Name: Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Öğrenin, embriyo yönünü değiştirerek kimerik üretimi nasıl artıracağınızı. Bu yöntem ek ekipman gerektirmeden laboratuvar verimliliğini yükseltir ve genetik araştırmalarda germ hattı iletim süresini kısaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma [kısmen] Intramural araştırma NIH, Ulusal Enstitüsü Çevre Sağlık Bilimleri Program tarafından desteklenmiştir. İstatistiksel analiz için özel Shyamal Peddada teşekkürler. Biz de Humphrey Yao, Gary kuş ve Yuki Arao incelenmesi bu el yazması ve Franco St onun sürekli destek ve tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm işlemleri fare çekirdek dışarı NIEHS Knock tesisin normal çalışma kapsamında yapıldı. Bütün fareler bir 12:12 tarihinde tutulan s açık: koyu döngüsü ve bir diyet NIH-31 ve su besleme ad libitum. Tüm deneylerin hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü uygun olarak yapıldı.
1. hayvan hazırlık
<ol><li>Doğurmak donör fareler, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, 8-10 hafta-in yaş B6 için doğal olarak (Cg)-Tyr < c-2J > /J erkek fareler arasında 8 ve 26 hafta-in yaş. Fişler görsel olarak ertesi sabah (E0.5) kontrol edin.</li>
	<li>Alıcı fareler, İsviçreli kadın fareler 6 ve 9 hafta-in yaş arasında doğal olarak vasectomized İsviçre Webster erkek fareler için yetiştirilmiş Webster doğurmak. Fişler görsel olarak ertesi sabah (E0.5) kontrol edin.</li>
</ol>2. ES Hücre hazırlık
<ol><li>129-derieved AB2.2 ES hücreler için 15 ile desteklenmiş DMEM hücrelerde kültür % FBS, % 1 glutamin, %1 Penn/strep ve % 0.1 β-mercaptoethanol. ES Hücre tedarikçinin yönergeler, onların önerilen protokolleri kullanarak başına diğer tüm ES hücre kültür.</li>
</ol>3. embriyo koleksiyonu
<ol><li>
Hayvan diseksiyon
	<ol>
<li>Birkaç 60 mm yemekleri, yaklaşık 1 5 fare artı 10 mL patlama koleksiyonu medya (BCM) ile 3 ekstra hazırlamak (% 10 FBS inç DMEM), ve iyi bir 4 çanak ile 0.5 mL BCM de başına. 37 ° C, % 5 CO2equilibrate.</li>
		<li>B6 ötenazi (Cg)-Tyr < c-2J > /J dişi fareler, CO2 boğulma, % 10 debi ile kullanarak E3.5.</li>
		<li>Ötenazi sonra fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karın % 70 etanol ile iyice ıslak.</li>
		<li>Sadece, deri yoluyla ilk kesi kadar geniş açılış yapma karın, orta noktasını yaptırın. Sonraki yeniden yapım belgili tanımlık kesme mümkün olduğu kadar geniş karın duvarından açın. Not: iki adımda bunu azaltmak veya kürk kirlenme ortadan kaldırmak yardımcı olur.</li>
		<li>Yumurtalık, ovidukt ve rahim, yağ dokusu minimumda tutmak için ekstra bakım alarak bir yumurtalık başlangıç ve yumurtalık yağ yastığı künt forseps ile tutarak dikkatle çıkarın. Rahim bir tek birim olarak veya aşağıdaki yöntemde bir değişiklik ile bireysel boynuzları olarak kaldırın.</li>
		<li>Kaldırıldıktan sonra rahim patlama toplama ortamı içeren bir 60 mm çanak yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embriyo kaldırma
	<ol>
<li>BCM ile dolu bir 10 mL şırınga hazırlamak ve bir 25 G iğne ile uygun.</li>
		<li>Her seferinde bir rahim BCM holding çanak çıkarıp, onları aşırı kan kaldırmak ve düşük bir büyütme diseksiyon mikroskop altında 60 mm tabak içinde yerleştirmek için bir doku üzerinde leke.</li>
		<li>Dikkatlice ve yavaşça rahim distal sonuna (ovidukt) hemen altında tutarak forseps diseksiyon ile paralel bir uçak mümkün olduğunca olarak iğnede rahmine ortasına yerleştirin. Forseps ipuçları ötesinde iğne yerleştirin.</li>
		<li>İğne için rahim tutulacağı pensler biraz baskı uygulamak ve yaklaşık 1 mL BCM ile rahim boynuz sınırdışı. Not: şırınga üzerinde çok fazla baskı medya, kontrol edilemeyen bir akışı neden olur bu adımda kez çanak bırakarak özen göstermelidir.</li>
		<li>Rahim, 60 mm çanak, başına en fazla 5 bütün uteri kızarma sonra çanak koleksiyonu kadar da kuluçka makinesine koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embriyo koleksiyonu
