Hızlandırılmış, etiket içermeyen, nicel faz uyuyan ve aktif insan kanser hücrelerinin çalışma görüntüleme

Bu deneyin genel amacı, insan osteosarkom hücrelerinin anjiyojenik ve anjiyojenik olmayan fenotiplerini, hücre morfolojisi, proliferasyonu ve motilite analizlerini birleştiren sistematik bir şekilde kantitatif olarak karakterize etmektir. Bu yöntem, insan kanserinin oluşumu ve ilerlemesi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Özellikle, tümör dormansisinden kaçış ve endojenik anahtar.

Bu tekniğin temel avantajı, çok hücreli parametrelerin bu entegre, yüksek yayılımlı yöntemle aynı anda analiz edilebilmesidir. Bu, hücre alanı, hücre kalınlığı, hücre hacmi, çoğalma hızı, iki katına çıkma süresi, hareketlilik hızı, göç ve hareketliliği içerir. Başlamak için, kültür ortamını bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.

Daha sonra anjiyojenik ve anjiyojenik olmayan insan osteosarkom hücrelerinin kriyojenik şişelerini sıvı nitrojen tankından çıkarın. Şişelerin altını 37 santigrat derece su banyosuna daldırın ve çözülme işlemini hızlandırmak için kriyojenik şişeleri hafifçe sallayın. Hücreler çözülür çözülmez, şişeye% 70 etanol püskürtün ve sterilize etmek için şişeyi silin.

Daha sonra hücre süspansiyonunu flakondan hemen aspire edin ve 10 mililitre ısıtılmış kültür ortamında yavaşça süspanse edin. Daha sonra, hücreleri pelet yapmak için hücre süspansiyonlarını beş dakika santrifüjleyin. Kaputun içine geri dönün, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre ısıtılmış kültür ortamı ile yeniden askıya alın.

Ardından hücre süspansiyonunu bir T75 şişesine aktarın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez nazikçe pipetleyin. Şişeyi bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin en az 12 saat bağlanmasına izin verin.

Kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Hücreler yüzde 80 ila 100 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını şişeden çıkarın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre steril PBS ile yıkayın. Daha sonra şişeye bir mililitre %0.25 tripson EDTA çözeltisi ekleyin ve şişeyi kısaca döndürün.

Şişeyi iki ila üç dakika inkübe edin ve ardından hücrelerin yuvarlandığından ve ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mililitre kültür ortamı eklemek için bir pipet kullanın ve kalan hücre agregalarını parçalamak için ortamı birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri saydıktan sonra, iki milyonunu yeni bir T75 şişesine tohumlayın.

Şişeyi bir inkübatöre yerleştirin ve kantitatif faz görüntüleme deneyi için hücreleri tohumlamadan önce hücreleri yüzde 80 ila 100 arasında bir birleşim noktasına kadar büyütün. Tripson sindirimi ve tohum anjiyojenik ve anjiyojenik olmayan insan osteosarkom hücrelerini, kuyucuk başına 50.000 ila 300.000 hücre yoğunluğunda altı oyuklu plakada hasat edin. Hücreleri toplam beş mililitre kültür ortamı ile örtün.

Ardından, hücrelerin yapışması için zaman tanımak için plakaları en az 12 saat inkübe edin. Görüntülemeden önce ortamı yeni ortamla değiştirin. Bir kapak kızağını akan deiyonize su ile birkaç kez durulayarak temizleyin.

Daha sonra 15 dakika boyunca% 75 etanol çözeltisine batırın. Sterilize edilmiş örtü kızağını kuruması için laminer bir akış başlığına yerleştirin. Daha sonra, belirgin kabarcıklardan kaçınarak kapak kızağını dikkatlice altı kuyulu bir plakaya yerleştirin.

En az 15 dakika dengelemek için plakayı inkübatöre yerleştirin. Plakanın kapağında buğu oluşursa, görüntülemeden önce silerek temizlemek için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Kantitatif faz görüntüleme yazılımını açın ve sistemi başlatın.

Pozlama süresi, desen kontrastı ve hologram gürültüsünün kendi kendine kalibrasyonunda değerlerin kabul edilebilir olduğundan emin olun. Daha sonra, altı kuyulu plakayı kantitatif faz görüntü mikroskobunun sahnesine yerleştirin. Yazılıma geri dönün, canlı yakalamaya tıklayın.

Ardından yazılım odak menüsüne gidin ve manuel'i seçin. Ardından, mikroskop ayar menüsüne gidin ve faz görüntülerindeki hücrelerin ana hatlarını elde etmek için çalışma mesafesini ayarlayarak hücrelerin faz görüntülerini kabaca odaklayın. İşiniz bittiğinde, yazılım odak menüsüne geri dönün ve odak ayarını otomatik olarak değiştirin.

Şimdi yeni deneye tıklayın. Fareyi veya sayısal tuş takımındaki ok tuşlarını kullanarak görüntü alma konumlarını seçmeye başlayın. Her seçimden sonra hatırla'yı tıklayın.

