Name: Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Keşfedin, çip tabanlı dijital PCR ile mide kanserinde nadir CDH1 transkript varyantlarını taze donmuş dokularda nasıl tespit edeceğinizi. Bu hassas yöntem, düşük yoğunluktaki hedefleri geleneksel PCR'a göre daha kesin bir şekilde saptar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Gráinne Tierney Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Protokol IRST insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
Not: Bu yordam insan taze donmuş dokularda cDNA moleküllerinin düşük bir sayı tespiti için özel olarak tasarlanmıştır. Doku bölümleri hala donmuş, hasta kaynaklı önceden doğrulanmış Gastrik tümör ya da normal doku örnekleri ise kuru buza kesmiş olduk.
1. RNA izolasyon ve arıtma
<ol><li>
RNA çıkarma Not: RNA izolasyon belirli bir ürün kullanarak başlık altında gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek). Ancak, yalıtım kitleri çeşitli ticari olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Düzgün kesilmiş taze donmuş doku örneği 1,5 mL tüp içinde 50-100 mg 1 mL RNA izolasyon reaktif ve girdap ile şiddetle-gecede-80 ° C'de tüpler için 15 s. Incubate homojenize.</li>
		<li>Örnek 5 min ve mix için oda sıcaklığında vortexing 15 tarafından içeren tüp kuluçkaya s.</li>
		<li>Tüp buz üstünde tutmak, kloroform ve şiddetle 15 için girdap 200 µL ekleyin s.</li>
		<li>60 s için oda sıcaklığında tüpler ve 4 ° C'de 15 dakika 12.000 x g, santrifüj kuluçkaya</li>
		<li>1.5 mL tüp içinde sulu faz transfer ve glikojen 20 µg ekleyin. Not: Dikkatle Interphase veya organik katman kirliliği azaltmak için aktarılmasını önlemek önemlidir.</li>
		<li>İsopropanol, mix ve 10 min için buz üzerinde kuluçkaya tüpü ters çevirme 500 µL ekleyin.</li>
		<li>Tüp 4 ° C'de RNA çökelti 15dk için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi. Not: RNA jel benzeri Pelet yan ve tüp, sık sık aralıklarla sonra görünmez altındaki mevcut olacaktır.</li>
		<li>Süpernatant çökelti bozmadan kaldırmak ve pipetting tarafından % 75 etanol 1 mL ile yıkayın.</li>
		<li>Tüp 7,500 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Pelet bozmadan kaldırın.</li>
		<li>Çökelti saydam hale gelene kadar kuru ve su RNase free 50 µL içinde erimesi Pelet izin.</li>
		<li>Örnekleri miktar önce en az bir gecede-80 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genomik DNA eleme ve RNA arıtma Not: bir sütun tabanlı RNA saflaştırma tarafından takip bir Dnaz sindirim adım bulaşıcı DNA sindirmek için düşük-bereket hedefleri analizleri için önerilir.<ol>
<li>I (1500 Kunitz adet) 550 µL RNase free, kullanarak, karışımı yavaşça şişeyi, ters çevirme tarafından su ve Sulandırılan hisse senedi çözüm aliquots bölmek lyophilized Dnaz geçiyoruz.</li>
		<li>Bir 1,5 mL tüp içinde örnek hesaplanan hacmi RNA'ın 15 µg ile transfer için 10 µL Dnaz sindirim tampon seti (listelenen Tablo malzemeler), 2,5 µL Dnaz, ben hisse senedi çözüm ve RNase free su 100 µL. için Incubate, oda sıcaklığında 10 dakika için.</li>
		<li>Doku lizis arabelleği 350 µL ekleyin ( Malzemeleri masaseti, görmek) ve mix pipetting tarafından.</li>
		<li>Pipetting tarafından 250 µL % 100 etanol ve karışımı ekleyin.</li>
		<li>Tüm birimi (700 µL) yeni spin sütun ve 15 için 12.000 x g, santrifüj içine transfer s.</li>
		<li>Filtrenin yeni bir koleksiyon tüp içine aktarmak, sütun ve 2 min için 12.000 x g, santrifüj 500 µL % 80 etanol ekleyin.</li>
		<li>Spin sütun ve 5 min için 12.000 x g, santrifüj kapak filtre kuruması için yeni bir koleksiyon tüp ile açın; ardından filtreyi bir 1,5 mL tüp aktarın.</li>
		<li>14 µL RNase free su doğrudan filtre sütun ve 1 dk. için 12.000 x g, santrifüj ekleyin.</li>
		<li>Buz üzerinde örnekleri tutmak ve örnek 2 µL bir tezgah üstü Spektrofotometre kullanarak miktar geçin veya RNA-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cDNA sentezi
<ol><li>RNA, ana Mix 4 µL, ters transkriptaz ve RNase free su steril bir PCR tüp 20 µL son hacmiyle 1 µL yer 1000 ng. Karışımı yavaşça ve spin aşağı.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar uygulayarak bir termal cycler tepki karışımda kuluçkaya: 25 ° C, 42 ° C, 85 ° C'de 5 dk, 30 dk, 5 dk</li>
	<li>Kısaca tüpler santrifüj kapasitesi ve dPCR analiz için devam etmek ya da -20 ° gerekinceye kadar C'de depolayın.</li>
</ol>3. dijital PCR reaksiyon kurmak
<ol><li>
dPCR reaksiyon mix ve hazırlık örnek
	<ol>
<li>Ana mix ve tahlil için en az 20 dakika oda sıcaklığında erimek.</li>
		<li>CDNA örnekleri için 300 bir konsantrasyon seyreltik su 6 µL ng.</li>
		<li>Yavaşça girdap master mix ve steril tüp 8.7 µL ana karışımı, CDH1a özel tasarlanmış tahlil astar 0,87 µL ve 1.83 µL nükleaz ücretsiz su karışımında 11,4 µL son bir hacim için hazırlamak. Not: CDH1a özel tasarlanmış tahlil astar Ayrıntılar için Malzemeler tablobakın.</li>
