Name: Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Keşfedin, çevresel kimyasalların ve ilaçların kovalent DNA adduktları oluşturma potansiyelini sitokrom P450 enzimleri kullanarak değerlendirme yöntemini. Bu teknik, kanser gelişiminin başlangıcını incelemek için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada çek Bilim Vakfı (GACR, grant 17-12816S) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri için bakım ve kullanım, laboratuvar Helsinki Bildirgesi ile uyumlu olan hayvanlar (311/1997, Tarım Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti), düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. yalıtım hepatik mikrozomal ve sitozolik kesirler
<ol><li>Karaciğer hücre altı fraksiyonları (P450 enzimleri veya cytosols redüktaz veya çözünür peroxidases zengin zengin microsomes) sıçanlarından emir basit fark Santrifüjü (105.000 x g) hazırlayın. Not: Pelet ve süpernatant microsomes ve cytosols, anılan sıraya göre alınır.<ol>
<li>Karaciğer örnekleri (1-10 g) iki kez ile 50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.4 150 mM KCl arabellek (tampon 1) içeren yıkama (ağırlık dokusunun, Yani 10 kat daha yüksek birimleri 10-100 mL) ve küçük parçalara dokular (, 2 x 2 mm boyut çevresinde).</li>
		<li>Bu arabellek huzurunda doku homojenize (> 3 birim/ağırlık mL/g) homogenizer 5 dk ve atma için 4 ° C'de içinde filtrasyon kullanarak doku sigara homojenize arta kalan parçaları kağıt filtre. Homogenate vasıl 600 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant başka bir Santrifüjü tüp için transfer.</li>
		<li>Pelet tampon 1 (1 g doku başına 1 mL) yeniden homojenize, tekrar adım 1.1.3. ve Pelet atın. 15.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de havuza alınan supernatants santrifüj kapasitesi Süpernatant başka bir Santrifüjü tüp aktarın.</li>
		<li>Süpernatant 105.000 x g 4 ° C'de 60 dk için de santrifüj kapasitesi Süpernatant (sitozol) toplamak ve aliquots (1-10 mL)-80 ° C'de depolayın Sitozol Bradford26tarafından açıklanan yöntemi kullanarak protein miktarı için karakterize.</li>
		<li>Pelet 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.4 yeniden askıya alma (> 2 birim/ağırlık mL/g), 4 ° C'de 60 dk için 105.000 x g , santrifüj Süpernatant atmak. Pelet (microsomes) 50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.4 150 mM KCl ve % 20 gliserol içeren yeniden homojenize (< 5 birim/ağırlık mL/g) homogenizer 4 ° C'de içinde Microsomes 0.5 - 1 mL aliquots-80 ° C'de depolayın Microsomes proteinlerin Bradford26tarafından açıklanan yöntemi kullanarak içerik için karakterize.</li>
		<li>Sitokrom P450 microsomes konsantrasyonu belirlemek. Not: Karbon monoksit (CO) ile azaltılmış P450 kompleksinin emilimini belirleme Omura ve Sato27tarafından açıklandığı gibi P450 enzimleri microsomes içinde konsantrasyonu ölçülür. Karbon monoksit toksik bir bileşik ve özenle ve bir başlık içinde ele alınması gerekiyor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. incubations DNA huzurunda enzimatik sistemleri ile Test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar)
<ol><li>Kuluçka cytochromes P450 içeren oksidatif enzimatik sistemleri varlığında test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar) DNA
	<ol>
<li>Kuluçka karışımlar içeren, son hacmi 4 ° C'de 0.75 mL, aşağıdaki bileşikler ve enzimatik sistemleri hazırlayın.<ol>
<li>Mix 100 mM fosfat tampon, pH 7.4, (0.375 mL) 10 mM NADPH veya NADPH üretme sistemi (10 mM MgCl2, 10 mM D-glukoz 6-fosfat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glikoz 6 fosfat dehidrogenaz) ile (75 µL).</li>
