Name: Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Öğrenin gen tedavisi için bakulovirus üretimi ve heparin afiniti kromatografisi ile arındırma yöntemini. Sf9 hücre kültürü ve ultrasantrifüjasyon kullanılarak yüksek saflıkta viral vektör elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen başlangıç Cincinnati çocuk Araştırma Vakfı (CCRF) üzerinden M.N. ve yenilikçi çekirdek Grant (ICG) ulusal sağlık Enstitüleri altında ilerleyen translasyonel Bilimler için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen için finansman tarafından desteklenen Ödülü sayı UL1 TR001425. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Protokolü özetleyen bir örnek için bkz: şekil 1 .
1. Baculovirus plazmid DNA saflaştırılması
<ol><li>Bakteriyel kültür baculoviral plazmid DNA (bacmid)14 200 ml LB suyu antibiyotik içeren büyümek; sefaloridin (50 µg/mL), tetrasiklin (10 µg/mL) ve viomisin (7 µg/mL), orbital Çalkalayıcı ayarını 300 rpm'de 37 ° C'de 16 h için.</li>
	<li>Standart alkalin lizis protokolü15kullanarak bakteriyel kültüründen DNA bacmid arındırmak ve bacmid TE arabelleği geçiyoruz.</li>
</ol>2. Baculovirus imalatı
<ol><li>Kültür Sf9 orbital Çalkalayıcı kuluçka 135 devir/dakika ve 28 ° C'de bir polikarbonat Erlenmeyer şişe serum içermeyen böcek kültür orta1,2,3içeren hücrelerde. Not: Sf9 hücreleri donmuş stoktan çözdürülen hücrelere yeniden elde etmek ve üstel büyüme aşaması girmek için en az iki hafta izin vermesi.</li>
	<li>Üstel büyüme bir hemasitometre ile Trypan mavi ile boyama sonra aşaması, hasat Sf9 hücreleri saymak. 1 x 106 Sf9 hücrelerin 6-iyi doku kültürü tedavi tabakta orta 2 ml bir kuyu başına tohum. Hücre bir kuluçka 28 ° C'de 1 h için eklemek için izin verir.</li>
	<li>Büyüme orta ile 1 mL serum-Alerjik unsupplemented Grace'in böcek kültür orta yerine.</li>
	<li>Böcek hücre transfection reaktif kullanarak Sf9 hücre içine bacmid DNA transfect.<ol>
<li>Mix 8 µL böcek hücre transfection reaktif Grace'in böcek orta 100 µL ile.</li>
		<li>Bacmid DNA unsupplemented böcek orta 100 µL içine 2 µg sulandırmak ve karışımı yavaşça vortexing tarafından.</li>
		<li>Seyreltilmiş DNA seyreltilmiş böcek hücre transfection reaktif ile birleştirmek ve karışımı yavaşça. 15-30 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya.</li>
		<li>Dropwise hücreleri üzerine DNA-lipid karışımı ekleyin. Yaklaşık 5 h için bir kuluçka 28 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfection karışımı hücrelerdeki kaldırmak ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Böcek kültür orta 2 mL ekleyin ve kültür bir kuluçka 28 ° C'de medya değiştirmeden devam ediyor. Not: Bacmid floresan bir protein içeriyorsa, onun ifade hücreleri 48 saat sonrası transfection içinde tespit edilebilir. Baculovirus transfected Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve daha sonra untransfected hücreleri bozar kültür orta salgılanan. Tüm hücre nüfus baculovirus ile 5 gün içinde enfekte olur ve cytopathic etkisi olarak da adlandırılan viral enfeksiyon belirtileri gösterir. Bu artan hücre çapı içerir, çarpıtmalar/granül sitoplazma, hücre büyümesini kesilmesi ve ölü ya da lysed hücreleri hücre kültüründe mevcut. Ancak, transfection veya enfeksiyon verimliliği en uygun değilse, kültür açık bir cytopathic etkisi göstermeyebilir. Cytopathic etkisi ile 200-400 X büyütme, bir ters faz mikroskobu görüntülenmeyecektir. Enfekte Baculovirus hücre anti-gp64 antikor11ile boyama tarafından tespit edilebilir.</li>
	<li>Baculovirus süpernatant 5 gün P1 virüs stok olarak transfection ve etiket sonra hasat.</li>
