Ekosistem imalat (EcoFAB) protokolleri laboratuvar ekosistemlerinin bitki-mikrop etkileşimleri çalışma için tasarlanmış inşası için
10 Nisan 2018
Bu makalede ekosistem bitkiler ve son derece kontrollü laboratuvar koşullarında bitki-mikrop etkileşimleri sağlayan aygıtlar (EcoFABs) imalatı için detaylı iletişim kurallarını açıklar.
Bu protokolün genel amacı, sahada daha fazla test edilebilecek bitki mikrop etkileşimlerini araştırmak için kontrollü, tekrarlanan laboratuvar deneylerini mümkün kılan, EcoFAB'lar olarak adlandırılan basitleştirilmiş model bitki ekosistemlerinin inşası için standartlaştırılmış yaklaşımları tanımlamaktır. Bu yöntem, kontrollü ortamlardaki bitki mikrop etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir, bu da mikro biyomların işlevleri hakkında ayrıntılı mekanik bilgiler edinmemizi ve onları sürdürülebilir tarım için kullanmamızı sağlar. Çeşitli mevcut 3D baskı teknolojilerini kullanan bu ilk Eco-FAB'ın tasarlanmasına ve hem dikkat dağıtıcı olmayan yüksek çözünürlüklü görüntülere hem de kimyasal analizlere olanak tanıyan bitki büyüme odalarını sterilize etmeye yardımcı olduk.
Burada geliştirilen Eco-FAB cihazı, kök morfolojisi ve kütle spektroskopik görüntülemenin analizini içerdiğinden, bitki mikrop etkileşimlerinin analizi için çok uygundur. Eco-FAB kalıplarının yapımını takiben, metin protokolüne göre 3D baskı kullanılarak, tek kullanımlık bir litrelik bir kapta, deneye bağlı olarak 40 mililitre siloksan elastomer bazını farklı hacimlerde kürleme maddesi ile karıştırın. Elastomer karışımındaki hava kabarcıklarını gidermek için kabı en az 30 dakika bir vakum odasına yerleştirin.
Daha sonra karışımı çıkarın ve monte edilmiş 3D baskılı plastik kalıba dökün. Tek tip bir PDMS tabakası oluşturmak için hava kabarcıklarının dikkatli bir şekilde çıkarılması gerekir. Karışımı kalıba aktardıktan sonra hava kalıntılarını üflemek için basınçlı hava kullanın.
Kalıbı dört saat boyunca 85 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda tutun. Kalıbın beş dakika soğumasına izin verin. Ardından, eki kalıptan yavaşça dışarı çekin ve PDMS'yi döküm çerçevesinden yavaşça ayırmak için bir maket bıçağı kullanın.
PDMS ile kalıp tabanını döküm çerçevesinden dışarı doğru bastırın. Ardından, PDMS katmanını kenarlardaki kalıp tabanından nazikçe ayırmak için bir bıçak veya başka aletler kullanın ve kalıp yüzeyinden yavaşça soyun. 15 gauge, künt bir iğne kullanarak, o kısımda 1.6 milimetre delikler açarak PDMS katmanları üzerinde bir giriş kanalı oluşturun.
Ardından, PDMS katmanlarının kenarlarını kırpmak için makas kullanın. PDMS katmanlarını mikroskop slaytlarına kalıcı olarak yapıştırmak için, PDMS tabakasının yapıştırma tarafını 7,6 x beş santimetrelik bir mikroskop lamında durulamak için metanol kullanın ve ardından basınçlı hava veya ultra saf nitrojen tabancası ile kurutun. Mikroskop lamını ve PDMS katmanını, yapıştırma tarafları yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin.
Hazneyi ve gaz tahliye vanasını kapatın. Ardından, vakumu açın ve hazneyi bir dakika boyunca aşağı doğru pompalayın. Plazma jeneratörü gücünü açın ve radyo frekansını veya RF seviyesini bir dakika boyunca yükseğe getirin.
Ardından, hem vakum pompasını hem de plazma gücünü kapatın ve odayı atmosfere boşaltın. Mikroskop lamını ve PDMS katmanını plazma odasından çıkarın ve PDMS katmanının dört kenarını da eşit basınçla slaytın üzerine hızlıca bastırın. Kök odası olan merkez oval bölgenin kaydırağa temas etmediğinden emin olun.
Ultra saf su kullanarak Eco-FAB cihazlarını durulayın. Bir Eco-FAB cihazını bir Eco-FAB kabına yerleştirin ve cihaz suya batırılana kadar %70 etanol ekleyin. Ardından, kabın kapağını kapatın ve içindeki tüm yüzeyleri etanol ile ıslatmak için hafifçe sallayın, Eco-FAB cihazının kök büyüme odasının çok az hava kabarcığı ile veya hiç hava kabarcığı olmadan etanol ile doldurulduğundan emin olun.
Cihazları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra,% 70 etanolü dökün ve% 100 etanol ile değiştirin. Ardından, cihazları beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından etanolü boşaltın ve sterilize edilmiş Eco-FAB'ı tamamen kuruması için 16 saat Laminer Akış Başlığında bırakın.
