Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını ³²P-postlabeling tarafından Adducts

Bu protokolün genel amacı, kimyasalların veya ilaçların kovalent DNA eklentileri oluşturan metabolitlere aktivasyonları için potansiyellerini araştırmak için sitokrom p450 ve ek biyotransformasyon enzimleri tarafından katalize edilen reaksiyonları kullanan yöntemlerin tanımlanmasıdır. Bu yöntem, kanserin gelişimi ve tedavisi alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kanser gelişiminin başlangıcını temsil eden kovalent DNA eklentileri oluşturmak için çevresel kimyasalların veya ilaçların potansiyelini değerlendirmek için bir tür yöntem göstermesidir.

Kimyasalların kanserojen etkisini belirleyen tekniğin etkileri. Çevresel potansiyel, toksik maddeler ve ilaçlar ve ayrıca bu tür bileşikler tarafından oluşturulan kovalent DNA eklentilerinin oluşumu için nispeten basit yöntemler belirler. Bu yöntem, kanserin gelişiminin başlangıcı ve tedavisi hakkında fikir verebilse de, diğer bilimsel alanlara da uygulanabilir.

Moleküler mekanizmalar, DNA hasarı çalışmaları ve enzimatik aktivasyon ve kimyasalların toksifikasyonu üzerine sözlü çalışmalar gibi. Bu yöntem fikrini ilk olarak kimyasal karsinogenezin başlangıç aşamasında yer alan süreçleri araştırdığımda duydum. İlk olarak, tüm bileşikleri ve enzim sistemlerini dört santigrat derecede 0.75 mililitrelik bir nihai hacme ekleyerek inkübasyon karışımını hazırlayın.

Bu, kanserojeni sitokrom p450 varlığında DNA ile inkübe etmektir. Daha sonra, karışıma süperzom içinde mikrozomlar veya saf rekombinant p450 ekleyin. Daha sonra, son hacmi 0.75 mililitreye ayarlamak için DMSO ve 42.5 mikrolitre su içinde çözülmüş 7.5 mikrolitre 0.1 milimolar eliptiksin ilacı ekleyin.

Ardından, tüpü beş saniye boyunca girdaplayarak bileşenleri karıştırın. Hemen ardından, tüpü kapak açık olarak 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, fenol veya fenol kloroformu bir Eppendorf Tüpündeki inkübasyon karışımı ile bire bir oranında karıştırın.

Bu, inkübasyon karışımındaki DNA'dan protein kontaminasyonunu ortadan kaldıracaktır. Daha sonra bir emülsiyon oluşturmak için karışımı karıştırın. Daha sonra karışımı ortam sıcaklığında üç dakika boyunca 1600 kez g'de döndürün.

Santrifüjleme bittiğinde, üst su fazını yeni bir polipropilen tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra protein arayüzünü organik faz ile birlikte atın. Daha sonra, su fazını eşdeğer hacimde fenol ve kloroform ile bire bir oranında karıştırın.

Ardından santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Daha sonra toplanan su fazına eşit hacimlerde kloroform ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Daha sonra, eksi 20 santigrat derecede tutulan iki hacim soğuk etanol ekleyerek DNA'yı sulu fazdan çökeltin.

Sonra çözeltiyi iyice karıştırın. DNA eklentilerini etiketlemeye hazırlanmak için, DNA eklentilerini etiketlemek için bicine tampon çözeltisini radyoaktif işaretli ATP çözeltisi ile karıştırın. Etiketleme karışımını NP1 çözeltisine veya bütanol zenginleştirme karışımına ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Daha sonra PEI-selüloz TLC plakası üzerindeki tüm numuneye yaklaşık 20 mikrolitre uygulayın. Numuneyi PEI-selüloz TLC plakası üzerinde tespit ettikten sonra, eklentileri temizlemek için plakayı D1 yönünde gelişmeye bırakın.

Plaka kuruduktan sonra, plakayı D3 ve D4 yönlerinde gelişmeye bırakın. D3'te geliştirmek için, üre ile pH 3.5'te lityum format tamponu kullanın. D4 gelişimi için, lityum klorür ve üre içeren Tris-HCl tamponu kullanın.

D4 yönünde gelişmede herhangi bir sorun yaşamamak için plakaları da D5 yönünde geliştirin. İlk olarak, mikrozomal p450 aracılı biyoaktif eliptisinin DNA eklentileri oluşturmadaki etkinliğini incelemek için P32-son etiketleme tekniği kullanılır. Sonuçlar, hem sıçan hem de insan hepatik mikrozomlarının varlığında buzağı timus DNA'sının deoksiguanozininde kovalent DNA eklentilerinin oluşumunu göstermektedir; Bununla birlikte, kontrol grubunda herhangi bir eklenti oluşmaz.

Daha sonra, peroksidaz enzimine bağımlı aktive edilmiş eliptisinin potansiyeli incelenmiştir. Görüntü, yaban turpu peroksidaz, sığır laktoperoksidaz ve insan miyeloperoksidaz varlığında buzağı timus DNA'sında kovalent DNA eklentilerinin oluşumunu göstermektedir. Aslında, sıçanlar in vivo olarak kilogram vücut ağırlığı başına 40 miligram eliptiksin ile tedavi edildiğinde karaciğer DNA'sından da DNA eklentileri oluşur.

İlginç bir şekilde, insan sitokrom p450 enzimi CYP3A4 ayrıca eliptisini 12-hidroksielipsin ve 13-hidroksieliptisin gibi metabolitlere verimli bir şekilde oksitlemek için güçlü bir potansiyel gösterir. Bu metabolitler, eklentileri oluşturmak için DNA'ya kolayca bağlanabilir. Daha sonra, sıçan ve insandan NQ01 gibi sitozolik redüktaz ile 3-nitrobenzanthronen aktivasyonu üzerine DNA eklentilerinin oluşumunu incelemek için nükleaz P1 ve n-bütanol zenginleştirme yöntemleri kullanılır.

Sonuçlar, sıçandan, insan hepatik sitozolünden ve ayrıca fare karaciğerinden elde edilen buzağı timus DNA'sından beşe kadar DNA eklentisinin oluşumunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü deneyerek, kullanılan enzimatik sistemlerin kararlılığını hatırlamak önemlidir.

Enzim aktivitesi buz üzerinde depolanmazsa azalabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyokimya alanındaki, kimyasal karsinogenezin biyokimyası olan araştırmacıların, organizmalarda kanser gelişiminin başlangıç süreçlerinden fenomenin doğasını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, genetik kovalent DNA eklentilerini metabolize etmek için enzimatik olarak aktive edilecek çevresel kimyasalların veya ilaçların gücünü nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu süreç, kansere dayalı tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Son derece tehlikeli olabilecek kimyasallarla çalıştığınızı unutmayın. Potansiyel kanserojenler, radyoaktif kimyasallar, örneğin fosfor ATP.

Bu nedenle bu işlem yapılırken laboratuvar lateks eldivenleri ve pleksiglas levhalar gibi önlemler her zaman alınmalıdır.