Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

Bu protokolün genel amacı, uyarılmış emisyon tükenmesi veya STED mikroskobu için B hücresi immün sinapsındaki aktin ve mikrotübül hücre iskeletlerini boyamak ve yapılarını, mekansal ilişkilerdeki organizasyonlarını görüntülemektir. Bu yöntem, immün sinaps oluşumu sırasında aktin ve mikrotübül hücre iskeletlerinin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere, B hücresi aktivasyonu sırasında hücre iskeleti organizasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çok renkli STED mikroskobunun ana avantajı, aktin hücre iskeletinin, mikrotübül ağının ve anahtar hücre iskeleti ile ilişkili proteinlerin nanometre ölçeğinde çözünürlükte aynı anda görüntülenmesine izin vermesidir.

Bu yöntem B hücresi aktivasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, doğal öldürücü ve T hücreleri gibi diğer bağışıklık hücresi tiplerinin bağışıklık sinaps oluşumuna da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, STED kullanarak eşzamanlı görüntüleme ve çoklu floroforlar için mikroskop ayarlarını optimize etmenin biraz pratik gerektireceğini göreceklerdir. Bu prosedürü Jia ve Madison ile birlikte Kate Choi ve Caitlin Pritchard gösterecek.

Her transfeksiyon başına 2,5 kez 10 ila 6. A20 B-lenfoma hücrelerini santrifüjleyerek ve hücreleri, ilgilenilen plazma DNA'sının bir ila 2,5 mikrogramı ile desteklenmiş 100 mikrolitre transfeksiyon reaktifi içinde yeniden süspanse ederek başlayın. Çözeltileri nazikçe karıştırın ve hücrelerin her bir alikotunu altı oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına aktarın. Her bir oyuktaki hacmi 37 santigrat derece tam ortamla iki mililitreye ayarlayın ve hücreleri 18 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Ertesi sabah, 1,5 18 milimetre yuvarlak cam lamelleri %100 metanole batırın ve lamellerin yaklaşık 10 dakika tamamen kurumasını bekleyin. Kurutulmuş lamelleri 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının ayrı oyuklarına yerleştirin ve her bir lamelin ortasına 400 mikrolitre keçi anti-fare immünoglobulin G antikoru ekleyin, böylece merkezde bir kabarcık oluşur ve kuyuya damlamadan kenarlara yayılır. Lamelleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için lamelleri oyuk başına üç kez bir mililitre steril PBS ile durulayın. Son yıkamadan sonra, her bir lameli hücre tohumlanana kadar bir mililitre taze, steril PBS'de saklayın. Kesilen hücreler hazır olduğunda, bunları santrifüjleme ile 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve peletleri FBS ile desteklenmiş bir mililitre modifiye HEPES tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri mililitre konsantrasyonu başına ikiye 10 ila 5. hücrelere seyreltin ve modifiye edilmiş HEPES tamponlu salin artı FBS'yi deneyin ve her bir lamel bir parafin film parçasına aktarmak için forseps kullanın. Her lamel için 250 mikrolitre hücre ekleyin ve hücrelerin anti-immünoglobulin G kaplı yüzeylere yayılmasını sağlamak için lamelleri karanlıkta 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, her slayttan fazla salini çıkarın ve her bir lameli 350 mikrolitre sabitleyici ile kaplayın ve tüm yüzeyin kaplanmasına dikkat edin.

Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika sonra, fiksatifi her bir lamel kenarından dikkatlice aspire etmek için bir mikropipet kullanın ve lamelleri 500 mikrolitre geçirgenlik ve bloke edici tampon ile yıkayın. Daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 mikrolitre taze geçirgenlik ve bloke edici tampon ile hücreleri geçirgen hale getirin ve bloke edin. Daha sonra, fazla tamponu çıkarın ve hücreleri, oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca ilgilenilen birincil antikorun 50 mikrolitresi ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, lameli yıkama başına 500 mikrolitre boyama tamponu ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her bir lamel üzerine 50 mikrolitre uygun ikincil antikor ekleyin. İkincil antikoru yıkadıktan sonra, bir mikroskop lamına 10 mikrolitre montaj reaktifi ekleyin ve lamelleri hücre tarafı aşağı bakacak şekilde ayrı mikroskop lamlarına monte edin. Ardından, ertesi gün görüntüleme için slaytların gece boyunca karanlıkta kurumasına izin verin.

