Name: Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Öğrenin genetik olarak kodlanmış fluorojenik sensörlerle canlı hücre görüntüleme yöntemini kullanarak toksikolojik oksidatif stresi değerlendirmeyi. Bu teknik yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar deneysel tasarım ve el yazması düzenlemeleri konusunda yardım almak için Katelyn Lavrich teşekkür etmek istiyorum.

1. hücre hazırlanması
Not: Bu yordam bir ölümsüzleştirdi hücre hattı (BEAS-2B; lentiviral iletim açıklar. İstenen muhabir (roGFP2 veya HyPer) ifade etmek için ATCC, Manassas, VA). Onlar gazeteci ifade görüş alanı (genellikle 5-10 hücreleri) başına sensör ifade hücreleri yeterli sayıda görselleştirmek yeterli bir düzeyde neden olduğu sürece diğer hücre hatları/tipleri ve/veya gen transferi, transfection, dahil yöntemleri kullanılabilir. Eğer transfection yöntemleri kullanarak, yordam sonuçta analiz yöntemi için kullanılan çanak uygulanmalıdır (örneğin, transfect için mikroskop-ecek var armağan aynı çanak hücreleri). Aşağıda açıklanan adımları bir 6-şey hücre kültür tabağına gerçekleştirilecek hücre transductions hazırlamak için ayrıntılı bilgi sağlar. Bu biçimi istediğiniz uygulama için uygun bir boyut yoksa, diğer gemilerin yedek olabilir.
<ol><li>Yaklaşık % 40-60 izdiham normal büyüme medya için hücreleri büyümek. Not: Bu çalışmada insan bronş epitel hücre kültürünü, BEAS-2B, keratinosit büyüme orta (KGM) yetiştirilen kullanılmaktadır.</li>
	<li>İletim önce ile 500 µL serum-Ücretsiz medya virüs, formül tarafından hesaplanan olarak uygun miktarda içeren hücrelerde büyüme ortamı değiştirin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq1.jpg"><ol>
<li>İçin iletim BEAS-2B hücre serum-Alerjik keratinosit Bazal orta (KBM) sırasında viral incubations KGM büyüme ortamı değiştirmek için kullanın. Not: Bir şey hücre bir 6-iyi biçimde tek bir iletim için yukarıdaki bir hesaplamasıdır. Gerekirse, transductions birkaç gerçekleştirmek wells gerçekleştirilen bir çarpma transduced için kuyu sayısına göre formülle ayarlayarak. Lentiviral transductions için enfeksiyon (MOI) 5 ile 20 arasında bir çeşitlilik kullanın. Adenoviral transductions için 100 ile 500 arasında bir MOI kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreler için 4 tabak kısa bir sallanan ile her 30-60 dk içinde viral parçacıkların yeniden dağıtma veya hareket dönen h, 37 ° C'de viral karışımı ile kuluçkaya.</li>
	<li>Yemek için tam büyüme ortamının 1 mL ekleyin ve bir ek 4-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Tüm medyayı çıkarın ve taze tam büyüme ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>Devam büyümek ve hücreleri geçiş gerektiği gibi genişletin. Not: Kayda değer içinde 12-48 h sensör ifade hücreleri başlamak. Lentiviral bir vektör iletim için kullanıldıysa, istenen sensörün istikrarlı ifade arasında geçişler devam etmelidir.</li>
	<li> </li></ol><ol><li></li><li></li><li><li> </li><li><li> </li><li><ol><li> </li></ol></li><li> </li><li><ol><li> </li><li> </li><li></li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li></ol></li><li> <ol><li></li><li></ol></li><li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq3.jpg"></li><li><li><li></li><li> </li></ol>

Bu makalede açıklanan Araştırma Ulusal Sağlık ve çevre etkileri Araştırma Laboratuvarı, ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından gözden geçirilmiş ve yayın için onaylanmış. Bu makalenin içeriğini ajansı ilke temsil etmek üzere alınmamalıdır, ne de ticari adlar veya ticari ürünler söz ciro veya kullanım için tavsiye teşkil etmez.