	<ol>
<li>Bir el çekilmiş Cam Pipet ve ağzını pipet cihazlar kullanarak, blastokistlerin 25 X ve 35 X arasında parçalanmış bir kapsam altında toplamak. (Şekil 1). Not: Ağız pipet aparatı 30-40 cm esnek boru oluşur, 5 mm altında kimlik eklemek bir 1 000 µL pipet ucu, ilk tek bir amaç için nokta ve içindeki Cam Pipet yapıştırmayın. Bir ekli 1 cc şırınga varil, bir ağız parçası hareket etmek hiçbir pistonu ile diğer ucunu bir şırınga filtre ekleyin.</li>
		<li>Bulaşık kuluçka makinesi--dan kaldırma ve bir ızgara deseni kullanılarak yemek embriyolar için her bölümünü inceleyin. Embriyo aldı tek tek yukarı ve yer üstünde BCM ikincil bir tabak içinde damla.</li>
		<li>Tüm yemekler toplama sonra embriyo bir kez daha taze BCM bir düşüş yıkama ve enjeksiyon beklemek üzere 4 iyi çanak içinde yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. embriyo enjeksiyon
<ol><li>ES hücreleri tek tek enjeksiyon iğneyi onayı ile seç.<ol>
<li>5-7 mL enjeksiyon medya ekleyerek bir enjeksiyon yemek hazırlamak (DMEM, %10 FBS ve 20 mM HEPES) bir cam alt enjeksiyon yemek için. İğne oda sıcaklığında yapılır.</li>
		<li>Bir hava veya yağ microinjector kullanarak, ES Hücre çizmek için enjeksiyon iğne vakum uygulanır. Hücreler arasında mümkün olduğunca az yer olarak tutmak için dikkat ediniz. Burada ya da enjeksiyon adım ES hücreleri saymak.</li>
		<li>Orta ve küçük boyutlu hücreler, pürüzsüz bir yüzey ile boşluklar gibi bariz hataları olmadan genel nüfusa göre ES hücreleri seçin. Not: ES Hücre popülasyonlarının büyük ölçüde morfolojik kalitesinde değişir ve kullanılan standartlar onlarla ayarlamanız gerekebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyo yaklaşık 15 ES hücrelerle (Şekil 1) enjekte.<ol>
<li>Holding pipet eklemek ipucu için ikinci bir hava microinjector ve açılış sahibinin yakınındaki bir embriyo konumlandırın. Embriyo sahibi için güvenli için vakum uygulanır.</li>
		<li>Z ekseni için böylece embriyo sadece iyi zona üzerinde odaklanarak takip slayt, dokunuyor holding pipet yukarı veya aşağı taşıyarak ayarlayın. Ardından, ES hücrelerdir ucuna yakın odak enjeksiyon iğne Z ekseni ayarlayın.</li>
		<li>Embriyo şimdi hafifçe üst veya alt, ICM istediğiniz konuma koymak için dönen enjeksiyon iğne iterek ayarlayın.</li>
		<li>Zona ve ICM veya firma ama kontrollü push kullanarak trofoblast, enjeksiyon iğne yerleştirin. Microinjector enjeksiyon iğne blastocoel çöken düşük tutmak için hafif bir basınç uygulayın.</li>
		<li>Bir kez iğne blastocoel nüfuz, ES Hücre embriyo blastocoel için aktarmak için microinjector gelen basınç uygulayın. Basınç embriyo hücreleri tutarken, normale dönmek için izin vermek için embriyo çıkmak Duraklat kısaca iğne eğimi olarak başlar. Not: Başvuru grubu ES hücreleri normalde enjekte edildi, geleneksel bir ES takip enjeksiyon Protokolü9ICM dokunmamaya dikkat çekici, hücre. ES hücreleri de iğne doğrudan aracılığıyla ICM (TICM) (Şekil 2Tamamlayıcı film) iterek ICM yoluyla enjekte edildi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. eEmbryos devri
<ol><li>Transfer embriyoların İsviçre Webster farelere, E2.5, üretim prosedürleri başına bir cerrahi olmayan embriyo transferi aygıtı kullanarak. Cerrahi olmayan bu yordam herhangi bir anestezi veya özel ameliyat sonrası bakım gerektirir. Tek tek embriyo ve teslim ve sonraki sütten kesme yoluyla transferden sonra evi fareler.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Uzun ICM herhangi bir rahatsızlık ölüm, aslında, Şu anki blastosist mikroenjeksiyon protokolleri hala bu12,13uyarmak yol açabileceğini zannedildiği. Biz burada göstermiştir ne olduğunu mikroenjeksiyon ICM ile embriyo için zararlı değildir ve chimeras verimini artırır.
Böyle bir sonuç kesin mekanizması tanımlanmamış. Ancak, ICM ve eşlik eden hypoblast, mekanik bozulma ES Hücre entegrasyon mikroenjeksiyon takip yeni kurulan ICM insidansı...