Varsa, davlumbazdaki UV ışığını bir saat boyunca açarak sistemi sterilize edin. Tohum sterilizasyonu ve çimlenmesini gerçekleştirmek için tohumları iki dakika% 70 etanol içinde bekletin. Daha sonra bir pipet ile etanolü çıkarın ve tohumları üç kez durulamak için steril su kullanın.
Daha sonra, tohumları% 10 ağartma çözeltisinde beş dakika bekletin. Ardından, ağartıcı solüsyonunu çıkarın ve tohumları üç kez iyice yıkamak için steril su kullanın. Yıkamaların ardından tohumlara steril su ekleyin ve tüpü yedi gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Tohumları 0.5 Murashige ve Skoog veya MS medium'a% 0.6vitagel ile eşit şekilde yayın. Ve mikro gözenekli bantla plakaları kapatın. Ardından, bitkileri yaklaşık beş mililitre kök uzunluğuna kadar büyütün.
Fideleri steril bir şırınga veya mikropipet ve steril su kullanarak Eco-FAB'lara aktarmak için, bir Eco-FAB cihazının kök odasını üç kez yıkayın ve ardından kök odasını 0,5 MS ortamı gibi ilgilenilen büyüme ortamıyla doldurun. Şimdi, Eco-FAB cihazının bitki rezervuarına dikkatlice tek bir fide yerleştirin. Köklerin kırılmaması için fidelerin plakadan Eco-FAB'a dikkatli bir şekilde aktarılması önemlidir.
Eco-FAB cihazından kaçınarak kabın içine üç mililitre steril su ekleyin. Bu, nemi artıracak ve ortamın kök odasından buharlaşmasını azaltacaktır. Ardından kabı kapatın ve kapağı kapatmak için mikro gözenekli bant kullanın.
Eco-FAB'ı bir bitki kuluçka makinesine yerleştirin veya Eco-FAB aydınlatma sistemini ilgili bitkinin büyümesine uygun kontrollü bir sıcaklık ortamında kullanın. Ardından, odayı 24 santigrat dereceye ayarlayın. Son olarak, metin protokolüne göre metabolit profili oluşturma ve kütle spektrometresi gerçekleştirin.
Bu rakamlar, Eco-FAB'larda büyüyen yedi günlük Aaabidopsis thaliana, brachypodium distacyon ve panicum virgatum'u göstermektedir. Hem dikot hem de monokotun Eco-FAB'da üreme aşamalarına kadar yaşadığı bulundu. Bu fideler, hidroponik ortamda büyüyen 14 günlük bir brachypodium distachyon grubunu ve ayrıca sırasıyla hidroponik ortam ve su ile desteklenmiş kum ve toprağı temsil eder.
İnce, katı substrat tabakası ve kök büyüme odaları, kök sistemlerinin mikroskobik görüntülenmesi için ışığın içeri girmesine izin verir. Burada, bir brachypodium distachyon fidesi Eco-FAB cihazına aktarıldı ve kök yapısı bir biorad jel görüntüleyici içindeki bir kamera tarafından kaydedildi. Üç hafta boyunca toplam kök alanının ölçülmesi, erken aşamada kademeli bir artış gösterdi ve bunu sonuna kadar doğrusal bir büyüme eğilimi izledi.
Bu şekilde, bitki büyümesini teşvik eden rizobakteriler, pseudomonas simiae, WCS417 içeren bir Eco-FAB, bitki kök sistemlerine bitki başına 10 ila altıncı hücre şeklinde eklenmiştir. WCS147 mikropları, kök ucu bölgelerinin etrafında yoğunlaşan mikroplarla tüm kök sistemlerinin yüzeyini kolonize etti. Tazeleyici ortam yetiştirirken ve Eco-FAB'lardan kök eksüdaları toplarken, herhangi bir kontaminasyonu önlemek için tüm işleri steril bir başlıkta işlemeyi unutmamak önemlidir.
Eco-FAB cihazları, 3D baskılı bir kelepçe kullanılarak veya PDMS'nin viskozitesi değiştirilerek tersine çevrilebilir, fiziksel bir sızdırmazlık kullanılarak da üretilebilir. Bu, katı büyüme ortamının ve doğrudan kütle spektroskopik görüntülemenin kullanılmasını sağlar. Eco-FAB geliştirilmesinden sonra, bu sistem dünyanın dört bir yanındaki araştırmacıların, sistem biyolojisi ve görüntüleme teknolojilerini kullanarak bitki mikrop etkileşimlerini incelemek için bu laboratuvar modeli ekosistemlerini kullanmalarına izin verecektir.