	<li>Karanlıkta % 0.5 sığır serum albumin (BSA) ile ışığa duyarlı olan baculovirus süpernatant, PBS içinde saklayın. Kısa süreli (en fazla 90 gün) için 4 ° C'de veya uzun vadeli için-80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Tohum 6 × 106 Sf9 hücreleri doku kültürü tedavi bir 10 cm tabak içinde böcek kültür ortamının 10 mL. İlk baculovirus süpernatant (P1) 1 mL hücrelere ekleyin.</li>
	<li>Baculovirus süpernatant (2P) 5inci gün sonrası enfeksiyon, hasat.</li>
	<li>Tohum 50 mL süspansiyon kültür 250 mL polikarbonat Erlenmeyer flask böcek kültür ortamında Sf9 hücrelerinde (3 x 106 hücre/mL) ve yer bir orbital Çalkalayıcı kuluçka şişeye. P2 stokunun 2 mL hücrelere ekleme ve 28 ° c sabit sıcaklık koruyarak 135 rpm'de sallamak Not: Üç ya da dört gün sonra enfeksiyon, tüm Sf9 hücre popülasyonu yüksek titresi baculovirus üretim bir göstergesidir cytopathic etkisi gösterir.</li>
	<li>İstediğiniz birimin (P3P4,...) elde edilir kadar sırayla yükseltmek baculovirus supernatants 10 50-fold sonraki her enfeksiyon hücre kültüründe hacmiyle artırarak. Not: P3 3rd yuvarlak enfeksiyon Sf9 1 litre hangi 500 mL içinde hücre kültürü P2 baculovirus süpernatant ile 10-20 mL etkilenmiş olabileceğini belirtir. P4 4th yuvarlak hangi 5-10 L Sf9 hücre kültürü P3 baculovirus süpernatant ve benzeri 100-200 mL ile enfekte enfeksiyon var. Genellikle, Sf9 hücreleri, 3 × 106 hücre/mL serum içermeyen böcek kültür medya seribaşı.</li>
	<li>Baculovirus 30 dk 4 ° C'de hücresel enkaz kaldırma ve süpernatant ile 50 adet/mL nükleaz (250 adet/µL stokunun) için 2 h baculovirus 37 ° C genomik DNA ve RNA sindirmek için tedavi için 1000 x g de süpernatant santrifüj kapasitesi. Supernatants 0,45 mikron filtrasyon ünitesi aracılığıyla filtre.</li>
</ol>3. Kromatografi Sistemi hazırlanması
<ol><li>Sırayla örnek ve arabellek satırları her steril su, 1 N sodyum hidroksit, su ile durulama tarafından Kromatografi Sistemi hazırlamak ve arabellek (20 mM sodyum fosfat tampon içeren 150 mM Sodyum Klorür, pH 7,0) 50 mL/dk bir doğrusal akış hızı yıkayın.</li>
	<li>Arabellek (5 CV steril 20 mM sodyum fosfat tampon içeren 2 M Sodyum Klorür, pH 7,0) temizlik sütun sırayla çalıştırarak heparin 50 µm sütun (10 × 10 cm, 7,9 mL (CV) sütun biriminin) hazırlamak ve 5 CV yıkama tampon 7 mL/dk doğrusal akış hızında.</li>
</ol>4. Baculovirus vektör saflaştırılması
<ol><li>Kromatografi Sistemi aşağıdaki gibi ayarlayın:<ol>
<li>Giriş bağlantı noktası süpernatant baculovirus yüklemek için yükleme örneği kullanmak.</li>
		<li>Arabellek girişi bağlantı noktası A1 yıkama arabellek yüklemek için kullanın. En az 500 mL şişe yıkama arabelleği hazırlamak ve yıkama arabellek satırı şişe içine koyun.</li>
		<li>Arabellek girişi bağlantı noktası A2 elüsyon arabellek (1.5 M Sodyum Klorür, pH 8.0 ile 20 mM sodyum fosfat) yüklemek için kullanın. En az 500 mL şişe elüsyon arabelleği hazırlamak ve elüsyon arabellek satırı şişe içine koyun.</li>
		<li>Birkaç 50 mL konik tüpler süpernatant sütun doğrudan baculovirus toplamak için kesir toplayıcı, yıkama arabellek ve eluted baculovirus yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Heparin sütun yıkama arabelleği (40 mL) 7.0 mL/dk doğrusal akış hızında beş 7.9 mL sütun birimler (CVs) ile equilibrate.</li>
	<li>250 mL baculovirus süpernatant Kromatografi Sistemi örnek pompa (giriş örnek bağlantı noktası) 2.0 mL/dak bir doğrusal akış hızında çalıştırarak heparin sütuna yerleştirin.</li>
	<li>10 CVs (80 mL) yıkama arabellek heparin sütun 2.0 mL/dk doğrusal akış hızında ultraviyole (UV) Absorbans eğrisi kadar koşmak-den geçerek (280 nm) satır taban çizgisine geri döndü ve kararlı hale gelir.</li>
	<li>Ne zaman baculovirus parçacıklar heparin sütundan ayırmak elüsyon arabelleği 4.0 mL/dak izle Kromatografik protein keskin elüsyon zirvesine için doğrusal akış hızında baculovirus parçacıklar 7.9 mL heparin sütun 5 CVs (40 mL) ile elute.</li>