			<li>Bu karışımı microsomes ekleme veya böcek hücreleri izole microsomes olan Supersomes, saf rekombinant P450 cDNA rekombinant P450 enzimleri, 50 pmol P450 enzimleri 50 µL mikrozomal veya supersomal içeren bir baculovirus yapısı ile transfected hazırlıklar - hepatik mikrozomal kesirler Laboratuvarı veya ticari bir kaynaktan gelen izole.</li>
			<li>1 mg buzağı timus DNA (0.3 mL stok çözeltisi - 3.3 mg/mL distile su içinde) ekleyin ve 5 için bir girdap shaker sallamayın s.</li>
			<li>Son olarak, 7.5 ekleyin µL 0,1 mM test ellipticine uyuşturucu çözünmüş DMSO ve 42,5 µL distile su 0.75 mL karışımı kuluçka hacmi ulaşmak için. Kullanım kimyasallar 3ile H etiketli veya 14C ya da etiketsiz kimyasallar, DNA tespiti için prosedür bağlı olarak adducts.</li>
			<li>Bir girdap üzerinde açılmış tüpler için 30-60 dk 37 ° C'de 5 s. Incubate için sallayıcı.</li>
			<li>Ayrıca iki denetim incubations benzer şekilde, (i) ama aktive sistemi (mikrozomal örnekleri) bulunmayan veya (ii) ile bu ama bileşik testi yapmadan hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>İncubations huzurunda indirgeyici enzimatik sistemleri test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar) DNA
	<ol>
<li>Kuluçka karışımlar içeren, son hacmi 4 ° C'de 0.75 mL, aşağıdaki bileşikler ve enzimatik sistemleri hazırlayın.<ol>
<li>4 ° C'de 100 mM Tris-HCl mix tampon, %0,2 içeren pH 7.4, ara 20, (0.375 mL), kofaktör NQO1 indirgeyici enzim (NADPH) 10 mM çözümü (75 µL), sitozolik kesir (laboratuar veya sitozolik kullanarak söz konusu olduğunda izole hepatik sitozolik kesirler - kesirler) 1 mg protein (50 µL) içeren ticari kaynağından elde bireysel insan bağışçılardan izole.</li>
			<li>1 mg buzağı timus DNA (0.2 mL stok çözeltisi - 3.3 mg/mL distile su) ekleyin ve 5 için bir shaker sallamayın s.</li>
			<li>Son olarak, 7.5 (distile su, metanol, etanol veya DMSO, bahçedeki çözünürlük bağlı olarak çözünmüş) µL 0,1 mM test kimyasal ve kuluçka karışımı için 0.75 mL hacmi ulaşmak için 42,5 µL distile su ekleyin. Kullanım kimyasallar 3ile H etiketli veya 14C ya da etiketsiz kimyasallar, DNA tespiti için prosedür bağlı olarak adducts (aşağıya bakın).</li>
			<li>1 dk. kapalı tüpler için 30-60 dk 37 ° C'de 5 s. Incubate için bir shaker üzerinde Shake argonla tepki karışımı temizle.</li>
			<li>Ayrıca iki denetim incubations benzer şekilde, (i) ama aktive sistemi (sitozolik kesirler) bulunmayan veya (ii) ile bu ama test kimyasallar olmadan hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kuluçka karışımları ile test Kimyasalları fazlalığı kaldırmak için organik çözücüler çıkarımı
	<ol>
<li>Tüp Bebek kuluçka karışımı bir kap ile aynı miktarda Etil asetat (veya Dietil eter veya hekzan) bu maddeleri ekleyerek karıştırın. Tüp içeriğini bir emülsiyon formları kadar üzerinde bir sallayıcı.</li>
		<li>(3 dk), ortam sıcaklığında bir santrifüj 1.600 x g de spin. Organik ve sulu aşamaları düzgün ayrılmış değilseniz, bir kez daha fazla bir uzun dönem veya daha yüksek bir Santrifüjü hız spin.</li>
		<li>Bir pipet ile toplama üst, organik faz kaldırın. Eğer küçük birimler (< 400 µL) olan kullanıldığında, uygun bir ucu ile donatılmış bir otomatik pipet kullanmaktadır. Bu organik faz kenara atıldı.</li>
		<li>Adımları 2.3.1 yineleyin., 2.3.2. ve 2.3.3. Azot gazı akışı tarafından kalan organik çözücüler kaldırmak (en az 5-10 dk kaldırma ihtiyaç vardır).</li>
