Name: Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin akut miyeloid lösemi kök hücrelerini akış sitometresi ile nicelendirmeyi. Bu yöntem hasta-türetilen ksenograftlarda kök hücre popülasyonlarını belirleyerek hematoloji laboratuvarlarında uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen Fransızca Derneği Laurette Fugain, LigueContre le kanser (Kuzey Merkezi), Fondation de France (lösemi Komitesi), SIRIC Oncolille ve Fransız Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Avrupa standartlarında bilimsel amaçlar için hayvan kullanımı için takip ediyoruz. Bu çalışmada yerel Etik Komitesi (#3097-2015120414583482v3) tarafından kabul edildi.
1. numune hazırlama
<ol><li>Kemik iliği (2 mL) de novo AML antikoagülan ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren tüpler 1.8 mg-mL kemik iliği bir konsantrasyon, toplamak.</li>
	<li>Ficoll ayırma, alyuvar ve granülosit, mononükleer hücreler olarak izole etmek için yoğunluğu bir degrade renk ayrımı gerçekleştirin. Kemik iliği fosfat tampon tuz 3 cilt olarak sulandırmak (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM). Dikkatle Ficoll 1 hacmi ile seyreltilmiş kemik iliği 1 birim yerleşimi. 300 x g fren olmadan 30 dakika çevir. İltihap hücrelerinin beyaz buffy önlük katman yeni bir steril tüp içine aktarın.</li>
	<li>PBS 10 mL hücrelerde iki kez yıkamak) ve santrifüj kapasitesi 300 x g 5 min için de bulaşıcı serum bileşenleri kaldırmak için.</li>
</ol>2. lizis kırmızı kan hücrelerinin (RBC)
<ol><li>2 mL lizis arabelleği (amonyum klorür % 0.8) hücreye ekleme cips, girdap yavaşça ve 5 dk. santrifüj 300 x g 5 min için de oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: gerekirse, bu adımı yineleyin.</li>
	<li>PBS hücrelerde yıkama daha önce (1.3.) açıklandığı gibi.</li>
</ol>3. hasta xenografts türetilmiş.
<ol><li>Blast hücreler kemik iliği Ficoll ayrılıktan sonra elde etmek ve sonra lenfositler tükenmesi immunomagnetic kullanarak seçimi negatif (CD3 T-ve CD20 B lenfositler için). Üreticinin yönergeleri izleyin.</li>
	<li>5 x 106 AML blast hücre koşulsuz NSG fare kuyruğu damar içine enjekte. Kuyruk ven enjeksiyon kolaylaştırmak için bir yasaklama aygıtı kullanın. Fareler konvansiyonel koşullar altında ve özellikle özel patojen ücretsiz koşullar altında tüm zamanlarda, bireysel havalandırılmış kafesleri kullanarak ve manipülasyon laminar akış başlık altında tutun. İki haftada bir Hematokrit kullanarak çene toplama yöntemi tarafından 60 µL kan kılcal al. Yer içine 5 mL kılcal yuvarlak alt tüp. Taşma payı küçük steril gazlı bez panelini kullanma hafif basınç uygulayarak durdurmak. Temiz bir şırınga ile Ermeniyi kan.</li>
	<li>1 ml lizis arabellek ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. O zaman 300 x g 5 dk. yıkama PBS ve 300 x g de centrifugre ile de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant ekle 100 µL PBS ile 3 µL Anti-insan CD45 FITC ve 1 µL Anti-fare ile % 10 sığır serum albumin (BSA) leke kaldırmak CD45 APC ve 4° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre Pelet iki kez PBS (2 mL) % 10 BSA ve 5 min için 300 x g, santrifüj ile yıkayın.</li>
	<li>PBS 100 µL Akış Sitometresi tüpler içine başına 1 x 106 hücre e aliquot kadar.</li>
	<li>Anket engraftment iki haftada chimerism analizi tarafından CD45 ifade (insan karşı fare) Akış Sitometresi (şekil 2A ve B) kullanarak.</li>
	<li>Kurban (periferik blast sayısı % 70 veya klinik belirtileri şiddetli hastalık büyük), mononükleer blast hücre ezilmiş dalağı ve kemik iliği yırtılmalarıteşhis temizlenerek toplamak ve uyluk PBS ile daha önce13açıklandığı gibi. Fareler tarafından servikal çıkığı uluslararası yönergeleri izleyerek ötenazi.</li>