İçinde hafiye değişiklikler hücre içi EGSH ve H2O2, sırasıyla, roGFP2 ve HyPer kullanımı önceki fizyolojik ve toksikolojik çalışmalar 25,35,36 iyi tarif olmuştur ,39,40,41,42,43. Burada özetlenen Protokolü xenobiotic kaynak...

"Oksidatif stres" sık sık toksikoloji, bir mekanizma olarak gösterildi henüz nadiren terimdir bu terimi özellikle açıklanmıştır. Oksidatif stres Reaktif oksijen türleri, antioksidan moleküllerin oksidasyonu serbest radikallerin neden olduğu hasar nesil de dahil olmak üzere birkaç hücre içi işlemler için başvuruda bulunabilir ve belirli sinyal bile aktif basamaklandırır. Oksidatif stres ya da doğrudan eylem tarafından xenobiotic tesisin5 ikna etmek için belgelenen çevre kirletici1,2 ve ilaç ajanlar3,4 geniş bir yelpazesi ,6 veya ikincil olarak hücresel yanıt7,8,9,10parçası olarak oksidan türlerin üretimi. Bu nedenle doğru gözlemlemek ve olumsuz sonuçlara yol önde gelen oksidatif süreçleri karakterize toksikoloji büyük ilgi. Oksidatif stres ölçme geleneksel yöntemlerle oksitlenmiş biomolecules11,12,13,14,15 veya antioksidan16 kimliği içerir ,17,18,19,20veya reaktif türler kendilerini21,22,23, doğrudan ölçümü 24. Ancak, bu yöntemler genellikle kez örnek tüketir, Uzaysal çözünürlük ortadan kaldırır ve potansiyel olarak eserler25tanıştırmak hücresel bozulma, gerektirir. Oksidan türler tespiti ve oksidatif stres işaretleri için daha hassas ve belirli yöntem geliştirme genel olarak xenobiotic maruz kalma yan etkilerinin incelenmesi için geçerlidir.
Yeni nesil fluorogenic genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak live-cep mikroskobu canlı hücreler hücre içi Redoks durumunun izlenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu sensörler genellikle bir vektör transfection veya iletim yöntemleri ile tanıtılan bir viral organizatörü kontrol altında kullanarak ifade edilir. Floresan sensör ifade hücreleri kolayca görsel olarak tanımlanabilir beri yüksek ifade verimliliği gerekli değildir. Toksikolojik değerlendirmeler için gerçek zamanlı olarak xenobiotic bileşikler maruz Floresans mikroskobu kullanılarak bu sensörler ifade hücreleri görülebilir. Bu deneysel tasarım aynı hücrede tekrarlanan ölçümler her hücrenin kurulan temel kendi kontrolü hareket etmeye izin verir. Canlı hücre görüntüleme tarafından tanınan yüksek zamansal çözünürlük oksidatif olaylar, özellikle de mütevazı büyüklüğü veya geçici doğada algılanması için çok uygundur. Hassas ve belirli hedef molekülleri olmasının yanı sıra, bazı bu sensörler Floresans iki dalga boylarında ışık kullanarak heyecanlı. Bu olay bu sensör ifade, hücre kalınlığı, lamba değişimleri gibi eserler nedeniyle gelen otantik sensör yanıtları ile ilişkili sinyal değişiklikleri muhakeme izin veren bir oranı olarak ifade edilecek floresan emisyon izin verir. yoğunluğu, photobleaching ve duyarlılık Floresans dedektörü26. Fluorogenic sensörleri kullanımı bir diğer avantajı onlar için geleneksel yöntemler25,26,27tarafından eşsizdir Uzaysal çözünürlük düzeyi oluşturulmasını belirli hücresel kompartmanlarda yönlendirilebilir değil.
