Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması
5 Şubat 2018
El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.
Bu yöntemin genel amacı, çip bazlı dijital PCR ile taze donmuş dokulardaki nadir transkript varyantlarını tespit etmektir. Bu yöntem, karsinogenezde rol oynayabilecek nadir transkript varyantlarının tespiti gibi kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düşük miktarda bulunan hedeflerin tespit edilmesine izin vermesi, altın standart kantitatif PCR'ye göre hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği artırmasıdır.
Bu yöntem, taze donmuş insan dokularında düşük sayıda cDNA molekülünün tespiti hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer biyolojik numune türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü çipleri hazırlama ve analiz için parametreleri tanımlama konusunda biraz beceri kazanmak gerekir. Başlamak için, ana karışımın ve tahlilin oda sıcaklığında en az 20 dakika çözülmesine izin verin.
Ardından, cDNA örneklerinin altı mikrolitrelik alikotu ile 0.5 mililitrelik tüpler yükleyin. Ayrıca, şablonsuz bir kontrol tüpü yapın. Daha sonra, ana karışımı nazikçe girdaplayın ve reaksiyon başına 8.7 mikrolitreyi steril bir tüpe alikotlayın.
Daha sonra, her reaksiyon için 0.87 mikrolitre özel tahlil astarı ekleyin ve 1.83 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Kombinasyonu yavaşça karıştırın ve cDNA içeren her tüpe 11.4 mikrolitre aktarın ve şablon kontrolüne geçin. Ardından, tüpleri hafifçe karıştırın ve tüp içeriğini nabız santrifüjleme kullanarak bir araya getirin.
En iyi sonuçlar için talaşları mümkün olan en kısa sürede yükleyin. Talaş yükleyiciyi prize takın ve gösterge ışığı yeşile dönene kadar bekleyin. Ardından, pistonu bir ila iki milimetreye hafifçe çekerek daldırma sıvısı şırıngasını hazırlayın, ardından kapağı çıkarın ve ucu ekleyin.
Ardından, yeni bir çipin kapağında yazan kodu not edin. Ardından kapağı dikkatlice yandan tutun, koruyucu filmi soyun ve yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde kapak yuvasına yerleştirin. Şimdi, kelepçeyi açmak için kolu aşağı bastırın ve çipi dikkatlice talaş yuvasına yükleyin.
Ardından, yükleyiciye yeni bir yükleme bıçağı yerleştirin. Sıkıca yerine oturduğundan emin olmak için hafifçe itin. Şimdi, 14,5 mikrolitre reaksiyon karışımını yükleme bıçağına aktarın.
Hava kabarcığı yapmayın ve bıçağı saptırmayın. Ardından, sesi çipe dağıtmak için siyah yükleme düğmesine basın. Yükleme bıçağının yerinde olduğunu doğrulamak önemlidir.
Ardından, bıçağı doldururken, kabarcıkların girmesini önlemek için pipeti ikinci durağa kadar bastırmayın. Ayrıca, bıçağı uçla saptırmayın. Çip yüzeyine yaklaşık 20 damla daldırma sıvısı aktarmak için şırıngayı kullanarak devam edin.
Uç kısmı ile yüzeye temas etmemeye özen gösterin ve yüzeyi taşmadan tamamen kaplayın. Ardından, kapağın çip ile temas etmesini sağlamak için yükleyici kolunu çevirin ve 15 saniye boyunca aşağı bastırın. Ardından, talaşı serbest bırakmak için kapak düğmesine basın ve yükleyici kolunu dinlenme konumuna geri getirin.
Şimdi, kelepçeyi açın ve daldırma sıvısını bir şırınga aracılığıyla doldurma portundan dikkatlice dağıtmak için monte edilmiş çipi 45 derecelik bir açıyla tutun. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için çipi hafifçe döndürün ve ardından fazla sıvıyı steril bir mendille çıkarın. Çipin kenarına daldırma sıvısı dökmekten kaçının.
Böyle bir durumda, sızdırmazlıktan önce fazlalığı dikkatlice çıkarın. Son olarak, kapaktaki etiketi nazikçe soyarak ve ardından doldurma portunu en az beş saniye bloke ederek talaş kutusunu kapatın. Şimdi, çipi iki saat içinde kullanın ve o zamana kadar karanlıkta saklayın.