	<li>Sonrası elüsyon, hemen 10 kat baculovirus parçacıklar osmotik şoktan inactivation sonraki Santrifüjü sırasında önlemek için suda 20 mM sodyum fosfat tampon kullanarak eluted baculovirus süpernatant sulandırmak.</li>
	<li>Baculovirus süpernatant, yıkama arabellek ve eluate yükleme sırasında toplanan sütun akış yoluyla dahil olmak üzere, her birinin kesirler 100 µL depolamak. HT1080 arıtma işlemi (bakınız Bölüm 6) değerlendirmek için bu baculovirus kesirler bulaştırmak.</li>
	<li>Sütun Temizleme arabellek ve yıkama arabellek sütun ile temizleyin. Son olarak, doğrusal akış 7.0 mL/dk hızında sütun 5 CV steril % 20 etanol su ile durulayın ve 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>Su, su ile tekrar 1 N sodyum hidroksit ile % 20 etanol suda 50.0 mL/dk doğrusal akış hızında Kromatografi Sistemi temiz ve sistem % 20 etanol içinde saklayın.</li>
</ol>5. konsantrasyonu Baculovirus
<ol><li>Santrifüj tüpleri bir otoklav kullanarak önceden sterilize. Her ultracentrifuge tüpler doku kültürü başlıklı baculovirus süpernatant eşit bir hacmi ekleyin. Bir denge tarafından tüp ağırlık ölçmek ve steril PBS ultracentrifuge tüplerini içeriğini ağırlığını ayarlamak.</li>
	<li>Her biri ultracentrifuge tüpler kova SW 32 Ti rotor muhalif koyun.</li>
	<li>Ultracentrifuge de 80.000 × g çalıştırmak 4 ° C'de 90 dk</li>
	<li>Ultracentrifuge tüpler doku kültürü mahallede açın ve aseptik baculovirus Pelet kaldırmadan sıvı Aspire edin.</li>
	<li>Her tüpün Pelet şiddetle aşağı yukarı 200 µL % 0,5 (w/vol) BSA içeren PBS ile pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Cryovials (şişe başına 50-100 µL) için konsantre baculovirus aktarın ve-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>6. Baculovirus titrasyon
<ol><li>Enfeksiyon, önceki gün bir hemasitometre Trypan hücrelerle mavi boyama sonra kullanarak HT1080 hücreleri saymak. 6-şey plaka 2 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum (FBS) içeren DMEM) bir kuyu başına 1 x 105 HT1080 hücre tohum. Tohum birkaç ek wells hücreleri enfeksiyon anda mevcut tam sayısını belirlemek için. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2hücrelerinde kültür. Not: Onlar heparan sülfat diğer hücre hatları16ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir seviyede hızlı gibi HT1080 hücreler titrasyon için kullanılır. HT1080 hücreleri olduğundan yapışık, titrasyon daha basit ve daha az zaman alıcı ile karşılaştırıldığında geleneksel Sf9 tabanlı titrasyon kullanarak.</li>
	<li>Enfeksiyon günü, iyi başına hücre sayısı hücreleri kuyulardan sayarak belirler. Hücreleri bir kenara önce sütun arıtma ve örnekleri ile sütun akış yoluyla, yıkama ve elüsyon kesirler belirlenmiş olduğunu seyreltilmiş orijinal baculovirus ekleyerek bulaştırmak. Her örnek için seyreltme ve ampirik olarak bulaşıcı baculovirus parçacıkları üzerinde temel birim belirlemek ve her kuyuya nüsha bulaştırmak.</li>
	<li>İki gün sonra enfeksiyon, hücrelerin gen ilgi bir ifade için analiz. Hücreleri floresan protein (örneğin GFP)17ifade edersek bir Akış Sitometresi kullanılarak analiz edilebilir.</li>
	<li>Şimdiki zaman enfeksiyon, seyreltme faktörü ve yüzdeleri formülü kullanarak hücreleri floresan proteinin hücre sayısına titreleri (bulaşıcı birim mL) hesaplamak: (sırasında enfeksiyon × yüzde floresan proteinin hücre sayısı pozitif hücrelerinin × seyreltme faktörü) / baculovirus ml hacmi. Not: Örneğin, hücreleri enfeksiyon zaman kuyuda başına 1,2 × 105toplam sayısıdır, floresan protein oranı % 5'dir, seyreltme faktörü 100 ise seyreltilmiş baculovirus eklendi hacmi 10 µL titresi 6 × 107 bulaşıcı birim (IU) ise, /mL.</li>
</ol>

<ol><li>Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cell+culture+for+industrial+production+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).</li>