Yaklaşık 25 yıl için genetik olarak hedeflenen fareler oluşturulması genellikle bir darboğaz tarafından blastokistlerin ES Hücre mikroenjeksiyon aşamada chimeras verici germline üretimi için engel yavaş bir süreç olmuştur. Son gelişmeler, ES hücre ve yüksek üretilen iş ES hedefleme CRISPR/Cas91,2 de dahil olmak üzere hücre üretimi konsorsiyumlar KOMP gibi genetik olarak değiştirilmiş ES hücre üretimi/durumu düzeldi. Ancak, genetik olarak değiştirilmiş fare bu ES hücreleri3,4den oluştururken bir darboğaz germline chimeras nesil kalır. Yüksek işlem hacmi ES hücre üretimi projeleri germline chimeras başarılı oluşturulması için önemlidir ES Hücre kalitesi yüksek değişkenlik tarafından rahatsız olması. Ayrıca, yaygın olarak kullanılan ES Hücre satırlarından bazıları yüksek anöploidi ve germline yetkili chimeras5zor üretim için bilinir.
Fare ya da daha yüksek bir chimera oluşturmak için birçok yöntem geliştirilmiştir veya tamamen ES Hücre fareler6,7,8,9,10türetilmiş. Bu sistemlerin her biri kendi yararları olsa da, onlar da kendi eksiklikleri var. Verimsiz ve outbred satırları 5,6sınırlı iken % 100 ES Hücre üretme fareler, türetilmiş tetraploid chimeras kuşağıdır. Morula enjekte ederek yeni yöntemleri yüksek oranda chimeras, % 100, yaklaşan verim ama genel olarak önemli ek donanımları (lazerler ya da piezos) ve eğitim10,11gerektirir. Nerede bu teknikler zaten yerde laboratuvarlarda, bu yeni yöntem gerek kalmayabilir.
Bu çalışmanın amacı chimera üretme, sonraki fare koloni kurmak için mutant gen aktarımını germline olasılığını artırma oranı artırmak için ortak teknikleri ve hazır ekipman kullanan bir yöntem bulmak oldu.