		<li>Hazırlanan karışımı 11,4 µL seyreltilmiş cDNA örneğe transfer karışımı yavaşça ve kısaca santrifüj kapasitesi. Not: Pipetting birim kaybı telafi etmek için % 20 fazla birimler içerir. Mix tüm örneklerini ve bir şablon kontrol (NTC) için hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çip hazırlık Not: en iyi sonuçlar için en kısa zamanda fişleri yükleyin.<ol>
<li>Çip yükleyici takın ve gösterge ışığı yeşile kadar bekleyin.</li>
		<li>Daldırma sıvı şırınganın kapağını yavaşça pistonu geri çekerek çıkarın 1-2 mm ve serbest bırakmak o bu adımı kolaylaştırmak ve bir ucu ile değiştirmek için.</li>
		<li>Yeni bir çip ve örnek ile ilişkilendirmek için kapak üzerinde yazılı kodunu not al.</li>
		<li>Kapağı dikkatlice onun yanında tutun, koruyucu film peel away ve kapak ile yapışkan yüzü yukarı doğru yönde yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde iç kısmına dokunmamaya dikkat çekici bir yonga, almak ve kelepçe açmak için kolu aşağı basarak doğru pozisyonda çip yuvada üzerine yükleyin.</li>
		<li>Yeni bir yükleme bıçak üzerine yükleyici yüklemek ve yavaşça sıkıca yerinde olduğundan emin olmak için itin.</li>
		<li>14,5 µL üzerine yükleme bıçak dPCR reaksiyon karışımı hava kabarcıkları yapmadan aktarmak veya bıçak, hangi basın sonra çipi birimde dağıtmak için düğmesini yükleme siyah saptırma.</li>
		<li>Daldırma sıvı şırınga ucu ile yüzey dokunmak dikkat çekici küçük parça yüzeyine yaklaşık 20 damla aktarmak için kullanın. Not: Tüm yüzey üzerinde kenarları sıvı dökmeden karşılamak önemlidir.</li>
		<li>Çip temas gel de için 15 aşağı tuşuna basın kapak yapmak için yükleyici kol döndürmek s.</li>
		<li>Çip serbest bırakmak ve kol konumuna döndürmek için kapak düğmesine basın.</li>
		<li>Birleştirilmiş çip bir 45 ° açıyla tut ve dikkatle daldırma sıvı dolgu bağlantı noktası üzerinden şırınga dağıtmak, biraz hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olmak için çip döndürün ve herhangi bir aşırı sıvı bir steril bezle çıkarın.</li>
		<li>Yavaşça uzakta etiket üstünde tepe-in belgili tanımlık küçük parça kapağı ve sıkıştırma için en az 5 dolgu bağlantı noktası üzerinden peeling tarafından çip durumda mühür s.</li>
		<li>Çip termal cycler yüklemek için hazır kadar karanlıkta saklamak. Not: Hazırlanan cips içinde 2 h kullanılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
dPCR tepki
	<ol>
<li>Kapağı açın ve tek bir blok kullanıldığında bile bağdaştırıcıların her iki blok için yükleyin.</li>
		<li>Fişleri örnek blok doğru pozisyonda yerleştirin. Not: Dolgu bağlantı noktası termal cycler yükseltilmiş bir konumda float üst herhangi bir hava kabarcıkları çip pencere bozmadan izin vermek için önüne doğru odaklı olmalıdır. Boş cips iki blok dengelemek için kullanın.</li>
		<li>Termal pad tamamen fişleri kapsayacak şekilde örnek blok yatıyordu.</li>
		<li>Kapağı kapatın ve aşağıdaki koşullar uygulama çalıştırmak, PCR başlatın: 10 dk; 96 ° C'de tutun 60 ° C için 2 dk ve 98 ° C 45 devir için 30 s; 2 min için 60 ° C'de tutun; 4 ° C'de tutun Termal cycler açmak ve fiş en az 10 dakika oda sıcaklığında erimek. Not: Chip analiz bir saat içinde gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çipi analiz
	<ol>
<li>Araç kapağını açın ve termal yastıkları kaldırın, sonra fişleri bağdaştırıcıları kaldırın. Not: çipleri analiz kadar karanlık, temiz bir yerde saklayın.</li>
		<li>Çip yüzeyi isopropanol ve steril mendil ile temizleyin. Not: her küçük parça için sızıntıları veya olası sorunları inceleyin.</li>
		<li>USB verileri kaydetmek için Dedektör sistemi yerleştirin.</li>
		<li>Detektör sisteminin çip tepsisini açmak, çipi yukarı doğru pozisyonda yük ve tepsiyi kapatın.</li>
		<li>30 bekle s işleme, sonra yonga kaldırmak ve bir sonraki ekleyin.</li>
		<li>İşlenmiş yongaları için tamamlanması daha sonra bir bilgisayara dosya aktarmak için USB takın analizi için bekleyin. Not: Toplam analiz yaklaşık 2 3 dk/çip için zamanı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. veri analizi ve yorumu
<ol><li>Aşağı akım analizleri yürütmek için gereken bulut tabanlı yazılım platformu bağlayın.</li>
	<li>Bir proje oluşturmak ve tüm veri dosyaları faiz fiş alın.</li>
	<li>Örnek adını girin; boya ve tahlil "Define Chips" sekmesinde kullanılan seçin.</li>
	<li>Çipi nasıl iyice örnek çip dolu olduğunu ve ne kadar çok sayıda veri noktası değerlendirilebilen denetleme "Gözden geçirme veri" sekmesinde görüntülenmesi tarafından kabul edilebilir olup olmadığını. Not: daha az 13.000 değerlendirilebilen veri noktaları ile fiş reddetmek.</li>
	<li>Ekranın sağ tarafındaki seçili çipin dağılım çizim için taşımak; 6000 floresein amidite (FAM) muhabir boya sinyalleri (y ekseni) için bir eşik için tüm fişleri geçerli. Not: kullanılan deneyleri temel alınarak ayarlanan eşik değişebilir.</li>
	<li>Kement aracını kullanarak ve "belli değil" tuşuna basarak dağılım göreli oracıkta seçerek yanlış pozitif sonuçlar önlemek için herhangi bir şüpheli olumlu sinyaller arsa kaldır. Tüm kalan olumlu noktalar analiz nadir hedef kopyalarını cDNA varlığını gösterir.</li>
</ol>

