Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Bu deneyin amacı, yeni altın floresan proteini üretmek için seçici basınç dahil etme yoluyla rekombinant protein üretimi için kanonik bir amino asidi kanonik olmayan bir amino asit ile değiştirmektir. Seçici basınç birleştirme yöntemi, yeni kimyasal özelliklere sahip proteinler üretmeyi amaçlamaktadır. Bu, özellikle protein fonksiyonunu anlamaya veya tasarlamaya çalışırken kullanışlıdır.

Bu tekniğin temel avantajı, yaygın rekombinant protein üretimine benzer şekilde yürütülmesinin nispeten basit olmasıdır. Zaman ve dalga boyu ile ilişkili floresan, modifiye edilmiş proteinin uyarılmış durum dinamiklerini araştırmaya yardımcı olur, bu da kromofora eklenen kanonik olmayan amino asidin optik özellikler üzerindeki etkisini anlamayı kolaylaştırır. SPI, prensip olarak, oksotrofik suşların ve kimyasal olarak tanımlanmış ortamların mevcut olduğu herhangi bir protein üretim ortamına uygulanabilir.

Bu, diğer bakteri suşlarını ve ayrıca memeli hücre kültürünü içerir. Ekspresyon koşullarının zamanlaması ve kurulumu kritiktir, çünkü modifiye edilmemiş vahşi tip proteinin üretimini baskılamak zorunludur. Bu nedenle sıcaklık, indüksiyon süresi veya yetiştirme ortamının bileşimi gibi belirli parametrelerin optimize edilmesi gerekir.

Bu yöntem için ilk olarak, selenometiyonin gibi metil içeren amino asitlerle protein ekstraktının ilk çalışmalarından sonra aklımıza geldi. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Almut Pelzer olacak. Bu prosedüre başlamak için, triptofan oksotrofik E.coli hücrelerini ECFP için plazmit ekspresyonu ile dönüştürün.

Bir kültür tüpünde ampisilin ile takviye edilmiş beş mililitre LB ortamının bir ön kültürünü aşılamak için tek bir koloni kullanın. Gece boyunca 37 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin. Ertesi gün, bir litrelik Erlenmeyer şişesinde gece boyunca bir mililitre kültür kullanarak 100 mililitre takviye edilmiş NMM19 ortamını aşılayın.

Ardından, kültürü gece boyunca 200 rpm ve 30 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Ertesi gün, değer 30 dakika içinde 0,05'ten daha az değişene kadar her 30 dakikada bir 600 nanometrede optik yoğunluğu ölçün. Daha sonra, bakteri hücrelerini hasat etmek için kültürü 5.000 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika

Süpernatanı boşaltarak atın. Ampisilin ile takviye edilmiş NMM19 ortamındaki hücreleri toplam 100 mililitre hacme kadar yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonu aynı Erlenmeyer şişesine geri aktarın.

Bir milimolar nihai konsantrasyona 4-amino-indol ekleyin. 30 santigrat derece ve 200 rpm'de 30 dakika orbital çalkalayıcıda inkübe edin. 30 dakika sonra, hedef gen ekspresyonunu indüklemek için kültüre 0.5 milimolar nihai konsantrasyona kadar IPTG ekleyin.

Gece boyunca 30 santigrat derece ve 200 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Ertesi gün, bakteri hücrelerini 10 dakika boyunca 5.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek hasat edin. Süpernatanı boşaltarak atın.

Hedef protein saflaştırmasını gerçekleştirmeye hazır olana kadar hücre peletini eksi 20 santigrat derecede veya eksi 80 santigrat derecede dondurun. İlk olarak, bakteri hücresi lizatını metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Kromatografi kolonunu üreticinin talimatlarına göre hazırladıktan sonra, hareketsizleştirilmiş metal iyon afinite kromatografi kolonunu dengelemek için bağlayıcı tampon kullanın.

Lizatı tamamlanana kadar sütuna yükleyin. Kromatografi reçinesine bağlı altın renkli proteine dikkat edin. Sütunu bağlama tamponu ile yıkayın.

Ardından, elüsyon tamponu kullanarak hedef proteini elüte edin. Görünür altın rengiyle tanımlanabilen altın floresan proteini içeren ayrıştırılmış fraksiyonları toplayın ve birleştirin. Bundan sonra, üreticinin talimatlarına göre 5.000 ila 10.000 arasında moleküler ağırlık kesimine sahip bir diyaliz membranı hazırlayın.

Bir mililitrelik bir numuneyi en az iki saat boyunca en az 100 mililitre tampona karşı diyalize edin. Başlamak için, protein örneğini mililitre başına 0.1 miligrama seyreltmek için MS tamponu kullanın, böylece nihai hacim 80 mikrolitre olur. Karıştırmak için dikkatlice pipetleyin.

Solüsyonu cam uçlu bir MS otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın ve bir kapakla kapatın. Hava kabarcıklarını gidermek için şişeyi hafifçe vurun. Daha sonra, ikinci bir şişede MS tamponu içeren bir boşluk hazırlayın.