Reaksiyonu ayarlamak için kapağı açın ve tek bir blok kullanılsa bile adaptörleri her iki bloğa da takın. Ardından, numune bloklarının üzerine bir çip yerleştirin ve doldurma portlarını termal döngüleyicinin önüne doğru yönlendirin ve portu hafifçe yükseltin. İki bloğu dengelemek için boş fişler kullanın.
Ardından, talaşları tamamen kaplamak için termal pedi kurulumun üzerine yerleştirin. Ardından döngüleri programlayın, kapağı kapatın ve reaksiyonu başlatın. Reaksiyon bittiğinde, termal döngüleyiciyi kapatın, termal pedleri çıkarın ve ardından talaşları çıkarın.
Cipslerin karanlıkta en az 10 dakika oda sıcaklığında çözülmesine izin verin ve bir saat içinde analiz edin. Talaş yüzeyini sızıntı veya diğer sorunlar açısından incelerken izopropanol ile temizleyin. Verileri kaydetmek için, verilerin kaydedilebileceği dedektör sistemine bir USB bellek çubuğu yerleştirin.
Ardından, dedektör sisteminin çip tepsisini açın ve çipi yüzü yukarı bakacak şekilde yükleyin. Tepsiyi kapatın ve verilerin işlenmesi için 30 saniye bekleyin. Ardından çipi çıkarın ve bir sonraki çip için işlemi tekrarlayın.
Ardından, USB çubuğunu dedektörden bir bilgisayara taşıyın ve dosyaları aktarın. Bulut tabanlı yazılımı açın, ardından bir proje oluşturun ve ilgilenilen çipler için tüm veri dosyalarını içe aktarın. Ardından, Cipsleri Tanımla sekmesi altında, kullanılan boyayı ve tahlili seçin.
Çipin kabul edilebilir olup olmadığını, Verileri İncele sekmesinde görselleştirerek belirleyin. Numune iyi yüklendiyse, en az 13.000 nokta kullanılabilir olmalıdır. Ardından, seçilen çip için dağılım grafiğine bakın.
Burada, tahlil türü tarafından tanımlanan bir eşik uygulayın. Floresein amid raportör boya sinyali için 6.000 eşik kullanın. Şimdi, yanlış pozitiflerle sonuçlanabilecek şüpheli sinyalleri kaldırın.
Kement aracını kullanarak dağılım grafiğindeki şüpheli noktayı seçin ve Belirsiz seçeneğini belirleyin. Kalan tüm pozitif noktalar, analiz edilen nadir hedefin cDNA kopyalarının varlığını gösterir. Burada sunulan prosedürü kullanarak, mide taze dondurulmuş dokularda nadir transkript varyantı CDH1a'nın ekspresyonunu kontrol ettik.
Çipin birden fazla baloncuğu, tek bir büyük baloncuğu veya 13.000'den az veri noktası varsa, analizden çıkarıldı. Şablon yok kontrolünde FAM kanalı için seçilen 6.000 eşiğinin üzerinde hiçbir pozitif sinyal mevcut değildi. Sarı noktalar amplifikasyon olmadığını gösterir.
İnce bir çip analizi, düşük kaliteli veri noktalarını filtreledi ve belirsiz sonuç riskini ortadan kaldırdı. Amplifikasyonu gösteren mavi bir sinyal bulunduğunda, çipin tam sınırlarında veya baloncukların etrafındaysa, sinyal atlandı. Benzer şekilde, yanlış pozitif riskini daha da önlemek için, seçilen FAM eşiğinin üzerindeki ve grafiğin en sağındaki sinyallerin spesifik olması muhtemeldi ve ayrıca filtrelendi.
21 eşleştirilmiş normal ve kanser doku örneği ve 11 ek tümör örneği analiz edildi. Genel olarak, nadir transkript CDH1a, 32 tümörün 15'inde tespit edilebilirdi. Buna karşılık, 21 kontrol dokusu örneğinin hiçbiri bu nadir transkriptin varlığını göstermedi.
Bu videoyu izledikten sonra, çip bazlı dijital PCR ile taze donmuş dokuda nadir görülen bir transkript varyantının nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, numune sayısına bağlı olarak altı ila sekiz saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numuneyi bıçağa doğru bir şekilde yüklemeyi unutmamak önemlidir.