<table><tbody><tr><td>ES Hücre enjeksiyon iğnesi</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>NSET cihazı</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (yaşam teknolojileri)</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (yaşam teknolojileri)</td><td>10439-024</td><td>lotları ES Hücre uyumluluğu için ayrı ayrı test edilmelidir.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Mikro manipülatör</td><td>Leica</td><td>Mikro manipülatör</td><td></td></tr><tr><td>mikro enjektör</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu çanak</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm çanak</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, ABD</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>İsviçre Webster fareleri</td><td>Taconic, ABD</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon Kabı</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek chimerism oranları için yol açar.

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Bir çaba ES Hücre metodolojileri ile genetik fareler oluşturulmasında verimliliğini artırmak için biz bir uyum geçerli blastosist enjeksiyon protokolü için mevcut. Burada basit bir rotasyon embriyo ve sızdırma Trans-iç hücre kütlesi (TICM) yoluyla chimeric % %31 50'si, hiçbir ek donanımları ile fareler yüzdesi arttı ya da daha fazla eğitim uzman raporu. 26 farklı klonlar yakın akraba evliliğinden doğan ve 35 toplam klonlar bir 9 ay boyunca enjekte edildi. Geleneksel enjeksiyon teknikleri ve TICM arasında anlamlı bir fark gebelik oranı veya embriyo iyileşme oranı oldu. Bu nedenle, enjeksiyon süreci ve blastosist basit bir konumlandırma ve ICM enjekte herhangi bir önemli değişiklik, ES Hücre blastocoel boşluğa bırakmadan potansiyel chimeric üretim ve sonraki miktar artırabilir germline iletim.

Hücre kültürünü rasgele etkisi olarak tedavi, karışık etkileri Doğrusal model (örneğin SAS (sürüm 9.2)) yazılımında verileri çözümlemek için kullanıldı. Her analiz embriyo transfer ve hücre sayısı için kontrollü. İkinci analiz de hayatta yavru sayısı için kontrol.
Bu çalışma için her ES hücre kültürünü ve klon her ikisi ile geleneksel enjekte ettiler ve TICM teknikleri, her embriyo sonra iki yöntem arasında geçiş yapma. Enjeksiy...

Burada yeni ekipman kullanmanıza gerek kalmadan chimera üretimi artırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Enjeksiyon için embriyo basit yönlendirme değişikliği üretilen embriyo sayısını artırmak ve potansiyel olarak zaman çizelgesi germline iletim için azaltmak.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Bu modifiye edilmiş prosedürün genel amacı, ek maliyetlere veya uzun eğitim sürelerine maruz kalmadan kimerik üretimi artırmaktır. Bu yöntem, özellikle ES hücrelerinin optimalden daha az olduğu durumlarda, laboratuvarların kimera üretiminde daha verimli hale gelmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ek ekipman ve özel eğitim gerektirmemesidir.Bugün prosedürü gösteren Thomas Hagler olacak. Çekirdek laboratuvarda çalışan bir biyolog ve yüksek lisans öğrencisi. Embriyoları toplamak için, fazla kanı çıkarmak için uterusu bir laboratuvar dokusu üzerinde kurulayın ve organı düşük büyütmeli diseksiyon mikroskobu altında 60 milimetrelik yeni bir tabağa yerleştirin.Uterusu yumurta kanalının yakınında dikkatli ve nazik bir şekilde tutmak için diseksiyon forsepsleri kullanarak, 10 mililitre blast toplama ortamı içeren 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğneyi, forsepslerin uçlarının hemen ötesindeki uterusun merkezine mümkün olduğunca paralel bir düzlemde yerleştirin. İğneyi rahim içine sabitlemek için forsepslere baskı uygulayın ve rahim boynuzundan yaklaşık bir mililitre ortamı nazikçe yıkayın. Tüm blastokistler dışarı atıldığında, ağız pipeti aparatını monte edin ve tek tek embriyoları 60 milimetrelik ikinci bir tabakta tek damla blast toplama ortamına aktarmak için ağız pipetini kullanın.Daha sonra her bir embriyoyu ikinci bir damla blast toplama ortamında yıkayın ve embriyoları enjeksiyonlarına kadar dört oyuklu bir tabağa aktarın. Başlamak için, enjeksiyon iğnesine vakum uygulamak için bir mikro enjektör kullanın. Enjeksiyon iğnesi ve embriyo tutucu pipetin takılı olduğu enjeksiyon mikroskobunun altına bir tabak ES hücresi yerleştirin.Mikroskobu düzgün bir şekilde kurmak için zaman ayırmak enjeksiyonun başarısı için çok önemlidir. Bu, iğnedeki uygun miktarda ortamı ve z ekseninin doğru hizalanmasını içerir. Enjeksiyon iğnesine vakum uygulamak için bir mikroenjektör kullanın.Hücreler arasında mümkün olduğunca az boşluk bırakarak, embriyo kabından belirgin kusurlar olmadan düzgün yüzeyli küçük ila orta büyüklükte embriyonik hücreleri çekin. En az 15 hücre topladıktan sonra, tutucunun açıklığına yakın bir embriyo yerleştirin. Embriyoyu tutucuya sabitlemek için vakum uygulayın ve embriyo slayta değene kadar z eksenini ayarlamak için tutma pipetini yukarı veya aşağı hareket ettirin.Pellucida bölgesine ince bir şekilde odaklanın ve iğnenin ucuna yakın embriyonik hücreler odaklanana kadar enjeksiyon iğnesinin z eksenini ayarlayın. Gerekirse, iç hücre kütlesi enjeksiyon için uygun konuma gelene kadar blastosisti nazikçe yuvarlamak için enjeksiyon iğnesini kullanın. Sıkı ama kontrollü bir itme kullanarak, enjeksiyon iğnesini pellucida bölgesinden iç hücre kütlesine sokun ve blastocoele'nin çökmesini önlemeye yardımcı olmak için enjeksiyon iğnesinin mikroenjektörüne hafif bir basınç uygulayın.İğne blastocoele nüfuz ettikten sonra, tüm embriyonik kök hücreleri embriyoya aktarmak için mikroenjektöre basınç uygulayın, iğnenin eğimi embriyodan çıkmaya başladığında kısa bir süre duraklayın, böylece embriyodaki basıncın normale dönmesine izin verirken hücreleri korur. Tüm blastosistler enjekte edildiğinde, embriyoları üreticinin talimatlarına göre embriyonik evre 2.5 Swiss Webster farelerine iletmek için cerrahi olmayan bir embriyo transfer cihazı kullanın ve fareleri her transferden sonra doğum ve sonraki sütten kesme yoluyla ayrı ayrı barındırın. Bu temsili deneyde, enjekte edilen trans iç hücre kütlesi ile geleneksel olarak enjekte edilen kontrol grupları arasında gebelik oranları değişmedi ve her gruptan sütten kesilene kadar eşit sayıda yavru hayatta kaldı.Özellikle, sütten kesme sırasındaki farelerin sayısı değişmeden kalırken, trans iç hücre kütlesi enjekte edilen gruptan önemli ölçüde daha yüksek sayıda yavru, kontrol enjekte edilen gruba kıyasla ceket rengi kimerizmi sergiledi. Bu tekniğin en iyi yanı, kimeralarda daha fazla üretimi kolaylaştırmak için embriyonun oryantasyonunda sadece basit bir değişiklik gerektirmesidir. Mikroskobun doğru kurulumu çok önemlidir.Mikroskop ve manipülatörler düzgün bir şekilde kurulmaz ve bakımı iyi yapılmazsa, enjeksiyon işlemi çalışmayacaktır. Embriyo enjeksiyonlarında yeniyseniz, öğrenmenin tek yolu tekrarlamadır. Yeni başlayanlar için, embriyo yönetimi prosedürün en zor kısmı olma eğilimindedir.Embriyoları herhangi bir şey kaybetmeden bir tabaktan diğerine verimli bir şekilde taşıyabilmek, deneyin en önemli kısmıdır. Bu videoyu izledikten sonra, standart enjeksiyon tekniğinizde yapacağınız basit bir değişikliğin kimera üretiminde daha verimli olmanıza nasıl yardımcı olabileceğini iyi anlamış olmalısınız.