<li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+vaccines+produced+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein vaccines produced in insect cells.</a> Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Airenne, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus%3A+an+insect-derived+vector+for+diverse+gene+transfer+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications.</a> Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).</li>
<li>Sung, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+into+cell+lines+and+stem+cells+using+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transient+transduction+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+with+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors.</a> Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviral+vector-mediated+transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).</li>
<li>Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+membrane+chromatography+method+for+rapid+and+efficient+purification+of+recombinant+baculovirus+and+baculovirus+gp64+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein.</a> Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).</li>
<li>Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+recombinant+baculovirus+of+Autographa+californica+M+nucleopolyhedrovirus+by+ion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography.</a> J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071(2016).</li>
<li>Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6-o-+and+N-sulfated+syndecan-1+promotes+baculovirus+binding+and+entry+into+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells.</a> J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).</li>
<li>Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+baculovirus+binding+and+entry+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells.</a> J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).</li>
<li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li>
<li>Feliciello, I., Chinali, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alkaline+lysis+method+for+the+preparation+of+highly+purified+plasmid+DNA+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli.</a> Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Membrane-associated+heparan+sulfate+is+a+receptor+for+prototype+foamy+virus+in+human%2C+monkey%2C+and+rodent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells.</a> Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).</li>
<li>Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+a+vaccinia+virus+neutralization+assay+based+on+flow+cytometric+detection+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein.</a> J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+tumor+growth+in+xenograft+model+mice+by+programmed+cell+death+4+gene+delivery+using+folate-PEG-baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus.</a> Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).</li>
<li>Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+vectors+for+gene+therapy+against+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer.</a> J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+foamy+virus+vector+for+the+treatment+of+leukocyte+adhesion+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004(2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Burada sunulan Protokolü baculovirus süspansiyon kültür Sf9 hücrelerde üretimi ve heparin benzeşme Kromatografi kullanarak baculovirus arınma açıklar. Bu protokol için kullanılan parametreler verimi en üst düzeye çıkarmak ve bulaşıcı baculovirus inactivation en aza indirmek. Burada sağlanan iletişim kuralı baculovirus parçacıklar iyileşme ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde geliştirilmiş bir kurtarma başkaları tarafından9elde gösterir.