Yeşil flüoresan protein (GFP) göre genetik olarak kodlanmış sensörler büyük bir ailenin geliştirilmiş ve fizyolojik işaretleri, pH, sıcaklık, kalsiyum konsantrasyonu ve ATP/ADP oranı25 de dahil olmak üzere geniş bir çeşitlilik üzerindeki raporunda karakterize ,28,29,30,31. Bunlar arasında glutatyon Redoks potansiyeli (EGSH) ve hidrojen peroksit (H2O2) sensörler bulunmaktadır. Bu sensörler Redoks Biyoloji ve Tıp uygulamaları için geliştirilen iken, onlar da oksidatif stres xenobiotic kaynaklı çalışmaya adapte olmuştur. Özellikle, burada özetlenen Protokolü EGSH sensör roGFP2 ve H2O2 sensör HyPer kullanımını açıklar.
roGFP2 hücre içi azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) glutatyon peroksidaz (GPx), glutaredoxin (Grx) ve glutatyon redüktaz ilgili bir Redoks röle aracılığıyla Redoks potansiyeli (GR) (Resim 1)25, raporlar 32 , 33. glutatyon baskın hücresel antioksidan moleküldür ve öncelikle haliyle azaltılmış (GSH) sitozol25,34millimolar konsantrasyonlarda bulunur. EGSH işlev herhangi bir sonuca bağlı olmayan ise, hücre içi oksidatif durumu34önemli bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. GSSG konsantrasyonu nispeten küçük bir artış roGFP2 tarafından tespit EGSH artış sonuçlanır. Aynı derecede önemli, EGSH izleme xenobiotic pozlama sırasında roGFP2 kullanarak potansiyel olarak çok Redoks röle birkaç noktada etki mekanizması hakkında ortaya çıkarabilir ve Pentoz fosfat gibi ilişkili yollar (Resim 1 şönt )35. Burada tartışılan ikinci sensör, HyPer, bu sarı floresan protein (YFP) ekleme bakteriyel H2O2düzenleyici etki alanına türetilmiş hücre içi bir H2O2 sonda-hassas transkripsiyon OxyR136faktör. Her ne kadar bu daha önce zarar verici bir Reaktif oksijen ara olarak kabul edilmiştir, H2O2 giderek önemli bir hücre içi sinyal molekülü fizyolojik şartlarda37, altında olarak tanınır H2O2 için tanınmayan rolleri toksikoloji de bulunduğunu öne 38. Örneğin, aşırı H2O2 xenobiotic bir poz tarafından indüklenen hücresel sinyal veya bioenergetics bir kayma bozukluk habercisi olabilir.
Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri insan epidermoid Karsinomu hücre kültürünü A431 ve BEAS-2B EGSH ve H2 değişiklikleri gözlemlemek için insan bronş epitel hücre satırı da dahil olmak üzere birçok kurulan hücre hatlarında ifade edilmiştir O2 toksikolojik Etkilenmeler çeşitli yanıt olarak. Bunlar gaz halinde olan yakıtlar kirleticiler (ozon35), Partiküler madde (1,2 naphthoquinone39,40 ve çinko41) ve nikel nano tanecikleri (yayınlanmamış veri) çözünür bileşenler içerir. Bu çalışmalar bu iki sensörler olası uygulamaları yalnızca küçük bir bölümünün temsil eder. Teorik olarak, alma ve DNA'sı bu sensörler geleneksel moleküler biyoloji teknikleri ile ifade etme özelliği olan herhangi bir hücre tipi hücresel oksidatif durumu değiştirmek için şüpheli xenobiotics etkilerini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bugüne kadar bir veya daha fazla bu sensörlerin ifade çeşitli prokaryot ve Ökaryotlar, dahil birçok memeli, bitki, bakteri ve Maya hücre türleri25,26,36,42edilmiştir. Göstergesi EGSH ve H2O2 sensörleri için 510 yayılan floresan yoğunluğu bir değişimdir nm uyarma ile 488 ve 404 nm ışık üzerine. Bu yöntem mikroskobu (confocal ve geniş alanlı) ve plaka okuyucu türleri dahil olmak üzere Fluorometrik platformda yaygın olarak adapte olur. Burada sunulan yöntemi duyarlı ve spesifik hücre içi EGSH ve H2müşahede vitro toksikolojik sistemlerinde O2 sağlar.

