Fare Beyin tümör Neurospheres kullanarak yerel Kromatin Immunoprecipitation

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir genomik lokasyonda histon işaretlerinin zenginleşmesini tanımlamaktır. Bu yöntem, histon modifikasyonlarını değiştiren epigenetik düzenleyicilerdeki mutasyonların tümör hücreleri transkriptomunu nasıl etkilediği gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücrelerin çapraz bağlı olmamasıdır, bu nedenle daha doğal bir durumda olurlar, bu da antikor özgüllüğüne yardımcı olabilir.

Deneysel olarak indüklenen tümörü bir farenin beyninden 10 santimetrelik bir Petri kabında inceleyerek başlayın. Tümör bir floresan proteini eksprese ediyorsa, tümörü 0.3 kat büyütme ile uygun floresan kanalına ayarlanmış bir floresan diseksiyon mikroskobu ile görselleştirin. Tümör dokusunu normal beyinden ayırmak için bir neşter ve forseps kullanın ve tümörü Petri kabında küçük parçalara ayırın.

Diseke edilen tümörü 300 mikrolitre NSC ortamı içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tümörü nazikçe homojenize etmek için tek kullanımlık bir şırınga kullanın. Ardından, bir mililitre hücre ayırma ortamı ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne geçirin.

Daha sonra, süzgeci 25 mililitre NSC ortamı ile yıkayın ve süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı boşalttıktan sonra, peleti altı mililitre NSC ortamında yeniden süspanse edin ve tümör hücresi süspansiyonunu bir T25 kültür şişesine aktarın. Hücreleri 37 santigrat derecede, nörosferler oluşana kadar% 95 hava ve% 5 karbondioksit atmosferine sahip bir doku kültürü inkübatöründe kültürleyin.

Nörosferler hasat edildikten sonra, beş dakika boyunca 300 kez G'de amino çökeltme başına altı nörosfer hücresine bir kez 10 kez santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı boşaltın ve nörosfer peletini bir mililitre dengeli tuz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu düşük protein bağlayıcı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve ardından daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 95 mikrolitre sindirim tamponunda yeniden süspanse edin, altı hücrenin 10'unda bir kez proteaz inhibitörü kokteyli ile bir ila 100 takviye edin. Topaklanmayı önlemek ve herhangi bir kabarcık oluşturmasını önlemek için hücreleri hemen yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, 145 mikrolitre sindirim tamponunda beş mikrolitre 0.1X mikrokokal nükleazı karıştırın ve altı hücreye bir kez 10'da beş mikrolitre seyreltilmiş mikrokokal nükleaz ekleyin.

Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve tüpü tam olarak 12 dakika boyunca 37 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin. Kromatini parçalamak için mikrokokal nükleaz sindirimi en kritik adımdır. ChIP için yüksek bir çözünürlük elde etmek için uygun kromatin parçalanması önemlidir.

Adımın başarılı olduğundan emin olmak için, aşırı sindirimin meydana gelmemesini sağlamak için birden fazla numuneyi birer birer inkübe edin. 12 dakika sonra, altı hücreye bir kez 10 kez 10 mikrolitre 10X mikrokoksiaz nükleaz durdurma tamponu ekleyin. Numuneler bu noktadan itibaren buz üzerinde tutulmalıdır.

Mikrokokal nükleaz sindirilmiş numunenin biyoanalizör analizi, DNA'nın çoğunun mono, di ve tri-nükleozomlara parçalandığını göstermektedir. Daha sonra, altı hücreye bir kez 10 kez proteaz inhibitörü kokteyli ile bire 100 oranında takviye edilmiş 110 mikrolitre 2X ripa tamponu ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun, daha sonra 1700 kez G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Kromatin içeren süpernatanı normal 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.

Kromatini seyreltmek için bir ila 1000 arasında proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş ripa tamponu kullanın, böylece her IP 100 ila 200 mikrolitre hacme sahip olur. Ardından, giriş örneği olarak ChIP hacminin %10'una eşdeğer bir alikotu çıkarın. Proteinaz K ile takviye edilmiş 100 mikrolitre TE tamponu ekleyerek girişi hazırlayın ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.

Girişi bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırdıktan sonra, bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak girişin konsantrasyonunu ölçün. Sonuçları bir not defterine kaydedin. Her numune üzerinde gerçekleştirilecek IP başına 10 mikrolitre yıkanmış protein A ve G manyetik boncuk ekleyin ve 20 RPM'de dönerek 4 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Numuneyi manyetik bir tutucuya yerleştirin ve boncukların ayrılmasına izin verin, ardından gereken hacmi yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. İstenilen antikoru her tüpe ekleyin ve ardından buharlaşmayı önlemek için kapakları plastik parafin film ile sarın. Numuneleri gece boyunca 4 santigrat derecede daha önce olduğu gibi döndürerek inkübe edin.

Ertesi gün, tüpleri 10 saniye boyunca 2000 kez G'de döndürün, ardından her IP'ye 10 mikrolitre boncuk ekleyin ve 20 RPM'de dönerek 4 santigrat derecede 3 saat inkübe edin. Ardından, numuneleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından her IP'ye proteaz inhibitörleri içeren 150 mikrolitre ripa tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 20 RPM'de 4 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçka süresinden sonra, numuneleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından her IP'ye düşük konsantrasyonda proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 150 mikrolitre lityum klorür tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 20 RPM'de rotasyonla 4 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, numuneleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin, ardından süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.

Daha sonra, boncuklara proteaz inhibitörleri içermeyen 150 mikrolitre soğuk TE ekleyin ve beş dakika boyunca 20 RPM'de rotasyonla 4 santigrat derecede inkübe edin. Son yıkama adımından sonra, numuneyi mililitre proteinaz K başına 0.5 miligramlık nihai konsantrasyon ile desteklenmiş 100 mikrolitre TE tamponunda yeniden askıya alın ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, amino çökeltilmiş DNA'yı bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.

Ardından, IP'nin başarılı olup olmadığını kontrol etmek için, pozitif ve negatif kontrol bölgelerini hedefleyen primerlerle bir qPCR gerçekleştirin. qPCR, gliseraldehit-3-fosfat-dehidrojenaz için primerler kullanılarak IGG ChIP DNA, histon-3-lycene-4-trimetillenmiş ChIP DNA ve histon-3-lycene-27-trimetillenmiş ChIP DNA ile gerçekleştirildi. Temsili sonuçlar, bir temizlik geni olan Gapdh'nin, baskılanmış kromatin ile ilişkili H3K27me3 modifikasyonu ile değil, yalnızca aktif transkripsiyon ile ilişkili H3K4me3 modifikasyonu ile zenginleştirildiğini göstermektedir.

Bu prosedürü takiben, genom genelinde histon işaretlerindeki değişiklikleri tanımlamak için ChIP-C gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli gen bölgelerindeki histon işaretini tanımlamak için nörokürelerde doğal ChIP'nin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.