Geniş ana bilgisayar tropism ne...

Baculovirus öncelikle rekombinant proteinler ve Lepidoptera Spodoptera fugiperda (Sf) 9 aşı üretimi için kullanılan rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polyhedrosis virüs (AcMNPV) kullanarak böcek hücreleri 1 , 2 , 3 , 4. son zamanlarda, gen terapisi uygulama5için umut verici bir vektör olarak ortaya çıkıyor. Bu geniş bir ev sahibi ve doku tropism sahip olduğu bilinmektedir, durgun ve Proliferasyona hücreleri bozar patojenik olmayan ve ana bilgisayar kromozom4,5,6entegre değil. Ayrıca, ölçeklenebilir ve kapalı sistem için gelecekteki klinik üretim1işlemek sağlar süspansiyon serum serbest kültür baculovirus üretilebilir.
Baculovirus parçacıklar saflığı sitotoksisite7,8,9en aza indirirken etkili iletim ulaşmak için önemlidir. Baculovirus ultrasantrifüj veya teğet akışı filtrasyon (TFF) onun infektivite üzerinde sınırlı etkisi ile konsantre. Ancak, bu işlemler sadece virüs parçacıkları konsantre aynı zamanda hücre artıkları ve proteinlerin Sf9 gelen Kültür, hangi-ebilmek var olmak zehirli vitro (kişisel gözlem) ve iltihap veya bir bağışıklık kullanıldığında yanıt neden olabilir vivo içinde. Bu, özellikle yüksek kullanarak virüs stokları konsantre önlemek için bulaşıcı baculovirus saflaştırılmış ve parçacıklar kirletici ayrılmış gerekir.
Birkaç yöntem arıtma ve toplama baculovirus vektörler10,11,12için rapor edilmiştir. Kullanılabilir yaklaşımlar, heparin benzeşme Kromatografi tek adımlı bir üst düzey arıtma proteinler12kirletici düşük konsantrasyon ile sağlar. Yönteminin kimliği heparan sülfat ile reseptör baculovirus13,14dayanmaktadır. Sf9 hücre süpernatant üstüne belgili tanımlık sütun ve baculovirus bağlama yükledikten sonra sütun ilişkisiz veya gevşek bağlı bulaşıcı parçacıkları kaldırmak için fizyolojik (izotonik) arabellek ile yıkanabilir. Heparin bağlama tersinir olduğundan, baculovirus parçacıklar hemen inactivation önlemek için fizyolojik (izotonik) tuz konsantrasyonu için ozmotik şok12ile seyreltilmiş yüksek bir salt arabellek ile eluted. Ayrıca, üretim baculovirus yanı sıra üzerinde yakalama ve elüsyon Kromatografi sütundan yapılabilir mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) ile uyumlu olan bir kapalı sistem işlemi kullanarak.
Burada, biz üretim, arıtma ve bulaşıcı baculovirus benzeşme Kromatografi ve Santrifüjü kullanarak konsantrasyon için detaylı bir protokol sağlar. Kısaca, baculovirus ile transfection Sf9 hücre yapisan kültür baculovirus plazmid DNA ile üretmek ve daha fazla serum serbest süspansiyon kültürü bulaşıcı baculovirus genişletin. Heparin benzeşme Kromatografi kullanarak baculovirus arındırmak ve ultrasantrifüj vektör gen terapisi uygulama için son derece konsantre için son adım olarak kullanın.