<table><tbody><tr><td>roGFP2 Plazmid</td><td>Oregon Üniversitesi</td><td>N/A</td><td>S.J. Remington</td></tr><tr><td>HyPer Plazmid</td><td>Evrojen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>9,10-Feantrenequinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156507</td><td></td></tr><tr><td>Siyah Duvar Cam Tabanlı Tabaklar</td><td>Ted Pella</td><td>14029-20</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B hücre hattı</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit Bazal Orta</td><td>Lonza</td><td>192151</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit Büyüme Ortamı</td><td>BulletKit Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Office Suite</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR Görüntüleme Yazılımı</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1si Konfokal Görüntüleme Sistemi</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Oksidatif stres sık atıf toksikolojik mekanizması olmakla birlikte, eksiklikleri, örnek, potansiyel eserler getirilmesi ve özgüllük reaktif için eksikliği de dahil olmak üzere bir dizi üzerinde çalışmak için geleneksel yöntemler muzdarip türler dahil. Böylece, gözlemlemek ve hücre içi Redoks tedirginlikler, daha yaygın olarak anılacaktır oksidatif stresi ölçmek için kullanılan non-yıkıcı, hassas ve belirli yöntemleri için toksikoloji alanında geçerli bir ihtiyaç vardır. Burada, iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri, roGFP2 ve HyPer canlı hücre görüntüleme çalışmaları xenobiotic kaynaklı oksidatif yanıt-e doğru gözlemek için kullanılmak üzere, kullanımlar için bir yöntem mevcut. roGFP2 Sakinleştiği glutatyon Redoks ile potansiyel (EGSH), HyPer doğrudan hidrojen peroksit (H2O2) algılar. Her iki sensörleri çeşitli hücre tiplerinin transfection veya iletim yoluyla içine ifade ve belirli hücresel kompartmanlarda hedeflenebilir. En önemlisi, bu sensörler kullanarak live-cep mikroskobu geleneksel yöntemlerle mümkün değildir yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük sunar. Floresan yoğunluğu göstergesi için sırayla 404 tarafından heyecanlı zaman her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörler olarak 510 nm hizmet izlenen değişiklikleri nm ve 488 nm ışık. Bu özellik her iki sensörler ratiometric, ortak mikroskobu eserler ortadan kaldırmak ve sensör ifade hücreleri arasındaki farklılıkları için düzeltme yapar. Bu metodoloji Fluorometrik platformlarda confocal görüntüleme sistemleri, geleneksel geniş alanlı mikroskobu ve plaka ile kullanıma uygun yapım o reçete dalga boylarında, heyecan verici ve toplama emisyonlarının yetenekli genelinde uygulanabilir okuyucular. Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri hücre tipleri ve toksikolojik çalışmalar çeşitli hücresel EGSH ve H2O2 nesil gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Burada özetlenen Fluorometrik platformları için roGFP2 ve HyPer uygulama live-hücre toksikolojik Değerlendirmeler oksidatif stres ve hücre tipleri arasında yaygın olarak uyarlanabilir standart bir yöntemdir.

İçinde değişiklikleri EGSH ve hücre içi H2O2 ' hafiye roGFP2 ve HyPer kullanımı iyi olmuştur25,36,42,43 daha önce açıklanan ve burada gösterilmiştir. Confocal görüntüleri roGFP2 temel ve H2O2 ve DTT aşağıdaki ek ifade hücre Şekil 2' de gösterilmiştir. Veriler deney boyunca topla...