Konumların tümü seçildikten sonra, hızlandırılmış çekim bölümüne gidin ve görüntüleme aralıklarını beş dakikadan kısa olacak ve toplam süre 48 saat olacak şekilde ayarlayın. Yakala'yı tıklayarak denemeyi başlatın. Bu, her aralık zaman noktasında seçilen konumlarda görüntüleri otomatik olarak odaklayacak ve alacaktır.

Görüntü alımını takiben, önce hücreleri tanımla'ya tıklayarak hücrelerin morfolojisini analiz edin. Arka plan eşiğinin sayısal ayarını, hücre alanları arka plan gürültüsünden iyi bir şekilde ayrılacak şekilde ayarlayın. Ardından, her hücrenin yalnızca bir çekirdeğe sahip olduğundan emin olmak için nesne boyutu için ayar numarasını ayarlayın.

El ile değişiklikleri kullanarak, bu gereksinime uymayan hücre segmentlerini el ile değiştirin. Ardından, hücreleri analiz etmek için yazılımdaki verileri analiz et işlevini kullanın. Yeni analiz'e tıklayarak yeni bir veri analizi başlatın.

Seçili görüntüleri kaynak çerçeveler sekmesine sürükleyin ve her bir hücre için hücre alanı, optik kalınlık ve hacim dahil olmak üzere hücre morfolojisi parametrelerini kaydedin. İşiniz bittiğinde, dağılım grafiğini veya histogram modunu seçin ve verileri tablo veya şekil olarak dışa aktarın. 12 saat arayla en az beş görüntü seçin ve yazılım tarafından sağlanan hücre numaralarını kaydedin.

İlk hücre numaralarıyla normalleştirerek ve ardından hücre numaralarını çizerek hücrelerin çoğalma oranını tahmin edin. Son olarak, üstel bir büyüme eğrisi kullanarak veri noktalarını sığdırarak iki katına çıkma süresini tahmin edin. Hücre hareketini analiz etmek için yazılımdaki hücreleri izle işlevini kullanın.

Yeni bir veri analizi başlatmak için yeni analize tıklayarak başlayın. Ardından, ilgilendiğiniz dönemden bir dizi görüntüyü kaynak çerçeveler sekmesine sürükleyin. Ardından, hücre ekle seçim modunda, üzerlerine tıklayarak rastgele 10 ila 30 hücre seçin.

Görüntü serisindeki izlemeyi gözden geçirdiğinizden emin olun. Sistemin bir hücrenin izini kaybetmesi veya yanlış hücreyi izlemesi durumunda, hücreleri tanımlamak için tanımla'ya tıklayarak veya seçim moduna gidip bir hücrenin konumunu değiştirmek için konumu değiştir'e tıklayarak izleme hücresini manuel olarak ayarlayın. Bitirdiğinizde, hareketi çizmeye gidin ve hücre yörüngelerinin satır grafiğini seçin veya hareketlilik hızı, hareketlilik, göç ve göç doğrudanlığı gibi hareketle ilgili diğer parametreler için çizim özelliklerine ve çizime gidin.

Verileri tablo veya şekil olarak dışa aktarın. Bu protokolde kantitatif faz görüntüleri holograf olarak sunulmaktadır. Burada gösterilen hücreler, anjiyojenik ve anjiyojenik olmayan insan osteosarkom hücreleri için tipik hücre morfolojisini göstermektedir.

Hücre kalınlığı, kırılma indisi ve optik yol uzunluğu ile hesaplanır ve burada bir dağılım grafiği olarak gösterilir. İki farklı hücre feno tipi, farklı dağılım kalıpları sergiledi ve anjiyojenik hücrelerin, anjiyojenik olmayan hücrelerden daha küçük hücre alanlarına ve daha büyük bir hücre kalınlığına sahip olduğunu gösterdi. İki hücre tipinin hücre proliferasyon hızı, bölümlere ayrılmış ve iki gün boyunca yayılan bu gibi 2D görüntülerden hesaplanabilir.

Bu spesifik hücre tipleri için önemli bir fark bulunamamıştır. Hücrelerin hücre hareket özelliklerini belirlemek için, tek tek hücrelerin seçilmesi ve zaman içinde izlenmesi gerekir. Burada izlenen hücreler farklı renklerle özetlenmiştir.

Her bir hücre, dört saat boyunca, burada açıklanan toplam yol yörüngeleri ile izlendi, burada sıfır, sıfır noktası başlangıç konumlarıdır ve son konumları renkli nokta ile gösterilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre morfolojik ve davranış parametrelerinin bir panelini kantitatif olarak karşılaştırmak için kantitatif faz görüntülemenin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu durumda, anjiyojenik ve anjiyojenik olmayan hücre fenotipleri arasında.

Bu gelişmeden sonra bu teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların tümör uyku halinden kaçışı ve bu süreçte anjiyojenisin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Sürekli ve etiketleme yapmayan bir platformda. İnsan hücre hatlarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.