Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Bu testin genel amacı, normal oksijen seviyelerinde olmasına rağmen doku hipoksisinden muzdarip drosophila larvalarını tanımlamaktır. Drosophila'da larvaların yavaş, zayıf büyümesine ve bazı larvaların halsizliğine neden olan birçok mutasyon vardır. Bu tahlil, bu larva sınıfı içinde, doku hipoksisinden muzdarip olanları tanımlar.

Sonuç olarak, bu tahlil, çeşitli fizyolojik süreçler yoluyla dokularda oksijen eksikliğine neden olan daha fazla mutasyonun tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tahlil fikri, hasarlı hava yolları veya trakea ile larvaların iki garip davranış gösterdiği gözleminden ortaya çıktı. Bu anormal davranışlar, erken larva yaşamı sırasında yiyeceğe girememe ve gezinme aşamasında daha yumuşak bir alt tabakaya tünel açmamadır.

Metin protokolünde açıklandığı gibi yumurtlama kaplarında kontrol ve deneysel genetik çaprazlamaları ayarlayın. Zamanlanmış yumurta toplamaya başlamadan önce sinekleri en az iki gün karanlıkta tutun. Zamanlanmış yumurta toplama için, yetişkinleri günün erken saatlerinde taze bir maya ezmesi ile süslenmiş yeni üzüm agar plakalarına aktarın ve yetişkinlerin dört saat boyunca tabaklara yumurta bırakmasına izin verin.

Dört saat sonra yetişkinleri taze üzüm agar plakalarına aktarın. Daha sonra, dört saatlik toplama plakalarını gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi öğleden sonra, larvaların çoğu yumurtadan çıkmış olacak.

Her deney grubu için en az 50 deney grubu olmasını planlayın. Tahlilin tek bir çalışması için, deney grubu başına en az beş tahlil plakası hazırlayın. Isıtarak 16 gram sinek agar ve 700 mililitre deiyonize su ekleyin.

% 95 etanolde 17.5 mililitre Nipagen hazırlayın. Agar çözeltisini neredeyse tamamen eriyene kadar ısıtın. Daha sonra agar çözeltisine Nipagen çözeltisi ekleyin ve agar tamamen eriyene kadar ısıtın.

Agar çözeltisini kısa bir süre soğutun, ardından 15 mililitre agar çözeltisi ile 10 santimetre plaka yükleyin. Agar jelleştikten sonra, plakaların kapaklarını kapatın ve birkaç saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Kürlenmiş agar dokunulduğunda sağlam olmalı ve parçalar kesildiğinde parçalanmaya karşı direnç göstermelidir.

Agar sertleştikten sonra, her plakadaki agar jelinde merkezi bir delik açmak için 1,5 santimetrelik bir mantar levha kullanın. Daha sonra delikleri taze maya ezmesi ile düzgünce doldurun. Larvaları tahlil plakasına aktarmak için basit bir alet yapın.

Plastik bir mikrospatulanın ucuna bir eğri bükün ve ucu larvalara yapışması için maya macununa batırın. Şimdi ilk instar larvalarını tek tek toplayın ve onları yiyecek höyüğüne yakın agar tabağına yerleştirin. Her deney grubu için, her biri 10 larva içeren en az beş tabak hazırlayın.

Test replikasyonları arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için, her bir test plakasına sadece 10 larva yerleştirilmesi çok önemlidir. Mikrospatula ucuyla her larva verdiğinizde bir ve yalnızca bir larva aktarıldığını belirlemek için tahlil plakasını dikkatlice kontrol ettiğinizden emin olun. Bir tabak yüklendikten sonra etiketleyin, üzerini örtün, ardından kapak tarafı yukarı bakacak şekilde oda sıcaklığında karanlıkta koyun.

Tüm larvalar ölene veya yavrulanana kadar her plakayı günlük olarak inceleyin. İşte tahlilin ikinci gününden sekizinci gününe kadar vahşi tip bir suş için plaka örnekleri. İkinci günde, larvalar yiyeceğe gömülür ve tünel açılmaz.

Tünel açma üçüncü günde başlar ve larvalar dolaşmayı bırakıp tünellerinde pupa olduklarından beşinci ve sekizinci günler arasında maksimuma ulaşır. Pupaları bükülmüş bir alay iğnesi ile dikkatlice bir üzüm tabağına aktarın ve istenirse kaç tane pupa içerdiğini sayın. Pupa oluşumunu not edin ve pupaları anormallikler açısından değerlendirin.