<ol><li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li>
<li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer%3A+cellular+consequences%2C+clinical+applications+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li>
<li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin%2FCDH1+intron2%3A+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li>
<li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+%28E-cadherin%29+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li>
<li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Assays+Part+I%3A+Partitioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li>
<li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR%3A+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li>
<li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Transl.Med%22%5BJournal%5D)">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li>
<li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897(2017).</li>
<li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849(2015).</li>
<li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296(2013).</li>
</ol>

Yazarlar bu iş için hiçbir çıkar çatışmaları rapor.

dPCR Aslında DNA moleküler ölçümleri10,11,12,13 ve miktar mikroRNA ve RNA transkript5için bu teknoloji uyarlanmıştır zamanında geliştirildi, 14,15. Bu protokol için taze donmuş Doku örneklerinden elde edilen nadir transkript tespiti dahil etmek için uygulamaların listesini genişletmiştir. Bu amaç için...

CDH1 gen E-cadherin, önemli bir faktör normal Gastrik epitel hücre adezyon, hayatta kalma, yayılmasını önleme ve geçiş1düzenlenmesi aracılığıyla bakım dahil için kodlar. Zararlı germline sonucunda E-cadherin protein kaybı veya somatik değişikliklere CDH1 GC2,3gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Sigara-kurallı transkript intron 2 gen / doğan da mide karsinojenezis4,5' te bir rol olan. Özellikle, bir tür transkript, CDH1a, GC hücre hatlarında ifade edilecek göstermiştir ama yok normal mide4. Son zamanlarda CDH1a GC doku örneklerinde dPCR çip tabanlı5kullanarak GC hastalardan tespit ettik. dPCR değerlendirmek, ilk kez, CDH1a gen transkript bağırsak GC ve normal doku varlığı için kullanıldı.
Gen ifadesinin belirlemek için altın standart yöntem gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) dir. Ancak, sonuçta elde edilen veriler bazen değişken olabilir ve kalitesiz, özellikle ne zaman hedef örnek düzeyi düşüktür. Bu değişkenlik polimeraz etkinlik ve astar tavlama, non-spesifik amplifikasyon ve rekabetçi yan reaksiyonlar6yol inhibe kirletici neden olabilir.
DPCR Temel biyokimyasal prensipleri qPCR benzer olmakla birlikte, dPCR genomik DNA (gDNA) çok hassas ölçümler için izin bazı avantajları gösterir / Tamamlayıcı DNA (cDNA) molekülleri. Gerçekten de, dPCR böylece her de sıfır veya bir tek hedef molekül içerir, kalibre edilmiş bir örnek wells, binlerce içine bölümleme üzerinde dayanan bir son nokta reaksiyondur. Amplifikasyon sonra yalnızca bir kopyasını hedef içeren kuyu içinde oluşur ve floresan bir sinyal ile belirtilir. Orijinal örnek hedef molekülleri kesin sayısı sonra binom Poisson istatistikleri7kullanarak toplam bölümler için olumlu oranını belirleyerek hesaplanabilir.
Buna ek olarak, dPCR teknik standart bir eğri çalıştırmak için gereksinimini ortadan kaldırır ve bu nedenle, ilişkili önyargı ve değişkenliği, hedefleri8,9; doğrudan bir miktar için izin kirletici ve verimliliği inhibitörleri10onun yüksek tolerans nedeniyle bağımsız olarak daha hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir; daha hassas ve qPCR daha belirli ve böylece nadir bir hedef tespiti için güvenilir bir yöntemdir. Son olarak, arka plan molekülleri ile rekabet azaltır örnek birden çok tepkiler bölümleme ve hedef tespit, amplifikasyon mümkün verme ve gDNA/cDNA6 tek molekülleri algılama kolaylaştırmak sınırı artırır . Algılama ve miktar Nükleik asitlerin çip tabanlı dPCR tarafından giderek uygulanmış sayı varyasyon kopyalamak için miktar DNA parçaları ve mutasyon analizleri verilen11,12,13, hassas ve düşük malzeme gereksinimi yönteminin girdi. Buna ek olarak, dPCR son zamanlarda her iki mikroRNA'lar14 ve gen transkript5,15analiz entegre edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>TRIazol Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Temizleme kiti</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez kiti</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Dijital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT özel tasarlanmış test</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td> <td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimize edilmiş test konsantrasyonları: 900 nM (F),&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Dijital PCR 20K Çip Kiti v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresk</td><td>Termo&nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR Sistemi 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Çift Düz Blok Numune Modülü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Çift Düz Blok için 3D Eğimli Taban GeneAmp PCR Sistemi 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>Düz Blok Termal Döngüleyici için QuantStudio 3D Dijital PCR Çip Adaptör Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Dijital PCR Çip Yükleyici</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>Güç kablolu QuantStudio 3D Dijital PCR Cihazı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

bir cdh1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital pcr tarafından algılanması