	</ol></li>
	<li>DNA izolasyonu incubations
	<ol>
<li>
Fenol/kloroform ile çözümleri ve onun yağış etanol ile DNA'ın çıkarılması
		<ol>
<li>Proteinler DNA kuluçka karışımları ile fenol, fenol/kloroform (1:1), DNA'ın çözümlerinden proteinler ayıklayarak yalıtmak ve aşağıda gösterilen yordam tarafından kloroform için ortadan kaldırmak.</li>
			<li>Kuluçka karışımı fenol veya fenol/kloroform (1: bir Şahin 1) veya Eppendorf tüp bir kap ile aynı miktarda ile birleştirir. Karışımı bir emülsiyon formları kadar ilave edin.</li>
			<li>(3 dk), ortam sıcaklığında bir santrifüj 1.600 x g de spin. Organik ve sulu aşamaları düzgün ayrılmış değil, bir kez daha daha uzun bir süre ya da daha yüksek bir Santrifüjü hız spin.</li>
			<li>Bir pipet ile üst su faz için yeni bir polipropilen boru aktarın. Eğer küçük birimler (< 400 µL) olan kullanıldığında, uygun bir ucu ile donatılmış bir otomatik damlalıklı kullanmaktadır. Protein arabirimi ile birlikte organik faz kaldırın.</li>
			<li>Üst su faz fenol ve kloroform (1:1) karışımı aynı miktarı ile birleştirin. Adımlar 2.4.1.2 yeniden. -2.4.1.4.</li>
			<li>Üst su faz kloroform ve 2.4.1.2 arasındaki adımları yineleyin aynı miktarı ile birleştirin. -2.4.1.4. 2 cilt soğuk (-20 ° C) etanol ile yağış tarafından DNA'yı kurtarmak. DNA çözüm hacmi belirlemek.</li>
			<li>5 M Sodyum Klorür final ilavesi ile monovalent katyon konsantrasyonu uyum 0.1 M. konsantrasyonları Stir şiddetle. Soğuk (-20 ° C) etanol 2 cilt ile birleştirmek ve düzgün karıştırın. -20° c ila serin
</li>
			<li>DNA çöktürülmüş kadar-20 ° C'de depolayın. Ne zaman DNA incubations sırasında parçalanmış (örneğin., oksijen radikallerin oluşumunu enzimatik harekete geçirmek reaksiyon sırasında tarafından) veya küçük DNA boyutunu yalıtım yordamına sırasında (< 1 kb) veya DNA ne zaman küçük miktarlarda mevcut (< 0.1 mg / mL), soğutma zaman var olmak artmak zorunda ve sıcaklığı-70 ° C'ye düşmüştür</li>
			<li>1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Bir kez daha fazla DNA düşük konsantrasyonlarda ya da küçük parçalar şeklinde varsa, daha uzun süre (30 dk) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>Hangi zarlarını DNA'mevcut olabilecek herhangi bir solutes (veya kimyasal test kalıntı izleri) kaldırmak için DNA'sı % 70 etanol ve Dietil eter ile yıkayın. Yıkama çöktürülmüş DNA soğuk (-20 ° C) ile % 70 etanol. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>2.4.1.10 adımı yineleyin. Yıkama çöktürülmüş DNA soğuk (-20 ° C) ile % 70 etanol. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>2.4.1.10 adımı yineleyin. Tüp emici kağıt üzerine kalan süpernatant kaldırmak için bir dikey durumuna geçirin. DNA Pelet 1 mL Dietil eter izole DNA kimyasal testi potansiyel artıkları atmak için ekleyerek yıkayın. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>DNA Pelet uygun birimindeki dağıtılması (0,5 - bir DNA konsantrasyon elde etmek için genellikle 100-400 µL içinde 1 µg/µL) distile su (veya 0.15 mM sodyum sitrat ve 1.5 mM Sodyum Klorür). DNA çözüm 4 ° C'de gecede durabilir veya 37 ° c DNA eriterek artırmak 10-30 dakika ısıtılır.</li>
			<li>Önce Muhafazası, buz gibi ve bir düşüş sonucu konsantrasyonları adduct DNA çözümleri çözme tekrarlanan çünkü küçük aliquots (10-20 µL), DNA ayırın. -80 ° C'de veya soğuk depolar. Not: DNA spektrofotometrik tayini: örnek saf ise bir hazırlık DNA miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan basit ve doğru yöntemi (Yani, kirletici protein, fenol veya başka önemli miktarda olmadan nükleik asitler), UV DNA radyoterapi miktarın spektrofotometrik ölçüm (bkz: daha önce açıklanan yordamları) bazlar tarafından emilir28.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>DNA tespiti için yordamlar oluşumu adduct