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE Sağlık</td><td>28976337</td><td>Kromatografi sistemi</td></tr><tr><td>POROS Heparin 50 & m Kolonu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Heparin kolonu</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Virüsü yüksek hızlı</td></tr><tr><td>Poliallomer Ultrasantrifüj tüpünde</td> konsantre eder <td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>Virüsü yüksek hızda</td></tr><tr><td>konsantre eder MaxQ 8000 orbital çalkalayıcı inkübatör&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific Katalog</td><td>dışı ürün</td><td>Süspansiyon kültürü için çalkalayıcı</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer şişeleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>Süspansiyon kültürü için şişe</td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyer şişeleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>Süspansiyon kültürü şişesi</td></tr><tr><td>Mikroskop (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Hücre izleme ve sayma&nbsp;</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Baculovirus süpernatanının arıtılması için</td></tr><tr><td>50 ml Konik tüp</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Baculovirus süpernatanının toplanması için</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>Doku kültürü uygulanmış plaka</td></tr><tr><td>10 cm'lik plaka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Doku kültürü ile tedavi edilmiş plak</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0.45&nbsp; &mikro; m, PVDF</td><td>EMD-Millipore SCHVU05RE</td><td></td><td>Filtrasyon ünitesi</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Vektör Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>Bakulovirus ekspresyon sistemi</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&nbsp; Yetkili hücre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>TE tamponu</td> için yetkili hücre <td>Kurum içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.</td></tr><tr><td>Plazmid Maxiprep kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>Bacmid saflaştırması için</td></tr><tr><td>Sf9 Hücreleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>Böcek hücreleri</td></tr><tr><td>Grace' s Böcek Hücre Kültürü Ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>Transfeksiyon ortamı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>Hücrelerin yıkanması, numunelerin seyreltilmesi</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Böcek hücresi ortamı</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>Serumsuz böcek hücresi büyüme ortamı</td></tr><tr>DNA <td>ve RNA'yı</td><td></td><td></td><td></td> parçalamak için Benzonaz Nükleaz Sigma-Aldrich E1014 Enzimi</tr><tr><td>Bakulovirüs plazmid (bacmid)</td><td>DNA'sı Şirket İçi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Baculovirus Üretimi için Bacmid</td></tr><tr><td>Cellfectin II&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>Böcek hücreleri için transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Baculovirus</td></tr><tr>HT1080 hücre hattının <td>depolanması için Baculovirus</td><td>Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24'ü</td></tr> stabilize eder <tr><td></td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Fibroblast hücre hattı</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Büyüme Hücre hatları için ortam</td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td>Kurum içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>150 mmol/l sodyum klorür içeren 20 mmol/l fosfat tamponu</td></tr><tr><td>Elüsyon tamponu</td><td>Kurum içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>1,5 mol/l sodyum klorür içeren 20 mmol/l fosfat tamponu</td></tr><tr><td>Kolon temizleme tamponu</td><td>Kurum içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>2,0 mol/l sodyum klorür</td></tr> <tr><td>içeren 20 mmol/l fosfat tamponuSteril su Kurum</td><td>içi</td><td>Katalog dışı ürün</td><td>Akta Avant temizliği için</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>Akta Avant temizliği için</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>Akta Avant temizliği için</td></tr></tbody></table>

Üretim ve baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus geleneksel olarak rekombinant protein ve aşı üretimi için kullanılmıştır. Ancak, son zamanlarda, baculovirus gen terapisi uygulama için umut verici bir vektör olarak ortaya çıkıyor. Burada, baculovirus bir yapisan Sf9 hücre kültüründe baculovirus plazmid DNA (bacmid) geçici transfection tarafından üretilir. İstenen ses elde edilir kadar Baculovirus daha sonra serum serbest süspansiyon kültür Sf9 hücrelerde genişletilir. Sonra kültür heparin benzeşme Kromatografi kullanarak süpernatant saf. Virüs süpernatant glikoprotein baculovirus örtmek için baculovirus parçacıklar süpernatant heparin yakınlık nedeniyle içinde bağlar heparin sütun yüklenir. Sütun kirletici kaldırmak için bir tampon ile yıkanır ve baculovirus ile bir yüksek-tuz arabellek sütundan eluted. Eluate izotonik bir tuz konsantrasyonu seyreltilmiş ve baculovirus parçacıkları daha fazla ultrasantrifüj kullanarak yoğunlaşmıştır. Bu yöntemi kullanarak, baculovirus bulaşıcı parçacıklar % 25 kurtarma ile ilâ 500-fold konsantre olabilir. Burada açıklanan protokol 1 L kültürlerden üretim ve baculovirus arınma gösterir rağmen yönteminin ölçekli-klinik-grade vektör gen terapisi uygulama için üretmek için bir kapalı sistem süspansiyon kültür up.