Bu videoyu izledikten sonra, bir Eco-FAB sisteminin nasıl üretileceğini ve ekosistem çalışmalarındaki geniş uygulamalarını iyi bir şekilde anlamış olmalısınız. Bu Eco-FAB tasarımının diğer bilim insanlarının kendi bilimsel hedeflerine ulaşmalarına izin vereceğini umuyoruz. Daha da önemlisi, diğer bilim insanlarının bu Eco-FAB tasarımı üzerine inşa edeceklerini ve daha iyi hale getireceklerini ve diğer bilim insanlarıyla paylaşacaklarını umuyoruz, böylece bir topluluk olarak, bitki mikrop etkileşimlerini daha iyi anlamamıza izin vermek için bu laboratuvar ekosistemlerini inşa edebiliriz.
Mikroplar ve kesici aletlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu makale, kontrollü laboratuvar ortamlarında bitki ve bitki-mikrop etkileşimlerinin çalışmalarını kolaylaştıran EcoFAB'lerin yapımı için ayrıntılı protokolleri açıklamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki-Mikrop Etkileşimleri
- Kontrollü Ekosistem Üretimi
- Laboratuvar Protokolü Geliştirme
Arka Plan
- EcoFAB'ler, laboratuvar deneyleri için tasarlanmış basitleştirilmiş model ekosistemlerdir.
- Bitki-mikrop etkileşimlerinin kontrollü ve çoğaltılabilir çalışmalarını sağlarlar.
- Yöntem, mikrobiyom fonksiyonlarına dair mekanizmasal anlayış sağlamayı amaçlar.
- 3D baskı teknolojilerinin kullanımı bu cihazların tasarımını geliştirir.
Çalışmanın Amacı
- EcoFAB'lerin yapımı için standartlaştırılmış yaklaşımları tanımlamak.
- Kontrollü bir ortamda bitki-mikrop etkileşimlerini araştırmak.
- Alan koşullarında bulgulara ilişkin daha fazla testin yapılabilmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- 3D baskı kullanarak EcoFAB kalıplarının yapımı.
- Bitki büyüme odalarının hazırlanması ve sterilizasyonu.
- Tohum sterilizasyonu ve çimlendirme protokolleri.
- Analizler için metabolit profilleme ve kütle spektrometrisi.
Ana Sonuçlar
- EcoFAB'lerde çeşitli bitki türlerinin başarılı büyümesi.
- Kök morfolojisi ve etkileşimlerinin detaylı analizi.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için EcoFAB'lerin kullanımının gösterimi.
- Sürdürülebilir tarımda mikrobiyomların rolü hakkında görüşler.
Sonuçlar
- EcoFAB'ler, bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için güçlü bir platform sağlar.
- Kurulan protokoller çeşitli bitki türlerine uygulanabilir.
- Bulgular, sürdürülebilir tarım uygulamalarındaki ilerlemelere katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
EcoFABs provide a standardized, reproducible platform for mechanistic studies of plant-microbe interactions under controlled laboratory conditions. This enables de-risking of target validation in agricultural biotechnology by clarifying functional roles of microbiomes in plant health and stress response. The system supports predictive confidence in lead identification for microbiome-based bioinputs through dynamic monitoring of root exudates, microbial localization, and plant growth phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by manipulating microbiome composition, including mutant strains, to assess causal effects on plant phenotypes.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled addition of plant growth promoting rhizobacteria such as Pseudomonas simiae WCS417 and quantification of colonization patterns.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking microbial interventions to measurable outputs like root morphology, exudate composition, and growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling sterile, reproducible mounting of seedlings and controlled media exchange in flow-through devices.
- Quantitative Outputs: Generates standardized metrics including total root area over time, microbial localization via mass spectrometry imaging, and exudate profiling for compound screening.
- Platform Reuse: Designed for scalability across plant species (Arabidopsis, Brachypodium, Panicum) and growth media (hydroponic, sand, soil), supporting cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plant-soil-microbe interactions relevant to sustainable agriculture and bioenergy feedstock production.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by allowing progression from sterile lab conditions to defined soil/sand systems with supplemental media.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on reproducible phenotypes under controlled stress or nutrient conditions prior to field testing.
Pipeline & Workflow Integration
EcoFABs integrate into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supporting iterative design-test cycles for microbiome-based agricultural solutions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling manipulation of microbiome composition and environmental variables while monitoring plant responses.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through sterile fabrication, controlled hydration, and sealed incubation systems that minimize evaporation and contamination.
- Analytics: Provides quantitative measurements including root morphology imaging, metabolite profiling, and mass spectrometry data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting validation in increasingly complex media (sand, soil) while maintaining controlled variables.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable platform rather than a single-use tool, with modular design allowing adaptation across labs and plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in plant-microbe interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through detailed sterilization protocols, 3D-printed molds, and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbiome-based leads before field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, reproducible phenotypes linked to microbial interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, 3D printing, and PDMS handling for device fabrication.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum chambers, and imaging systems for bonding and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for seed transfer, media exchange, and contamination control.
- Requires adaptation considerations when switching between liquid, sand, or soil-based growth media while maintaining sterility.
- Limited by the need for aseptic workflows during exudate sampling and media refresh to prevent biofilm formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