	<li>Hücre Pelet RBC içeriyorsa, kırmızı kan hücre lizis arabelleği (Adım 2.1) ile lizis gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreleri Pelet iki kez PBS (2 mL) % 10 BSA ve santrifüj vasıl 300 x g ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>PBS 100 µL başına 1 x 106 hücre için hücre ve aliquot yukarı Akış Sitometresi tüpler içine toplamak.</li>
</ol>4. boyama
<ol><li>(Bkz. Adım 4.2) konjuge antikorlar ve girdap ekleyin. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>İnsan İlköğretim veya oluşan anti-CD36-FITC 10 µL, anti-CD19-ECD 5 µL, 5 µL anti-CD33-PC5.5, anti-CD90-APC 5 µL, anti-CD34-AA700, anti-CD45RA-APC-H7 5 µL, anti-CD38-Pasifik mavi, 5 µL 5 µL 5 µL PDX örnekleri için aşağıdaki panelini kullanın anti-CD45-KO Anti-CD123-PC7 ve 2.5 µL.</li>
	<li>İlişkisiz antikorlar PBS 2 mL aralıklarla 300 x g 5 min için de tarafından hücrelerde yıkayarak çıkarın.</li>
	<li>PBS 450 µL son akış sitometrik çözümlemesi için hücreleri yeniden askıya alma.</li>
</ol>5. Akış Sitometresi Analizi için strateji geçişi
<ol><li>Veri toplama (en az 500.000 hücreleri) kırmızı, mavi ve mor lazerler ile donatılmış bir Akış Sitometresi gerçekleştirin. Her gün için 1) optik uyum, 2) sıvı sistemi, 3) optik duyarlılık ve 4) standardizasyon Flüorosferlerini kullanan sitometresi ayarlarını doğrulayın</li>
	<li>(Şekil 1) CD38 ifadesi tanımlamak için sıralı gating strateji izleyin.<ol>
<li>Normal kemik iliği örnekleri hücrelerden hematogones veya CD38 ifade için olumlu denetim işlevi görecek plazma hücreleri tanımlamak için kullanın. Not: Bu kapı sonraki sözde LSC nüfus onun tanımına bağlı olarak değerlendirmek özellikle önemlidir.</li>
		<li>Fizyolojik değişimler hücreleri (normal blast hücreler) CD45dim/SSC (yan dağılım) düşük nüfus kriteri (şekil 1A) tanımlayın. Bu patlama nüfus içinde bir CD38 görüntülemek hematogones tanımlamak ++ CD19 + fenotip (şekil 1B) ve son olarak, myeloblasts, sarkomlardan ve erythroblasts (şekil 1 c) tanımlamak için CD36 ve CD33 ifade kullanırsınız. CD34 ifadesini hematogones üzerinde (şekil 1Eiçinde) gösterildiği gibi belirleyin. Birkaç patlama P6-P10 (şekil 1 d) tanımlanan hücreleri içinde öncüleri altgrupları değerlendirmek. P6, P7, önceden ayarlanmış CD38 gates dayalı P8 progenitör altgrupları blast hücre CD34 bölmesine ayırın. P8 yuvası P6 CD38-eksi bir (FMO) denetim CD38 Floresans dayalı olan hücreleri içeren hematogones olarak aynı CD38 yoğunluk var patlamaların içerir ve P7 hücreleri CD38 ile ilgili olarak iki uç arasında çoğu olun ifade (şekil 1 d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD34 + 38-(P6) CD90 ve CD45RA ifade (şekil 1F) kullanarak sözde LSC HSC ayrı Geçitli hücreler. Not: HSC fenotip CD34 + CD38 olduğunu-CD90 + CD45RA- ve multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38 tanımlanan-CD90 - CD45RA-. Sözde LSC fenotip CD34 + CD38 olduğunu-CD90dimCD45RA + ve daha olgunlaşmamış aşağı akım nüfus CD34 + CD38 tanımlanan lenfoid astarlanmalıdır ataları (LMPP) vardır-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>6. MRD RT-PCR ile izleme
<ol><li>MRD düzeyleri tarafından RT-PCR14daha önce açıklandığı gibi izlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Enstrüman ayarlarını her gün optik uyum, sıvı sistemi, optik duyarlılık ve standardizasyon işlevlerin doğru için doğrulanır membran veya Akış Sitometresi tarafından sitoplazmik işaretleri doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi gerektirir kalibrasyon boncuk kullanarak.
CD90 ve CD45RA göre çok parametrik Akış Sitometresi Analizi kullanarak AML blast hücre popülasyonlarının tespiti nispeten basit ve güvenilir bir yöntemdir. Bu analizi kritik bir adımda doğru CD34 + CD38 nüfusu geçişi gerçekle...