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video görüntüleme ve kuruntulardan üretimi için hücre nakli için agaroz dechorionation montaj Medaka embriyolar işlemek için nasıl adım adım yordamlar, gösterir. Bu prosedürler, omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı özellikleri tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar Medaka ve zebrafish kullanmak için gereklidir.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

İn vivo potansiyellerini belirlemek için kültürlenmiş hücreleri erken fare embriyolarının tanımlanmış bölgelerine aşılamak için bir yöntem gösteriyoruz. Ayrıca, eksojen DNA'nın embriyolardaki birkaç hücreye hassas bir şekilde iletilmesini sağlayan, çapı bilinen cam kılcal damarları kullanan optimize edilmiş bir elektroporasyon yöntemi de sunuyoruz.

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Biz bir rahim içinde nakli (IUT) intravenöz ve içi amniyotik yolları enjeksiyon fare modeli gerçekleştirmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı hücreleri, viral vektörel çizimler ve diğer maddelerin benzersiz bağışıklık dayanıklı fetal ortama tanıtmak için kullanılabilir.

İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Öğrenin, embriyo yönünü değiştirerek kimerik üretimi nasıl artıracağınızı. Bu yöntem ek ekipman gerektirmeden laboratuvar verimliliğini yükseltir ve genetik araştırmalarda germ hattı iletim süresini kısaltır.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

Daha fazla video keşfet