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Bu metodolojinin genel amacı, redoks homeostazında toksik madde kaynaklı bozulmaların spesifik değerlendirmesi için genetik olarak kodlanmış redoks sensörlerinin kullanımını sağlamaktır. Oksidatif stres ile kullanılan geleneksel yaklaşımların önemli sınırlamalarının üstesinden gelerek, bu yöntem toksikolojik oksidatif stres ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerde toksikolojik oksidatif stresi araştırmak için yüksek derecede özgüllük ve duyarlılığı benzersiz uzay-zamansal çözünürlükle birleştirmesidir.Deney süresi boyunca hücreler için uygun bir sıcaklık, nem ve/veya gaz konsantrasyonunu korumak için 404 ve 488 nanometrelerde lazer çizgileri ile donatılmış bir konfokal mikroskop ve çevresel kontroller kullanarak tüm görüntüleme analizlerini gerçekleştirin. Yüksek bağıl nem değerleri kullanılıyorsa, yoğuşmayı önlemek için nemlendirilmiş atmosferle temas edebilecek yüzeyleri nemin oluştuğu sıcaklıkta veya biraz üzerinde tutmak için objektif bir ısıtıcı ve/veya ısıtma bandı kullanın. Tüm mikroskop bileşenlerini açın ve 510 nanometrede emisyon ile 488 ve 404 nanometrede sıralı uyarma için gerekli tüm ekipmanı ayarlayın.Optik konfigürasyonun tüm bileşenlerinin gerçek zamanlı alım için uygun şekilde ayarlandığından emin olun. Sabit sıcaklığı 37 santigrat derece, %5 CO2 atmosferi ve %95'ten fazla nemde tutmak için sahne üstü bir çevre odası kurun. Görüntü alımına başlamadan önce, tüm çevresel kontrollerin ilk kurulumundan sonra çevre odasını en az 10 dakika dengeleyin.Hücre kabını çevre odası içindeki sahnenin üst kısmına yerleştirin. İstenen objektif lens ile mercek ve beyaz ışığı kullanarak hücrelerin odak düzlemini bulun ve normal morfolojiyi sağlayın. Konfokal sistemin optik çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarırken hücre içi bölmelerin tanımlanmasına izin veren 1.4 sayısal açıklıklı 60 X menekşe düzeltmeli yağa daldırılmış objektif lensi yaygın olarak kullanılır.Floresian-izotioanat veya FITC gibi uygun bir filtre seti ile hücreleri geniş alan floresan aydınlatması altında görselleştirirken görüş alanındaki hücrelerin floresan ifadesini kontrol edin. Bu noktada, göz merceğinden bakarken geniş alan aydınlatması kullanmak daha uygundur çünkü incelenecek bir hücre alanı seçmek için çanağı hareket ettirmek daha kolaydır. İstenilen bir görüş alanı bulunduğunda, çevre odasını kapatın.Etüt boyunca sabit bir odak düzleminin bakımını kolaylaştırmak için odak koruma özelliğini kullanın. Ardından, istenen maruz kalma süresi boyunca ilgilenilen sensörün en iyi şekilde değerlendirilmesini sağlamak için alım parametrelerini ayarlayın. Bunu yapmak için, 488 nanometrede uyarma ve 510 nanometrede emisyon için lazer gücünü ayarlayın.Hücrelerin görselleştirilmesine izin veren bir lazer güç seviyesi seçin ve bunu numuneler veya replike yemekler arasında sabit tutun. Z düzlemini ayarlarken 488 nanometrede tarayarak seçilen odak düzleminin hücrelerin merkezindeki maksimum floresan emisyon yoğunluğu için optimize edildiğinden emin olmak için edinme yazılımının konfokal kontrollerini kullanın. En fazla maruz kalan hücrelere sahip Z düzlemini ayarlarken yüksek kazanç ayarı kullanın.Uygun odak düzlemi bulunduktan sonra, kazancı, gözlemlenen pikselleri aşırı doygunlaştırmadan kullanılan raportörün floresansı için en uygun ayara getirin. Ardından, temel floresansa ince ayar yapmak için kazancı kullanın. RoGFP2 ile, bu hücreler glutatyon redoks potansiyeli arttığında 488 nanometre uyarmanın neden olduğu 510 nanometre floresan kaybedeceğinden, taban çizgisini aşırı doygunluk olmadan aletin üst sınırına yakın bir yere yerleştirin.Bu adımları 404 nanometrede uyarma ve 510 nanometrede emisyon ile tekrarlayın. 