Akut Miyeloid Lösemi (AML) Lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) klonal bir hastalık var. Son zamanlarda, klonal heterojenite blast hücre nüfusunun aslında gelecek nesil sıralama (NGS) stratejileri kullanarak ve tümör hücreleri1intra klonal evrimi varlığını gösteren kurulmuştur.
Heterojenite lösemik kök hücreleri (LSC) varlığı için genişletir. Bunun üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında uygulanan çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bu dinamik hücre bölümü geliştikçe onaylanmadığına karar. Bu nedenle LSC gereken geçerli kemoterapi rejimleri için dayanıklı ve derin klinik sonuçları2ile hastalık nüks aracılık. Çeşitli işaretler LSC CD1233, CLL-14, CD975 veya TIM-36gibi karakterize etmek için tarif edilmistir. CD34 + CD38 bölmeli blast hücrelerinin LSC'yi7 için zenginleştirilmiş kabul edilir ancak normal HSC içerir. CD34 + CD38 uygulanan CD90 ve CD45RA ifade-(P6) yuvası (şekil 1) izin veren çeşitli aşamalarında normal ve malign hematopoetik öncüleri8ayırmak için. Özellikle, normal CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-hücreleri ve CD34 + CD38 gibi-CD90-CD45RA + multipotent progenitör (LMPP) astarlanmalıdır lenfoid hücrelerin AML çoğunluğu olarak belirlenen durumlarda8 ,9. (MFI) ortalama Floresans yoğunluğunu CD38 CD34 + hücre bölmesi içinde dikkate alınması gereken özellikle önemlidir. CD38 yoğunluk üç yeni cep bölmeleri bunların tanımladığından: CD38 negatif (P6) CD38 dim (P7) ve CD38 parlak (P8) (şekil 1). CD38 MFI bu hücreler şiddetle CD38 hızlı gibi ya hematogones ve/veya plazma hücreleri bir iç pozitif kontrol kullanarak belirlenebilir.
İmmünyetmezligi başını SALLAMAK/SCID/IL2Rγcnull (NSG) fare modeli normal engraftment için yaygın olarak kullanılır ve10,11kötü huylu insan hematopoetik hücreler. Seri xenotransplantation deneyleri deneysel LSC veya HSC işlevini doğrulamak için kullanılır. Bu çalışmalar geniş büyük ölçekli sıralama yaklaşımlar tarafından analiz edilmiştir. Yine de, daha az onun birincil AML (Şekil 2) karşılaştırıldığında NSG fareler içine engrafted AML patlama nüfus LSC ve HSC immunophenotype hakkında bilinir.
LSC sayıda böylece doğal olarak düşük, kimlik ve LSC miktar zor olan ve burada anlatılan yöntemi bir akış sitometrik tahlil tanı ve klinik takip (kalıntı LSC olabilir gibi kemoterapi yanıtı değerlendirmek için kullanılıyor olabileceği AML relapse) neden. LSC varlığı olumlu minimal rezidüel hastalık (MRD) gösterebilir. Bugüne kadar MRD AML içinde çoğunlukla izleme itimat moleküler yöntemler (Yani, RT-PCR, NGS)10,12. Ancak, bu protokol için biz aynı anda protein ifade çeşitli HSC/LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML multiparametric Akış Sitometresi2,8,9tarafından tespit. Antikorlar bu arada herhangi bir standart Akış Sitometresi laboratuvarda uygulanabilir ve bu akışı MRD tahlil özellikle ilginç olduğunda MRD tarafından gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) mümkün değildir Yani, eğer lösemi özel moleküler işaretleyicileri tanılama AML örnekte algılanabilir değildir. Ayrıca, bu iletişim kuralını, daha hassas moleküler MRD teknikleri için tamamlayıcı bu tespit ve anormal hematopoetik progenitör hücre ölçmek için amaç gibi temsil eden bir işlev hücre karakteristik (şekil 3).
Akış Sitometresi ile antikor klinik laboratuvarlar çoğunda kullanılabilir tarafından üç hematopoetik progenitör nüfus ve sözde LSC yuvası ile farklı olgunlaşma derecesini ölçmek için nasıl gösterir. Ayrıca, bu hücre bölmeleri içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts (PDX) varlığını doğruladı ve tedavi takip.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lizis Tamponu (10x)</td><td>Özim</td><td>BLE420301</td><td>RBC Lizis çözeltisi A: 100 mL steril H4Cl + 0.037 g Na2EDTA 100 mL steril H2O ve RBC Lizis solüsyonu B'de: 100 mL steril H>2O NOD/SCID</IL2R & gama içinde 1 g KHCO sub 3 </td></tr><tr><td>; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; fareler</td><td>JACKSON LABORATUVARI</td><td>Stok No: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Çalışan Tampon &ndash; MACS Ayırma Tamponu</td><td>MACS Tamponu Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (klon FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (klon D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (klon 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (klon J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (klon 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (klon HI100)&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pasifik Mavisi (klon LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (klon J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Akış Seti</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Akış Kontrolü</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep insan PE seçim kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ve nbsp; mıknatıs & nbsp;</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometresi lösemi kök hücre birincil akut miyeloid lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akut Miyeloid Lösemi (AML) heterojen, olduğunu ve eğer tedavi değil, ölümcül hastalık. Erişkinlerde lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, lösemi blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) bir hastalık var. Heterojenite lösemi kök hücreleri (LSC) varlığı uzanır, bu dinamik hücre ile çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bölme gelişen üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında empoze. Daha fazla LSC nüfusu tanımlamak için CD34 + CD38 hücreli bölmenin içinde normal HSCs ve multipotent ataları ayrımcılık CD90 ve CD45RA eklenmesini sağlar. Burada, biz birkaç sözde LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) aynı anda ifade algılamak için bir protokol multiparametric Akış Sitometresi tarafından birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML anahat. Ayrıca, üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı. Bu yöntem algılama ve sözde LSC miktar kemoterapi yanıt klinik izlemek için kullanılan (i.e., minimal rezidüel hastalık), kalan LSC AML nüks neden olabilir gibi.