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, CDH1 gene, kanonik olmayan bir transkript bulundu bazı mide kanseri (GC) hücre hatlarında ifade edilecek yok ise normal mide mukozasında. Son zamanlarda, GC ile hastalardan elde edilen taze donmuş tümör dokularda CDH1a transkript varyantı tespit ettik. Bu varyant doku örneklerinde ifade burada sunulan çip tabanlı dijital PCR (dPCR) yaklaşım tarafından araştırılmıştır. dPCR Nükleik asitlerin doğru güçlü ve son derece hassas bir ölçüm için potansiyel sunmaktadır ve giderek farklı alanlardan birçok uygulama için kullanılmaktadır. dPCR nadir hedefleri tespit yeteneğine sahiptir; Buna ek olarak, dPCR Nükleik asitlerin KALİBRATÖRLER ve standart Eğriler için gerek kalmadan mutlak ve kesin miktar için imkanı sunuyor. Aslında, reaksiyon bölümleme amplifikasyon ve toleransı inhibitörleri ile artırır arka plan hedef zenginleştiriyor. Bu tür özellikleri dPCR CDH1a nadir transkript tespiti için optimum bir takım olun.

Burada sunulan yordamı kullanarak, Gastrik taze donmuş dokularda nadir transkript değişken CDH1a bir ifade için kontrol ettik. DPCR göre analiz 21 eşleştirilmiş normal ve kanser doku örnekleri ve 11 ek tümör örnekleri gerçekleştirildi. CDH1a 32 üzerinden 15 (% 47) tümör tespit iken bu nadir transkript5varlığı yok normal doku örneği gösterdi. Homojen olmayan yükleme çiplerle olduğu gibi bizim analizi, daha az 13.000 veri noktaları ile fiş, çevrildi...