	<ol><li>32 P postlabeling tahlil Not: DNA hidroliz analizi (2.5.1.) adducts için yanı sıra normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides (2.5.7.) bu aşamada hazırlanan hidrolizat kullanır.<ol>
<li>Micrococcal nükleaz (MN) ~ 450 adet (U) bir konsantrasyon, suda çözülür / mL. Karşı distile su diyaliz ve 300 U/mL için ayarlayın. Dalak fosfodiesteraz (SPD) çözüm diyaliz ve 4 U/mL için ayarlayın.</li>
			<li>MN ve SPD son konsantrasyonları 150 mU/µL MN ve 2.5 mU/µL SPD (MN/SPD çözüm) karıştırın. 12.5 µg içeren DNA çözüm alın ve bir Buharlaştırıcı kuruluk için buharlaşır. 6.5 µL distile suda çözülür.</li>
			<li>5.0 µL MN/SPD çözüm ekleyin (MN son konsantrasyonu 60 mU/µL, SPD son konsantrasyonu 1 mU/µL) ve 1.0 µL sindirim tampon (sodyum süksinat son konsantrasyonu 20 mM, CaCl2 final konsantrasyon 8 mM). Son birimin karışımı 12.5 µL. olduğunu Mix ve 37 ° C'de reaksiyonlar 3 h için izin</li>
			<li>2.5 µL (başka bir tüp için transfer) daha fazla seyreltme ve değiştirilmemiş deoxynucleotides (2.5.7.) analizi için Kaldır</li>
		</ol></li>
		<li>Nükleaz P1 zenginleştirme yordamı
		<ol>
<li>Hidrolizat için kalan 10.0 µL eklemek 0.65 µL sodyum asetat tampon (son konsantrasyonu, 40 mM), 0.65 µL ZnCl2 çözüm (son konsantrasyonu 0,1 mM), 1,25 µL NP1 çözüm (son konsantrasyonu, 0.385 µg/µL) ve 0,45 µL distile su. Son karışım 13 µL birimdir.</li>
			<li>37 ° C'de 30 dk için tepki karışım izin verin ve Tris çözüm 3 µL eklenmesi ile reaksiyon sonunda.</li>
		</ol></li>
		<li>n-Butanol zenginleştirme yordamı
		<ol>
<li>DNA hidrolizat için kalan 10.0 µL 215 µL 11,6 mM amonyum formiat çözüm, pH 3.5 ve 25 µL 10 mM TBA klorür çözüm ekleyin. 250 µL nile özü-dinç karıştırma tarafından butanol (su ile doymuş). Ayrı katmanlara ve üst nalmak 1.600 x g de (3 dk) spin-butanol katmanı. Bir kez daha 250 µL nile özü-butanol (su ile doymuş), spin, üst nal-butanol katman ve eski özü ile birleştirmek.</li>
			<li>400 µL su ekleyin ( nile doymuş-butanol) bu ayıklamak ve kuvvetle karıştırın. Ayrı katmanlara ve alt sulu katman silmek için spin. 400 µL su kullanarak bu çamaşır yordamı yineleyin ( nile doymuş-butanol). 250 mm Tris-HCl bir çözüm, pH 9,5, 3 µL eklemek için n-butanol katmanı. Nbuharlaşır-butanol bir Evaporatör, ortam sıcaklığında kuruluk için.</li>
			<li>Kalıntı 100 µL nçözülür-butanol, kuruluk için yeniden buharlaşır ve kalıntı 16.0 µL suda çözülür.</li>
		</ol></li>
		<li>Etiketlerine göre adducts
		<ol>
<li>(Arabellek etiketleme) bicine tampon çözeltinin 1 µL ve 4,5 µL 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol soğuk ATP ve 10.0 içeren bir karışımı ekleyin U, T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinaz) 16.0 µL çözüm için NP1 veya butanol zenginleştirme mix üzerinden. Reaktifleri son konsantrasyonları aşağıda olacak: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM spermidine ve 0.5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Toplam karışımı 20 µL birimdir.</li>
			<li>Oda sıcaklığında 30 dakika tepki karışım izin verin. Tüm örnek uygulamak (i.e. 20 µL) PEI-selüloz TLC plaka üzerine (2.5.6.).</li>
		</ol></li>
		<li>NP1 veya n etkinliğinin değerlendirilmesi-butanol yordamlar artırılması