Burada yaratıcı nüfus normal ve kötü huylu insan kemik iliği örneklerinde belirlemek için bir yöntem mevcut. Kemik iliği ve dalak başarılı bir PDX toplanan ve multiparametric Akış Sitometresi yukarıda açıklandığı gibi yapılır. Biz birkaç blast hücreler arasında tanı hasta örnek ve karşılık gelen PDX ve özellikle, CD34 + CD38 progenitör yuvası, özellikle sözde LSC zenginleştirilmiş altgrupları göre. Biz CD34 + CD38-şok kesir PDX tanılama hasta örnek (%3,48 %0,53, şekil 2C, Dv...

Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Bu prosedürün genel amacı, akut miyeloid lösemide ve hasta kaynaklı ksenogreftlerde lösemi kök hücrelerini tanı ve tedavi takibinde akış sitometrisi ile tahmin etmektir. Bu yöntem, akut miyeloid lösemide akış sitometrisi ile lösemi kök hücrelerinin kantitatif değerlendirmesinin klinik önemi gibi hematoloji/onkoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yaygın olarak kullanılan antikorlara sahip çoğu hematoloji/onkoloji laboratuvarına uygulanabilir olmasıdır.Bu prosedür, doktora sonrası Thomas, yüksek lisans öğrencisi Fanny ve laboratuvarımdan bir mühendis olan Adeline tarafından gösterilecektir. Başlamak için, anti-koagülan EDTA'nın mililitresinde 1.8 miligram içeren tüplerde de novo AML'den iki mililitre kemik iliği toplayın. Önce kemik iliğini üç hacim PBS'de seyrelterek mononükleer hücreleri kırmızı kan hücrelerinden ve granülositlerden izole edin.Daha sonra, bir hacim ficol'u bir hacim seyreltilmiş kemik iliği ile dikkatlice kaplayın. Yoğunluk gradyanını 300 g'da ara vermeden 30 dakika döndürün. Daha sonra, tek çekirdekli hücrelerin beyaz kabarık kaplama tabakasını yeni bir steril tüpe aktarın.Serum bileşenlerini kirleten süpernatanları çıkarmak için, 10 mililitre PBS ekleyin ve yıkamayı tekrarlamadan önce hücreleri beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Hücre peletine iki mililitre lizis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini parçalayın ve yavaşça girdap yapın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Hücreleri 300 g'da beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ardından, hücreleri yıkamak için PBS kullanın. Blast hücrelerini metin protokolüne göre kemik iliğinden izole ettikten sonra, laminer bir akış başlığı altında, koşullandırılmamış bir NSG faresini bir kısıtlama cihazına yerleştirin ve kuyruk damarına beş kez 10 ila altıncı AML blast hücresi enjekte edin.Fareyi, geleneksel ve özel patojen içermeyen koşullar altında havalandırmalı ayrı bir kafese geri koyun. Her iki haftada bir, 60 mikrolitre kan almak için hematokrit kılcal damarlı bir submandibular toplama yöntemi kullanın. Kılcal damarı beş mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından steril bir gazlı bezle kanamayı durdurmak için hafif bir baskı uygulayın.Tüpe bir mililitre lizis tamponu ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.Daha sonra, süpernatanı çıkardıktan sonra,% 10 BSA, üç mikrolitre anti-insan CD45 FITC ile 100 mikrolitre PBS ekleyin, 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücre peletini PBS'de iki kez, iki mililitre,% 10 BSA ile yıkayın ve beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Her iki haftada bir, insan ve murin CD45 ekspresyonunun kimerizm analizi ile aşılamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanın.Patlama sayısı %70'in üzerinde