Hücreleri STED mikroskobu ile görüntülemek için önce STED mikroskobunu açın. Epifloresan aydınlatma lambasındaki lazerleri etkinleştirin ve mikroskop yazılımını açın. STED tükenme lazerleri için parametreleri ayarlayın ve ilk numuneyi mikroskoba yükleyin.

Göz merceğini kullanarak, orta düzeyde GFP ifadesine sahip bir hücre seçmek için örneğe manuel olarak odaklanın. Seçili hücreyi yakınlaştırın ve görüntülenecek ilgi alanını seçin. Odağı, lame en yakın olan hücrenin XY düzlemi odakta olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, yazılımın Edinme sekmesi altında, görüntü alımını sıralı çerçeve alımına ayarlamak için Sıralı Tarama panelindeki Kareler Arası seçeneğini işaretleyin. Her florofor için STED lazer gücünü ayarlayın ve lazer güçlerini deneyde kullanılan floroforlara göre ayarlamak için kaydırma çubuğunu kullanın. Çözünürlüğü artırmak ve arka plan sinyalini azaltmak için Alma ayarlarını açın ve çizgi ve/veya kare ortalamasını artırmak üzere birden büyük bir değer seçmek için açılır menüyü kullanın.

Zaman kapılı STED için uygun floresan sinyalini elde etmek ve çözünürlüğü artırmak için STED lazer gücünü artırmak için her florofor için kazanç seçeneğini ve zaman kazancı için belirli değerleri kontrol edin. Floresan sinyalini çok fazla kaybetmeden çözünürlüğü iyileştirmek için kullanılan mikroskop numunesi ve floroforlar için elde edilen süreyi optimize etmek çok önemlidir. Ardından, tekrarlanabilirliği sağlamak için birden fazla görüntüyü manuel olarak alın ve üreticinin talimatlarına göre bir evrişim giderme yazılım paketi kullanarak görüntüleri çözün

A20 B-lenfoma hücreleri için, immobilize NT immünoglobulin antikorlarına yayılır. Dekonvolüsyon yazılımı ile birlikte kullanılan STED mikroskobu, tek başına konfokal mikroskopiden daha yüksek çözünürlüklü hücre iskeleti yapılarının görüntülerini sağlar. Konfokal görüntülerin dekonvolüsyonu görüntünün çözünürlüğünde önemli bir iyileşme sağlasa da, dekonvolved STED görüntüleri, dekonvolved konfokal görüntülere göre daha ayrıntılı yapısal bilgi sağlar.

Tek renkli STED, tüm B hücresi hücre iskeleti ağının üç boyutlu süper çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için de kullanılabilir. Bu çok renkli STED görüntülerinde, dendritik aktinin periferik halkasının boyanması, mikrotübül boyaması ile bağlantılı olarak gözlemlenebilir. Floresan füzyon proteinleri ile transfekte edilmiş hücreler kullanıldığında, optimal ekspresyon seviyelerine ulaşmak ve aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktlardan kaçınmak önemli hususlar iken, floresan füzyon proteininin çok düşük ekspresyonu da düşük kaliteli görüntülere neden olur.

Tüm ilgi alanını dahil etmek için dikkatli bir odaklanma da önemlidir. Örneğin, bu görüntüde, mikrotübül ağının yalnızca bazı kısımları, lamel en yakın odak düzlemi içindeydi ve bu da numunenin tam bir analizini engelliyordu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki gün içinde tamamlanabilir.

Numune hazırlama ve boyama için bir gün ve STED görüntüleme için bir gün. Hücreleri transfekte etmek için kullanılacak plazma miktarını titre etmeyi unutmamak önemlidir, böylece aşırı ekspresyondan kaynaklanan artefaktlardan kaçınırken görüntüleme sırasında tespit etmek için yeterli bir floresan protein ekspresyonu elde edersiniz. Bu prosedürü takiben, hücre iskeleti dinamiklerini ve organizasyonunu düzenleyen diğer proteinlerin lokalizasyonunu kolaylaştırmak veya diğer hücresel süreçlerde yer alan proteinlerin hücre altı dağılımını görselleştirmek için farklı floresan füzyon proteinlerinin ekspresyonu indüklenebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, immün sinaps oluşumunda rol oynayan hücre iskeleti yapılarının ve proteinlerin görüntülenmesi için STED mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Glutaraldehit gibi fiksatiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu tür reaktifleri kullanırken kimyasal çeker ocakta çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.