404 nanometre uyarma dalga boyu için kazanç ayarları, her sensör için 488 nanometre uyarma ile kullanılanların tersidir. Genel olarak, 404 nanometre uyarımının floresansı, roGFP2'yi ifade eden hücrelerde 488 nanometre uyarımı ile elde edilebilecek olandan önemli ölçüde daha düşük olacaktır, çünkü 404 nanometrelik bir bakış, bu sensör için nispeten küçük bir uyarma maksimumudur.İki uyarma dalga boyunu sırayla uyarmak ve hem 510 nanometrede hem de deneyin istenen uzunluğu boyunca önceden belirlenmiş bir zaman aralığında emisyonları toplamak için toplama yazılımını ayarlayın. Deneysel parametrelerin gerçek zamanlı değerlendirmesi için, sahada en az beş ila 10 sensör ifade eden hücre seçin ve deney sırasında floresan değişikliklerini izlemek için bunları ilgi alanları olarak belirleyin. Daha sonra, çevresel toksik maddeyi, 9, 10-PQ'yu dimetil sülfoksit içinde 15 milimolar bir konsantrasyona çözün.Bazal hücreli ortamda çözünmüş toksik maddeyi, 25 mikromolar nihai konsantrasyon için 250 mikromolar çalışma çözeltisine seyreltin. Ek olarak, bu protokolde daha sonra kullanılmak üzere çalışan bir hidrojen peroksit çözeltisi hazırlayın. Deneysel parametreler tanımlandıktan sonra, zaman rotası edinimine başlayın.Ksenobiyotik maruziyetlere başlamadan önce en az beş dakikalık bir başlangıç süresi oluşturun. Hücreleri, in vitro dozlama için geleneksel yaklaşımlar kullanılarak araştırılan toksik maddeye maruz bırakın. Maruz kalma süresi boyunca floresan değişikliklerini izleyin.Gerektiğinde sonraki enjeksiyonları gerçekleştirin. Enjeksiyonlar sırasında çanağı kaydırmamaya büyük özen gösterin, böylece aynı odak düzleminde görüntülenirken aynı hücreler tüm zaman boyunca takip edilir. Deneyin sonunda, roGFP2'yi tamamen oksitlemek ve azaltmak için hücreleri uygun kontrollere maruz bırakın.Kontrol simülatörlerinin eklenmesi, pozlamanın sonunda sensörün yanıt verebilirliğini doğrular ve gözlemlenen tepkilerin bağlantı portundaki hasarın doğrudan sonucu olmadığını doğrular. Bu nedenle, bir toksinin ilk değerlendirmesinde özellikle önemlidir. Bu çalışmalar için, maksimum sensör yanıtını belirlemek için bir milimolar hidrojen peroksit kullanın.Sensörün yanıt vermesine izin vermek için en az beş dakika bekleyin ve ardından sensörü küçültmek ve belirlenen taban çizgisinde veya yakınında bir floresan seviyesine geri döndürmek için DTT gibi bir indirgeyici madde enjekte edin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin. Burada gösterilen, roGFP2'yi eksprese eden bronşiyal epitel hücre hattı Bees 2B kullanılarak oluşturulan yerleşik bir doz yanıtını gösteren temsili sonuçlardır.İmlecin beş mikromolar, 25 mikromolar veya 100 mikromolar dozda hidrojen peroksite maruz kaldığı gösterilmiştir. Arıların 2B hücrelerinin daha önce test edilmemiş bir çevresel toksik madde olan 9, 10-PQ'ya maruz kalması, roGFP2 tarafından değerlendirildiği gibi hücre içi glutatyon redoks potansiyelinde kademeli ancak güçlü bir artışa neden olur. Burada, her satır, tabaktaki tek tek hücrelerin ham roGFP2 oranını gösterir.Test bileşiği, bir milimolar hidrojen peroksit ile karşılaştırılabilir bir maksimum tepki üretmesine rağmen, bu bilinen redoks döngüleyici, sensörde beş milimolar DTT'nin eklenmesiyle tamamen azaltılmış bir değişikliğe neden oldu, bu da sensörün bu redoks aktif organik bileşiğe maruz kaldıktan sonra işlevsel kaldığını düşündürdü. Bu yaklaşım, toksikologlara toksik kaynaklı oksidatif stresteki temel mekanik olayları araştırmada yardımcı olacak ve geniş bir toksik madde ve hücre tipi yelpazesinde ortaya çıkan redoks toksikolojisi alanında daha fazla odak çalışmasının önünü açacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, toksikolojik oksidatif stresin önemli belirteçlerini eşsiz uzay-zamansal çözünürlükte yüksek hassasiyet ve özgüllükle izlemek için genetik olarak kodlanmış sensörlerin ve canlı hücre mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