olduğunda veya ciddi klinik hastalık belirtileri gözlendiğinde, hayvanı kurban edin ve daha önce tarif edildiği gibi tibiaları ve femurları yıkamak için PBS kullanarak ezilmiş bir dalaktan ve kemik iliğinden mononükleer patlama hücreleri toplayın. Panel boyamayı gerçekleştirmek için, konjuge antikorları insan primer veya hastadan türetilmiş ksenogreft veya PDX numuneleri ile birleştirin ve tüpleri girdaplayın. Daha sonra, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin.Hücreleri yıkamak için iki mililitre PBS kullanarak bağlanmamış antikorları çıkarın. Hücreleri 450 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin, ardından akış sitometrisi analizine ve MRD izlemeye devam edin. Akış sitometrisi ile sitoplazmik belirteçlerin zarını doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için optik hizalamayı doğrulayın.3D sisteminin uygun şekilde ayarlanması ve stomazin kalibrasyonu kullanılarak optik hassasiyet ve stomatizasyon her gün atıyor. CD38 için kapıları ayarlamak için normal kemik iliği kullanın. En az 500.000 olay gereklidir ve her akış çalışmasının düzenli ve homojen olduğu doğrulanır.Ek olarak, çiftlerin yanı sıra ölü hücreler ve hücre kalıntıları da elimine edilir. İmmatür hematopoetik hücreler CD45 ara, SSC düşük olarak tanımlanır. Ve CD38 pozitif kontrol veya hematogonlar, CD19 / CD38 çift pozitiftir.Daha sonra P8 veya CD38 pozitif, P7 veya CD38 ara ve P6 veya CD38 negatif tanımlanır. P6 hücreleri ayrıca HSC, MPP ve LSC'ye bölünebilir. Normal bir kemik iliği olduğu için LSC negatiftir.Multiparametrik akım sitometrisi kullanılarak, CD34 pozitif, CD38 negatif blast fraksiyonunun PDX'te tanısal hasta örneğine göre daha yüksek olduğu bulundu. İlginç bir şekilde, PDX'te birincil hasta örneğine kıyasla daha yüksek bir varsayılan LSC yüzdesi bulundu, bu da bu fare modelinde hematolojik dokularda malign progenitör hücrelerin olası bir zenginleşmesini düşündürdü. İki farklı hasta örneğinde blast progenitör popülasyonları karşılaştırıldığında, CD34 pozitif, CD38 negatif fraksiyonu ilk hastada tanı başında %0.06 iken ilk tedavi takibinde %3.33'e yükselmiştir.Buna karşılık, CD34 pozitif, CD38 negatif fraksiyonu ikinci hastada tanıda %7.8'den ilk tedavi takibinde %2.27'ye düştü. Buna göre, varsayılan LSC fraksiyonu ilk hastada tanıda %0'dan tedavi takibinde %0.65'e yükselmiş, ikinci hastada tanıda %6.57'den tedavi takibinde %1.44'e düşmüştür. Moleküler belirteçler olarak birinci hastadaki NPM1 mutasyonu ve ikinci hasta için CBF-beta MYH11 gen füzyonu kullanan minimal rezidüel hastalık veya MRD izlemesi, moleküler MRD'nin ilk hastada ikinci hastaya kıyasla daha az azaldığını gösterdi.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, akış sitometrik ayarlarını ve CD38 ölçümünü doğrulamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, fonksiyonel lösemi kök hücre değerlendirmesi gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrik hücre sıralaması gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, hasta kaynaklı ksenogreftlerde hasta örneklerinde lösemi kök hücrelerinin nasıl tespit edileceğini ve miktarının nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Hasta numuneleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken GOP yönergeleri ve kurumsal güvenlik prosedürleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