Geliştirilmesinden sonra bu teknik, moleküler tanı alanındaki araştırmacıların kanser hastalarında nadir görülen dizi varyantlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu el yazması, mide kanseri hastalarından elde edilen taze dondurulmuş dokulardan nadir CDH1 transkript varyantını (CDH1a) tespit etmek için tasarlanmış, yonga tabanlı bir dijital PCR testi sunar. Yöntem, düşük bolluklu hedeflerin tespitini artırır ve geleneksel nicel PCR'ye göre daha iyi hassasiyet sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kanser Araştırmaları
- Genetik Analiz
- Transkripsiyonel Varyantlar
Arka Plan
- Nadir transkript varyantlarının tespiti, karsinojenezin anlaşılmasında kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel nicel PCR, düşük bolluklu hedefleri etkili bir şekilde tespit etmeyebilir.
- Yonga tabanlı dijital PCR, tespit kabiliyetlerini artırmak için yeni bir yaklaşım sunar.
- Taze dondurulmuş dokular, analiz için uygun bir biyolojik bağlam sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Mide kanserinde nadir CDH1 transkript varyantlarını tespit etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Transkript tespitinin hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini artırmak.
- Kanser biyolojinde düşük bolluklu transkriptlerin rolü hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yonga tabanlı dijital PCR testi geliştirilmesi.
- Taze dondurulmuş doku örneklerinin hazırlanması.
- Analizler öncesinde master mix ve testin çözülmesi.
- Doğru tespit için parametre tanımlaması.
Ana Sonuçlar
- Tümör ve normal dokulardaki CDH1a varyantının başarılı bir şekilde tespiti.
- Geleneksel yöntemlere göre iyileştirilmiş hassasiyet gösterilmiştir.
- Çeşitli biyolojik örneklere potansiyel uygulanabilirlik.
- Kanser konusunda nadir transkriptlerin rolü hakkında elde edilen bilgiler.
Sonuçlar
- Yonga tabanlı dijital PCR testi, kanser araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Düşük bolluklu transkript varyantlarının tespit edilmesini artırır.
- Bu yöntem, karsinojenez alanında yeni keşiflere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Chip-based digital PCR enables precise detection and quantification of rare transcript variants such as CDH1a in fresh-frozen gastric cancer tissues, addressing a critical challenge in early discovery and target validation. This capability enhances predictive confidence in transcript-level biomarkers and supports risk-adjusted portfolio decisions by distinguishing tumor-specific molecular signatures from normal tissue background. The method's sensitivity and reproducibility position it as a strategic asset for translational research and biomarker-driven discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detection of low-abundance transcript variants implicated in carcinogenesis.
- Improves functional target validation by distinguishing tumor-specific expression from normal tissue.
- Supports mechanistic de-risking through robust quantification of rare molecular events.
- Facilitates portfolio triage by providing high-confidence molecular evidence.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleic acid quantification systems for downstream screening workflows.
- Delivers absolute quantification without reliance on calibrators or standard curves.
- Enhances assay reproducibility and minimizes false positives via stringent thresholding and quality control.
- Enables reliable evaluation of rare transcript presence across multiple sample types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns rare transcript detection with disease-relevant tissue analysis for translational biomarker studies.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting robust molecular readouts.
- Reduces biological risk in advancing candidate biomarkers to preclinical models.
- Supports mechanistic insights into tumor-specific transcript expression patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This chip-based digital PCR workflow integrates at the interface of early discovery, target validation, and translational biomarker research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of rare transcript variants in cancer tissues.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for assay development and validation.
- Analytics: Delivers absolute copy number measurements and robust statistical discrimination of positive signals.
- Translational Research: Bridges molecular discovery with disease-relevant tissue analysis for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for rare nucleic acid detection across diverse oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in transcript-level biomarker discovery.
- Operational Value: Standardizes rare transcript detection with high reproducibility and minimal false positives.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of molecular targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidate biomarkers and molecular targets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in chip preparation and digital PCR parameter optimization.
- Needs access to specialized instrumentation for chip-based digital PCR and data analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay setup and quality control thresholds.
- Adaptable to various biological sample types with appropriate validation.
- Potential limitations include sensitivity to chip loading errors and the need for high-quality tissue samples.
