FFPE örneklerine kıyasla TIC örnekleri kullanılarak daha yüksek bir DNA verimi elde edildiğini göstermektedir.Ek olarak, TIC DNA'dan elde edilen RQ değerleri, farklı tümör tiplerinde FFPE DNA'nınkine kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. APC Q1367*, birinci bölgeden ekstrakte edilen hem FFPE hem de TIC DNA'da ve APC S1356*KRAS G12D'de tanımlandı ve TP53 M237i, iki, üç ve dördüncü bölgeden ekstrakte edilen hem FFPE hem de TIC DNA'da tespit edildi, bu da aynı tümör bölgesinden hazırlanan eşleştirilmiş FFPE ve TIC DNA örneklerinde aynı somatik mutasyonların tanımlandığını düşündürmektedir. Özellikle, primer kolorektal kanser ile iki metastatik karaciğer kanseri örneği arasında aynı somatik mutasyonlar tespit edildi, bu da tümörün ikinci bölgeden karaciğere metastaz yaptığını düşündürdü.Geliştirildikten sonra bu teknik, moleküler ve tıbbi araştırmalar alanındaki araştırmacıların genetik kanserleri tanımlamasının önünü açtı.

simple-rapid-method-to-obtain-high-quality-tumor-dna-from-clinical

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü biyopsi dokusunda sitomegalovirüsün qPCR tespitini tanımlar, bu da hızlı, hassas, spesifik ve belirsiz hematoksilen ve eozin veya immünohistokimyasal boyama paternlerini yorumlamak için yararlıdır.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

Bu protokol, çeşitli normal ve malign insan dokularında bulunan CD45+ hücrelerinin (lenfositler/lökositler) kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için taze insan doku fragmanlarının hızlı enzimatik olmayan ayrışmasını tanımlar. Ek olarak, birincil doku homojenatından elde edilen süpernatant, daha fazla analiz veya deney için toplanabilir ve saklanabilir.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

Burada mevcut olan biyo-parçacıkların toplanması için, optimize edilmiş ve etkin bir temizleme stratejisi tarif tek-aşamalı bir 5 ul mikro hacim liziz / STR amplifikasyon içeren geliştirilmiş bir amplifikasyon protokolü ile birlikte numune 'DNA dokunun', bir geri kazanıma müsaade etmek kısa tandem tekrarı (STR) biyo-parçacık verici (ler) profilleri.

Adli &#39;Dokunmatik DNA&#39; Kanıt dan Basitleştirilmiş mikromanipulasyon tarafından Kurtarılan Tek İnsan Bioparticles geliştirilmiş Genetik Analiz

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Kutanöz tümörler genellikle Mohs mikrografik ameliyattan sonra atılır. Klinik destek personelinin klinik operasyonlara müdahale etmeden, aşağısındaki laboratuvar uygulamaları için kutanöz tümörün ( örn., Skuamöz hücreli karsinoma, bazal hücreli karsinoma ve melanom) örneklerini etkili bir şekilde işleyip saklayabilmesini sağlayan bir protokol açıklanmaktadır.

Kliniğe Dayalı Biyorepositoryum Kurulması

Tümör hücreleri ayırdetmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Biz DNA Floresan -in-situile ayirt kombine-functionalized tıbbi tel CTCs doğrudan hasta kandan zenginleştirici vivo içinde kabil tarafından yakalanan hücre değerlendirmek için hibridizasyon.

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Bu protokol, formalin sabit parafin gömülü doku örneklerinin yüzde tümör içeriğini artırmak için bir yöntem sunar.

Tümör Makrodiseksiyonu ile Tümör İçeriğinin Arttırılması

Öğrenin, tümör dokularından yüksek kaliteli genomik DNA elde etmek için dokunma izi sitolojisi yöntemini. Bu teknik, kanser araştırmalarında genetik analizi hızlandırır ve basitleştirir.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Daha fazla video keşfet