flow-cytometry-to-estimate-leukemia-stem-cells-primary-acute-myeloid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

En küçük veya ölçülebilir rezidüel hastalığı (MRD) tespiti risk değerlendirme rafine ve Relaps Akut Miyeloid Lösemi (AML) içinde tahmin için önemli bir prognostik biyomarker olduğunu. Bu sõnõrlar ve önerileri ile tutarlı ve doğru kimlik ve MRD, tespiti için en iyi yöntemler yardımcı etkili AML tedavi karar verme.

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.

Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Burada, farelere ksenogreftlenmiş ve kemik iliği aspiratlarından elde edilen akut insan miyeloid lösemi hücrelerinde mTORC1, JAK/STAT5 ve MAPK yollarının aşağı akışındaki sinyalleri analiz etmek için fosfoflow sitometri tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ve p-ERK1/2 seviyeleri, yüksek duyarlılığa sahip yeni nesil spektral akış sitometresi kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür.

Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi

Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.

Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)

Protokol, indüksiyon kemoterapisine yanıtın dinamiklerine dayalı olarak akut lenfoblastik löseminin nüksetmesine neden olan bir fare modelini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Akut Lenfoblastik Lösemi için İndüksiyon Kemoterapisine Nüks Löseminin Murin Modeli

Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

Öğrenin akut miyeloid lösemi kök hücrelerini akış sitometresi ile nicelendirmeyi. Bu yöntem hasta-türetilen ksenograftlarda kök hücre popülasyonlarını belirleyerek hematoloji laboratuvarlarında uygulanabilir.

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için (Video) | JoVE Journal

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Daha fazla video keşfet