Sunulan bir akış diyagramı (şekil 1) protokolüdür. Adımlar Sf9 hücre bacmid baculovirus bir tabak içinde yapisan kültür, serum serbest süspansiyon kültür, nükleaz tedavi ve açıklama Santrifüjü ve filtrasyon tarafından sonraki amplifikasyon üretmek için DNA ile geçici transfection içerir, ve heparin benzeşme Kromatografi kullanarak arıtma konsantrasyon ultrasantrifüj ile izledi.
Sonra çözülme, hücrel...

Bu protokol için baculovirus baculovirus plazmid geçici transfection Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve bir serum serbest süspansiyon kültürde güçlendirilmiş. Süpernatant heparin benzeşme Kromatografi tarafından saf ve ultrasantrifüj tarafından daha da yoğunlaştı. Bu iletişim kuralı üretim ve baculovirus gen terapisi uygulama için arıtma için yararlıdır.

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Bu protokolün genel amacı, böcek hücresi kültüründe baculovirus üretmek, heparin afinite kromatografisi ile saflaştırmak ve ultrasantrifüj ile konsantre etmektir. Nihai ürün, in vivo gen transferi için veya bir aşı olarak kullanılabilir. Bu yöntem, gen tedavisi uygulamaları için saflaştırılmış ve konsantre edilmiş baculovirus kullanmak isteyen araştırmacılara yardımcı olabilir.Baculovirüs partikülleri, insanlarda kullanıldığında inflamasyona veya bir bağışıklık yanıtına yol açabilecek Sf9 kültüründen kaynaklanan hücresel kalıntılar ve proteinler içerebilir. Toksisiteyi önlemek için baculovirüs saflaştırılır ve kontamine partiküllerden ayrıştırılır. Prosedürün bazı kısımları, laboratuvarımdan araştırma asistanı Marilou Narciso tarafından gösterilecektir.Süspansiyon kültürünü kurmak için, böcek kültür ortamındaki 50 mililitre Sf9 hücresini 250 mililitrelik polikarbonat bir Erlenmeyer balonuna ekleyin. Ardından balonu orbital çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Hücrelere iki mililitre P2 basulovirüs stoğu ekleyin ve 28 degrees Celsius sabit sıcaklığı koruyarak 135rpm hızında çalkalayın.Enfeksiyondan dört gün sonra, tüm Sf9 hücre popülasyonu, yüksek titreli bakulovirüs üretiminin bir g

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, heparin afinite kromatografisi kullanarak bakulovirüsü bir böcek hücresi süpernatantından izole etme tekniğini gösteriyoruz. İzolasyon, kolondaki heparin ile bakulovirüs zarfı glikoproteini arasındaki afinite ile kolaylaştırılır.

Heparin Afinite Kromatografisi Tabanlı Bakulovirüs Saflaştırması: Bakulovirüsü Böcek Hücresi Süpernatantından İzole Etmek İçin Bir Teknik

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Kindlins İntegrinlerin yoluyla hücre yapışması temel vardır ama bunların çalışmalar bakteriyel konaklarda rekombinant olarak bunları ifade karşılaşılan zorluk engel olmuştur. Burada bakulovirüs ile enfekte olmuş böcek hücrelerinde bunların verimli üretimi için yöntemleri tarif eder.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Öğrenin gen tedavisi için bakulovirus üretimi ve heparin afiniti kromatografisi ile arındırma yöntemini. Sf9 hücre kültürü ve ultrasantrifüjasyon kullanılarak yüksek saflıkta viral vektör elde edilir.

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Daha fazla video keşfet