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Bu yöntemin genel amacı, çip bazlı dijital PCR ile taze donmuş dokulardaki nadir transkript varyantlarını tespit etmektir. Bu yöntem, karsinogenezde rol oynayabilecek nadir transkript varyantlarının tespiti gibi kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düşük miktarda bulunan hedeflerin tespit edilmesine izin vermesi, altın standart kantitatif PCR'ye göre hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği artırmasıdır.Bu yöntem, taze donmuş insan dokularında düşük sayıda cDNA molekülünün tespiti hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer biyolojik numune türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü çipleri hazırlama ve analiz için parametreleri tanımlama konusunda biraz beceri kazanmak gerekir. Başlamak için, ana karışımın ve tahlilin oda sıcaklığında en az 20 dakika çözülmesine izin verin.Ardından, cDNA örneklerinin altı mikrolitrelik alikotu ile 0.5 mililitrelik tüpler yükleyin. Ayrıca, şablonsuz bir kontrol tüpü yapın. Daha sonra, ana karışımı nazikçe girdaplayın ve reaksiyon başına 8.7 mikrolitreyi steril bir tüpe alikotlayın.Daha sonra, her reaksiyon için 0.87 mikrolitre özel tahlil astarı ekleyin ve 1.83 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Kombinasyonu yavaşça karıştırın ve cDNA içeren her tüpe 11.4 mikrolitre aktarın ve şablon kontrolüne geçin. Ardından, tüpleri hafifçe karıştırın ve tüp içeriğini nabız santrifüjleme kullanarak bir araya getirin.En iyi sonuçlar için talaşları mümkün olan en kısa sürede yükleyin. Talaş yükleyiciyi prize takın ve gösterge ışığı yeşile dönene kadar bekleyin. Ardından, pistonu bir ila iki milimetreye hafifçe çekerek daldırma sıvısı şırıngasını hazırlayın, ardından kapağı çıkarın ve ucu ekleyin.Ardından, yeni bir çipin kapağında yazan kodu not edin. Ardından kapağı dikkatlice yandan tutun, koruyucu filmi soyun ve yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde kapak yuvasına yerleştirin. Şimdi, kelepçeyi açmak için kolu aşağı bastırın ve çipi dikkatlice talaş yuvasına yükleyin.Ardından, yükleyiciye yeni bir yükleme bıçağı yerleştirin. Sıkıca yerine oturduğundan emin olmak için hafifçe itin. Şimdi, 14,5 mikrolitre reaksiyon karışımını yükleme bıçağına aktarın.Hava kabarcığı yapmayın ve bıçağı saptırmayın. Ardından, sesi çipe dağıtmak için siyah yükleme düğmesine basın. Yükleme bıçağının yerinde olduğunu doğrulamak önemlidir.Ardından, bıçağı doldururken, kabarcıkların girmesini önlemek için pipeti ikinci durağa kadar bastırmayın. Ayrıca, bıçağı uçla saptırmayın. Çip yüzeyine yaklaşık 20 damla daldırma sıvısı aktarmak için şırıngayı kullanarak devam edin.Uç kısmı ile yüzeye temas etmemeye özen gösterin ve yüzeyi taşmadan tamamen kaplayın. Ardından, kapağın çip ile temas etmesini sağlamak için yükleyici kolunu çevirin ve 15 saniye boyunca aşağı bastırın. Ardından, talaşı serbest bırakmak için kapak düğmesine basın ve yükleyici kolunu dinlenme konumuna geri getirin.Şimdi, kelepçeyi açın ve daldırma sıvısını bir şırınga aracılığıyla doldurma portundan dikkatlice dağıtmak için monte edilmiş çipi 45 derecelik bir açıyla tutun. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için çipi hafifçe döndürün ve ardından fazla sıvıyı steril bir mendille çıkarın. Çipin kenarına daldırma sıvısı dökmekten kaçının.Böyle bir durumda, sızdırmazlıktan önce fazlalığı dikkatlice çıkarın. Son olarak, kapaktaki etiketi nazikçe soyarak ve ardından doldurma portunu en az beş saniye bloke ederek talaş kutusunu kapatın. Şimdi, çipi iki saat içinde kullanın ve o zamana kadar karanlıkta saklayın.Reaksiyonu ayarlamak için kapağı açın ve tek bir blok kullanılsa bile adaptörleri her iki bloğa da takın. Ardından, numune bloklarının üzerine bir çip yerleştirin ve doldurma portlarını termal döngüleyicinin