Tahlil plakası içindeki tünelleri görüntülemek için, önce tüm maya yiyeceklerini her bir plakanın merkezi kuyusundan dikkatlice çıkarın ve atın. Daha sonra her bir plakayı nazikçe musluk suyuyla doldurun ve agar yüzeyine izlenen kalıntıları dikkatlice ovalamak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Bazı agar parçaları, tünel açmanın en yoğun olduğu yerlerde parçalanabilir.

Bu daha sonra düzeltilebilir. Suyu birkaç kez değiştirmeye devam edin ve plaka tamamen temizlenene kadar kalıntıları nazikçe fırçalayın. Ardından plakayı deiyonize su ile son bir durulama yapın, üzerini örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Agar jelinin parçalarını koparmamak veya zarar vermemek için agar plakalarını temizlemek için yumuşak bir su akışı ve hafif bir fırça darbesi kullanmak önemlidir. Ertesi gün, tünelleri parlak beyaz çizgiler olarak göstermek için siyah bir arka plan kullanarak plakanın bir tiff dosya görüntüsünü hazırlayın. Jel dokümantasyon sistemleri bu adım için iyi çalışır.

Ardından, Oval aracıyla Görüntü J'yi kullanarak görüntüdeki tünellemeyi ölçün, agar jelini petri plakasının plastik kenarına kadar, ancak dahil olmamak üzere tanımlayın. Ardından, tünellerin siyah çizgiler olarak görünmesi için plakanın ters görüntüsünü elde etmek için otomatik bir eşik uygulayın. Tünel içermeyen koyu alanları düzeltmek için, bu bölgeleri beyazlatmak üzere Renk seçici ve Boya Fırçası araçlarını kullanın.

Ardından, Analiz açılır menüsünün altında Ölçeği ayarla'yı seçin ve ölçeği kaldırmak için tıklayın. Ardından Analiz Et altındaki Ölçümleri ayarla penceresine gidin ve Alan ve Eşik sınırı'nı işaretleyin. Şimdi, görüntüdeki siyah alanın tünellenmiş alanı temsil eden piksel biriminde bir ölçümünü almak için M tuşuyla Kontrol tuşuna basın.

Merkezi deliğin etrafındaki agar erozyonu nedeniyle kaybedilen tüneli ölçmek için Eşik sınırının işaretini kaldırın. Merkezi deliği tanımlamak için Değnek aracını kullanın ve değerini piksel cinsinden ölçmek için Control artı M'ye basın. Bu değerden 1,5 santimetre çapındaki bir deliğin piksel değerini çıkarın.

Toplam tünelleme pikseli değerini vermek için farkı daha önce elde edilen piksel değerine ekleyin. Eksik agarın merkezi tünel açma halkasının ötesine uzandığı plakalar için, kantitasyonun merkezi bölge dışındaki alanları içermesini önlemek için ek bir adım gereklidir. Ölçülen alanı sınırlamak için gösterildiği gibi siyah bir çubuk eklemek için Renk seçici ve Boya Fırçası araçlarını kullanın.

Tarif edilen test, trachae'de şişirilemeyen genin bozulmuş fonksiyonu olan larvalarda potansiyel hipoksiyi araştırmak için kullanıldı. Gen, Gal4 UAS aracılığıyla RNAi'yi baskıladı. İki Gal4 hattı kullanıldı.

Nefes Kesmeyen Gal4, tüm trakeal sistemdeki tüm gelişimi ifade eder. Veya larva yaşamı boyunca küçük bir trakeal bölümde güçlü bir şekilde ifade eden cut(ue)Gal4. Kontrol larvaları Gal4 hatlarından birini içeriyordu, ancak şişirilemez RNAi yoktu.

Şişirilmeyen RNAi kullanan cut(ue)Gal4'e sahip larvalar, hem büyüme hem de davranış açısından gelişim boyunca kontrollerden ayırt edilemezdi. Bununla birlikte, blt-Gal4 ile traka boyunca şişirilemeyen RNAi'nin güçlü bir şekilde bastırılması, besleme aşamasında yuva açılmamasına ve yüksek bir ölüm oranına neden oldu. Bu larvalar ayrıca gezinme aşamasında tam bir tünel yokluğu gösterdi.

Ayrıca, nefes kesen Gal4 deneysel larvaları, kontrollerden daha küçük, daha ince ve daha halsizdi ve diğer tüm gruplar pupa olduktan çok sonra larva olarak kaldı. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila larvalarının yiyecek höyüklerine ne ölçüde girdiklerini veya yumuşak bir alt tabakaya tünel açtıklarını izleyerek doku hipoksisi için nasıl test edileceğini iyi anlamalısınız. Tünellemenin tamamen olmaması, doku hipoksisinin güçlü bir göstergesidir.