Her iki şişeyi de HPLC otomatik numune alma cihazına koyun. Bundan sonra, MS cihazını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kalibre edin. Elektrosprey iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi yöntemine bağlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi için otomatik örnekleyici enjeksiyon hacmini beş mikrolitreye ayarlayın.

Boş çalıştırma için bir iş listesi oluşturun ve ardından GdFP örnek çalıştırması oluşturun. Enjeksiyon hacmini, ilgili otomatik örnekleyici flakon konumlarını atayın ve iş listesini çalıştırın. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi zaman ve dalga boyu ile ilişkili tek foton sayımı için bir altın floresan protein çözeltisi ve dedektör hazırlayın.

Tek foton sayma yazılımı kullanarak, floresan bozunma eğrilerinin maksimum alımında yaklaşık 10.000 sayım birikene kadar saniyede yaklaşık 200.000 fotonluk bir sayım hızında floresan emisyonu elde edin. Bundan sonra, numune küvetini PBS tamponunda kolloidal silika ile doldurulmuş bir santimetrelik bir kuvars küvet ile değiştirin. Lazer filtresini çıkarın ve dedektörün merkezi kanalındaki 470 nanometre fotonların elde edilmesi için ızgarayı ayarlayın.

Ardından, emisyon maksimumunda yaklaşık 10.000 sayım birikene kadar enstrümantal yanıt fonksiyonunu edinin. Floresan bozunma sürelerinin emisyon dalga boyuna bağımlılığını temsil eden bozunma ile ilişkili spektrumları elde etmek için elde edilen verileri metin protokolünde belirtildiği gibi dönüştürün, sığdırın ve çizin. Bu çalışmada, kütle spektrometresi, altın floresan proteini olarak adlandırılan, spektral olarak kırmızıya kaymış yeşil floresan protein tipi florofor varyantının başarıyla üretildiğini doğrulamak için kullanılmıştır.

Vahşi tip ECFP, kromofor olgunlaşmasından sonra 28.283.9 daltonluk hesaplanmış bir protein kütlesine sahipken, karşılık gelen altın floresan protein kütlesi 28.313.9 daltondur. Altın floresan proteininin evrişimli ESI-MS spektrumu, teorik değerden milyonda 10 parçadan daha az sapma gösteren, yaklaşık 28.314.1 daltonda bir ana kütle zirvesi sergiler. Bu, kanonik olmayan amino asidin seçici basınç dahil etme yoluyla dahil edilmesini doğrular.

ECFP'nin absorpsiyon spektrumu, 434 nanometre ve 452 nanometrede iki karakteristik maksimuma sahiptir. Buna karşılık, altın floresan proteini, maksimum 466 nanometrede olan geniş bir kırmızıya kaymış absorpsiyon bandı ile karakterize edilir. EGFP'nin absorpsiyon maksimumu 488 nanometreye daha fazla kırmızıya kayarken, altın floresan proteinin floresan emisyon spektrumu ve GdFP'nin karşılık gelen Stokes kayması, Aequorea victoria yeşil floresan proteininin tüm türevlerinin en kırmızıya kaydığını gösterir.

Tek foton sayımı ile izlenen zamanla çözülen floresan emisyonu burada gösterilmektedir. Bozunma eğrileri, 600 nanometrede 550 nanometreden biraz daha hızlı bir floresan bozunması sergiler. Altın floresan proteininin floresan emisyonu, birçok yeşil floresan protein varyantı için tipik olduğu gibi, güçlü bir şekilde pH'a bağlıdır.

Burada görüldüğü gibi, spektral özellikler sabit kalmasına rağmen, düşük pH'da floresanda belirgin bir azalma vardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, dönüştürülmüş bakteri hücrelerinden veya donmuş gliserol stoklarından kolonilerden başlayarak üç gün içinde yapılabilir. Bu işlemi denerken, hedeflenen amino asidin tükendiğinden emin olmak önemlidir.

NcAA hücre tarafından alınmalı, biyouyumlu olmalı ve seçilen oksotrofik suş tarafından proteinlere dahil edilmelidir. Bu prosedürü takiben, mühendislik amaçları için çok çeşitli proteinler üretilebilir. Protein stabilite analizörleri, enzimatik aktivite deneyleri, floresan spektroskopisi veya protein kristalizasyonu gibi hedef protein yöntemlerine bağlı olarak, kanonik olmayan amino asidin fonksiyonel ve yapısal özellikler üzerindeki etkisini tanımlamak için kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu tekniğin sentetik biyoloji alanında çok yararlı olduğu kanıtlandı ve ona doğaya yeni proteinler ve proteomlar sağladı. Bu, protein mühendisliği için kimyasal kapasiteleri genişletir. Bu videoyu izledikten sonra, kanonik olmayan amino asitlerin seçici basınç dahil etme yoluyla rekombinant proteinlere nasıl dahil edileceğini, kütle spektrometresi ile yapay bir amino asidin girişinin nasıl doğrulanacağını ve bir floresan proteinin zamanla çözülen floresan ile nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.