önüne doğru yönlendirin ve portu hafifçe yükseltin. İki bloğu dengelemek için boş fişler kullanın.Ardından, talaşları tamamen kaplamak için termal pedi kurulumun üzerine yerleştirin. Ardından döngüleri programlayın, kapağı kapatın ve reaksiyonu başlatın. Reaksiyon bittiğinde, termal döngüleyiciyi kapatın, termal pedleri çıkarın ve ardından talaşları çıkarın.Cipslerin karanlıkta en az 10 dakika oda sıcaklığında çözülmesine izin verin ve bir saat içinde analiz edin. Talaş yüzeyini sızıntı veya diğer sorunlar açısından incelerken izopropanol ile temizleyin. Verileri kaydetmek için, verilerin kaydedilebileceği dedektör sistemine bir USB bellek çubuğu yerleştirin.Ardından, dedektör sisteminin çip tepsisini açın ve çipi yüzü yukarı bakacak şekilde yükleyin. Tepsiyi kapatın ve verilerin işlenmesi için 30 saniye bekleyin. Ardından çipi çıkarın ve bir sonraki çip için işlemi tekrarlayın.Ardından, USB çubuğunu dedektörden bir bilgisayara taşıyın ve dosyaları aktarın. Bulut tabanlı yazılımı açın, ardından bir proje oluşturun ve ilgilenilen çipler için tüm veri dosyalarını içe aktarın. Ardından, Cipsleri Tanımla sekmesi altında, kullanılan boyayı ve tahlili seçin.Çipin kabul edilebilir olup olmadığını, Verileri İncele sekmesinde görselleştirerek belirleyin. Numune iyi yüklendiyse, en az 13.000 nokta kullanılabilir olmalıdır. Ardından, seçilen çip için dağılım grafiğine bakın.Burada, tahlil türü tarafından tanımlanan bir eşik uygulayın. Floresein amid raportör boya sinyali için 6.000 eşik kullanın. Şimdi, yanlış pozitiflerle sonuçlanabilecek şüpheli sinyalleri kaldırın.Kement aracını kullanarak dağılım grafiğindeki şüpheli noktayı seçin ve Belirsiz seçeneğini belirleyin. Kalan tüm pozitif noktalar, analiz edilen nadir hedefin cDNA kopyalarının varlığını gösterir. Burada sunulan prosedürü kullanarak, mide taze dondurulmuş dokularda nadir transkript varyantı CDH1a'nın ekspresyonunu kontrol ettik.Çipin birden fazla baloncuğu, tek bir büyük baloncuğu veya 13.000'den az veri noktası varsa, analizden çıkarıldı. Şablon yok kontrolünde FAM kanalı için seçilen 6.000 eşiğinin üzerinde hiçbir pozitif sinyal mevcut değildi. Sarı noktalar amplifikasyon olmadığını gösterir.İnce bir çip analizi, düşük kaliteli veri noktalarını filtreledi ve belirsiz sonuç riskini ortadan kaldırdı. Amplifikasyonu gösteren mavi bir sinyal bulunduğunda, çipin tam sınırlarında veya baloncukların etrafındaysa, sinyal atlandı. Benzer şekilde, yanlış pozitif riskini daha da önlemek için, seçilen FAM eşiğinin üzerindeki ve grafiğin en sağındaki sinyallerin spesifik olması muhtemeldi ve ayrıca filtrelendi.21 eşleştirilmiş normal ve kanser doku örneği ve 11 ek tümör örneği analiz edildi. Genel olarak, nadir transkript CDH1a, 32 tümörün 15'inde tespit edilebilirdi. Buna karşılık, 21 kontrol dokusu örneğinin hiçbiri bu nadir transkriptin varlığını göstermedi.Bu videoyu izledikten sonra, çip bazlı dijital PCR ile taze donmuş dokuda nadir görülen bir transkript varyantının nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, numune sayısına bağlı olarak altı ila sekiz saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numuneyi bıçağa doğru bir şekilde yüklemeyi unutmamak önemlidir.Geliştirilmesinden sonra bu teknik, moleküler tanı alanındaki araştırmacıların kanser hastalarında nadir görülen dizi varyantlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Bu video, nadir transkript varyantlarını tespit etmede yararlı olan dijital PCR tekniğinin bir varyasyonu olan çip tabanlı dijital PCR'yi göstermektedir. PCR reaksiyonu, her biri bağımsız bir reaksiyon olarak işlev gören bir nanoakışkan çipin odalarına bölünür. Güçlendirilmiş hedeflere sahip odalardan gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunede nadir transkript varyantlarının varlığını doğrular.