imaging-approaches-to-assessments-toxicological-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Oksidatif hücresel ortamlarda tespit etmek için bir tarama yöntemi, CM-H2DCFDA oksidasyon ölçmek için. Bir kez floresan olmayan bir floresan bileşik bir hücre, CM-H2DCFDA değişiklikler içinde okside. Bu değişiklik, floresan flow sitometri ile ölçüldü ve oksidatif bir ortamda hücrelerin sayısını gösterir.

Feline Astrosit Hücre Hücre Hattı Oksidatif Stres için Tarama Testi, G355-5

Bu videoda, kültürlenmiş organoidlerde oksidatif stresi görselleştirme tekniği açıklanmaktadır. Bu çalışma, farklı ROS modülatörleri ile tedaviden sonra bir organoidde bulunan çeşitli hücre tiplerinde ROS birikimine bağlı oksidatif stres seviyesinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Floresan Prob Görüntüleme Testi: Reaktif Oksijen Türleri İndükleyici ile Tedavi Edilen Kültürlenmiş Bağırsak Organoid Hücrelerinde Oksidatif Stresi Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu video, GFP eksprese eden transgenik farelerden elde edilen 3D bağırsak organoidlerindeki ROS seviyelerini ölçmek için bir akış sitometrisi testini göstermektedir. Bu yöntem, test bileşiklerinin ROS üretimi üzerindeki etkinliğini araştırmak için in vitro deneysel bir model sağlar.

Oksidatif Stresi Ölçmek için Akış Sitometrisi Deneyi: Florojenik Problar Kullanarak Bağırsak Organoidlerindeki Reaktif Oksijen Türlerini Ölçmek İçin Bir Test

Burada canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi ölçmek için bir protokol bildiriyoruz. Bu prosedür, hem tüm embriyo dokularında hem de tek hücreli popülasyonlarda reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespitine izin verir. Bu protokol hem kalitatif hem de kantitatif analizleri gerçekleştirecektir.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Bu makalede, konfokal canlı mikroskopi kullanılarak primer hipokampal ve kortikal nöronlarda bazal redoks durumundaki farklılıkları ve akut pertürbasyonlara redoks yanıtlarını belirlemek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, diğer hücre tiplerine ve mikroskoplara minimum değişiklikle uygulanabilir.

Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Öğrenin genetik olarak kodlanmış fluorojenik sensörlerle canlı hücre görüntüleme yöntemini kullanarak toksikolojik oksidatif stresi değerlendirmeyi. Bu teknik yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlar.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Daha fazla video keşfet