Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Bu protokolün genel amacı, böcek hücre kültüründe bakulovirüs üretmek, heparin afinite kromatografisi ile saflaştırmak ve ultrasantrifüjleme ile konsantre etmektir. Nihai ürün, in vivo gen transferi için veya bir aşı olarak kullanılabilir. Bu yöntem, gen tedavisi uygulaması için saflaştırılmış ve konsantre bakulovirüs kullanmak isteyen araştırmacılara yardımcı olabilir.

Bakulovirüs partikülleri, insanlarda kullanıldığında iltihaplanmaya veya bağışıklık tepkisine neden olabilen Sf9 kültüründen hücresel kalıntılar ve proteinler içerebilir. Toksisiteyi önlemek için, bakulovirüs saflaştırılır ve kirletici partiküllerden ayrılır. Prosedürün bazı kısımları, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Marilou Narciso tarafından gösterilecek.

Süspansiyon kültürünü kurmak için, böcek kültürü ortamındaki 50 mililitre Sf9 hücresini 250 mililitrelik bir polikarbonat Erlenmeyer şişesine tohumlayın. Ve şişeyi bir orbital çalkalayıcı inkübatörüne yerleştirin. Hücrelere iki mililitre P2 bakulovirüs stoğu ekleyin ve 28 santigrat derece sabit bir sıcaklığı korurken 135 rpm'de çalkalayın.

Enfeksiyondan dört gün sonra, tüm Sf9 hücre popülasyonu, yüksek titreli bakulovirüs üretiminin bir göstergesi olan sitopatik etki gösterecektir. İstenilen hacim elde edilene kadar bakulovirüsü sırayla çoğaltın, sonraki her enfeksiyonda hücre kültürü hacmini 10 ila 50 kat artırarak. Son bakulovirüs süpernatantını 1000 g ve dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjledikten sonra, hücresel kalıntıları ayırmak için, süpernatanı temiz bir kaba aktarın ve genomik DNA ve RNA'yı sindirmek için 37 santigrat derecede iki saat boyunca mililitre başına 50 birimde nükleaz ile muamele edin.

Son olarak, viral süpernatanı 0.45 mikronluk bir filtrasyon ünitesinden süzün. Yıkama tamponu hattını A1 giriş portundan en az 500 mililitre yıkama tamponu içeren bir şişeye yerleştirerek kromatografi sistemini kurun. Elüsyon tamponunu yüklemek için A2 tampon giriş portunu kullanın.

Kolon geçişli bakulovirüs süpernatanı, yıkama tamponu ve atılmış bakulovirüsü toplamak için fraksiyon toplayıcıya birkaç 50 mililitrelik konik tüp yerleştirin. Heparin kolonunu, dakikada yedi mililitrelik doğrusal bir akış hızında beş adet 7.9 mililitre kolon hacminde yıkama tamponu ile dengeleyin. 250 mililitre bakulovirüs süpernatanı, dakikada iki mililitrelik doğrusal bir akış hızında giriş numune portunun numune pompasını kullanarak heparin kolonuna yükleyin.

Daha sonra, ultraviyole absorbans eğrisi taban çizgisine dönene ve stabil hale gelene kadar dakikada iki mililitrelik doğrusal bir akış hızında heparin kolonundan 10 kolon hacimde yıkama tamponu çalıştırın. Dakikada dört mililitrelik doğrusal bir akış hızında beş sütun hacmi elüsyon tamponu ile heparin kolonundan bakulovirüs parçacıklarını uzaklaştırın. Bakulovirüs parçacıkları heparin kolonundan ayrıldığında kromatogramda proteinin keskin bir elüsyon zirvesini izleyin.

Elüsyon sonrası, sonraki santrifüjleme sırasında ozmotik şoktan bakulovirüs parçacıklarının aktivasyonunu önlemek için 20 milimetre sodyum fosfat tamponu kullanarak kaçan bakulovirüs süpernatantını hemen 10 kat seyreltin. Ultrasantrifüj tüplerine otoklava eşit hacimde bakulovirüs süpernatantı ekleyerek konsantrasyon prosedürüne başlayın. Tüp ağırlığını bir terazi ile ölçün ve ultrasantrifüj tüplerinin içeriğinin ağırlığını steril PBS ile ayarlayın.

Ultrasantrifüj tüplerinin her birini SW 32 Ti rotorunun karşılıklı bir kovasına yerleştirin ve ultrasantrifüjü 80.000 g'da 90 dakika boyunca dört santigrat derecede çalıştırın. Santrifüjlemeyi takiben, ultrasantrifüj tüplerini bir doku kültürü başlığında açın ve bakulovirüs peletini çıkarmadan sıvıyı aseptik olarak aspire edin. %0,5 BSA içeren 200 mikrolitre PBS ekleyin ve her peleti kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.

Son olarak, konsantre bakulovirüsün 50 ila 100 mikrolitrelik alikotunu kriyoviyallere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bakulovirüs titreleri, HT1080 hücrelerinin enfeksiyonu ile tahmin edildi. Elmaslarla bağlanan çizgi, her fraksiyondaki toplam bulaşıcı bakulovirüs birimlerini gösterir.

Bakulovirüs partikülleri heparin kolonuna güçlü bir şekilde bağlanır, bu nedenle kolon yıkama tamponunda önemli miktarda virüs tespit edilmez. Elüsyon sırasında bakulovirüs fraksiyonuna karşılık gelen keskin bir protein zirvesi gözlenir. Bu protokolde kullanılan parametreler verimi en üst düzeye çıkarır ve enfeksiyöz bakulovirüs partiküllerinin inaktivasyonunu en aza indirir.

Bu protokol, heparin için afinitesi olan diğer virüslerin ve proteinlerin saflaştırılması için kullanılabilir.