Nanoakışkan bir çip kullanarak nadir transkript varyantlarını tespit etmek için çip tabanlı dijital PCR

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Dijital polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid türevleri ve DNA kopyalama numara türevleri yüksek-duyarlı tespiti için yararlı bir araçtır. Burada, biz insan genomu digital PCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak nadir versiyonlarında ölçmek için kritik noktalar göstermek.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Burada, kanserde TMEM200A biyolojik fonksiyonlarını incelemek için çoklu biyoinformatik araçların birleştirildiği bir protokol sunulmaktadır. Ek olarak, biyoinformatik tahminleri deneysel olarak da doğruluyoruz.

Pan-Kanser Biyobelirteci Olarak TMEM200A'in Multiomik Analizi

Bu protokol, bir iyon yarı iletken dizileme platformuna dayalı olarak mide kanseri örneklerinde tek nükleotid polimorfizmlerini tespit etmek için gerekli bütünsel laboratuvar prosedürlerini önermektedir. Hedef diziler, bağlama adaptörleri, kütüphane amplifikasyonu ve saflaştırması ve kalite kontrol kriterleri de ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mide Kanserinde İyon Yarı İletken Dizileme Platformuna Dayalı Çok Genli Tek Nükleotid Polimorfizmi Tespiti

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Keşfedin, çip tabanlı dijital PCR ile mide kanserinde nadir CDH1 transkript varyantlarını taze donmuş dokularda nasıl tespit edeceğinizi. Bu hassas yöntem, düşük yoğunluktaki hedefleri geleneksel PCR'a göre daha kesin bir şekilde saptar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Daha fazla video keşfet