		<ol>
<li>Dibinde tüp 50 µL su ile yıkayın. Orada kurmak için 30 s ve spin bir santrifüj 1.600 x g (1 dk) için şiddetle hiç bulaşma kapağı üzerinde karışımıdır. 5 µL PEI-selüloz TLC tabağa (20 x 20 cm) nokta. Bir çözüm 280 mM (NH4)2ile çok kullanarak Kromatograf4 ve 50 mM NaH2PO4, pH 6.8.</li>
		</ol></li>
		<li>Adducted deoxynucleotides ayrılması TLC
		<ol>
<li>Önceden TLC plakaları distile su ile yıkayın. Özellikle ev yapımı tabak için önerilir. Not: Bu yıkama Kaplamalar, arka plan, özellikle Çözücü açık yükseltebilir bir renk sarı renk kaldırmak için yapılmalıdır.</li>
			<li>Tüm örnek PEI-selüloz TLC plaka üzerine spot ve Kromatografi başlatmak (2.5.4.); Temizlik adducts D1 ve D2 yön (Şekil 2) plaka geliştirme tarafından gerçekleştirilir.</li>
			<li>Bir D1 yönde (Şekil 2) plaka geliştirmek. Kullanım 1.7 M sodyum fosfat tampon, DNA adducts emin olmak için pH 6.8, TLC plaka başında kalan. Mahsum, plaka bu tampon kullanarak D2 yönde geliştirmek. Yordamlar için olası arabellekleri hakkında bilgi için bkz: çözümler çeşitli çözümlenmesi için açıklanan adducts20,28. Not: Plaka D2 yönde geliştirilmesi atlanabilir.</li>
			<li>Kromatografi için yaklaşık 5 dakika içinde iki ardışık banyo sonra plaka deiyonize suyla yıkayın. Bundan sonra tabakları kuru.</li>
			<li>Plakayı 3.5 M lityum formiat tampon, pH 3.5 kullanarak D3 ve D4 yönde geliştirmek, D3 yön için 8.5 M üre ve 0,5 M Tris-HCl tampon, pH 8.0, D4 yön (Şekil 2) için 0, 8 M LiCl ve 8.5 M üre içeren. Çözücüler adduct noktalar TLC plaka üzerinde geliştirmek için ayarlanması gerekir. D3 ve D4 gelişmekte olan yordamlar için olası arabellekleri hakkında bilgi için bkz: çözünürlük birkaç tür23,24,25,28adducts için açıklanan çözümler.</li>
			<li>D4 yön ve su yıkama kalkınma sonra D4, herhangi bir sorunları önlemek için 1.7 M sodyum fosfat, pH (genellikle D5 yönde gelişme olarak atanmış), 6.0 bir kağıt fitil (12 x 11,5 cm) üst (D4) boyunca levha geliştirmek. Not: D5 yön aynı zamanda atlanabilir. Bu durumda, solvent TLC zirvesine ulaşmıştır TLC tankı açın ve kaçmak için 60 dakikaya kadar izin vermek gereklidir. Bu yöntem bir fitil (sık sık D4 herhangi bir sorun silmek için birçok laboratuvarlarda kullanılan yöntemi) ekleyerek daha bile iyidir.</li>
		</ol></li>
		<li>Normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides miktar hidroliz sonra
		<ol>
<li>Hidrolizat bir aliquot seyreltik (--dan 2.5.1. DNA hidroliz açıklayan) distile su ile (i.e., 2.5 µL sindirim karışımı 2.5.1. 250 µL için ayarlanabilir ve bu çözümün 10 µL ayarlanabilir 150 µL).</li>
			<li>5 µL (10 pmol normal deoxynucleotides) bu özünü aliquot al, 2.5 µL 10 mM Tris-HCl tampon, pH 9.0 ve etiket olarak ekleyin 2.5.4. (karışım son hacmi 10 µL is). Oda sıcaklığında 30 dakika tepki olanak sağlar.</li>
			<li>4 µL karışımı aliquot al ve 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 ile 750 µL oranında seyreltin. Mix ve spin kapağı yok kirlenme kurmak için. 5 µL PEI-selüloz TLC tabak içinde geçerli. Yani 280 mM (NH4)2bir çözümde TLC plaka geliştirmek4 ve 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. TLC sonra kurumasını sağlar.</li>
			<li>Yaklaşık 45 dakika, dört değiştirilmemiş deoxynucleotide bis-fosfat yerelleştirmek için ortam sıcaklığında gerçekleştirilen autoradiography kullanın. Spot için miktar sıvı mercek veya sayma Cerenkov kesti.</li>
		</ol></li>
		<li>Göreli hesaplanması adduct (RAL) etiketleme
		<ol>
<li>Adduct noktalar sayar ve etiketli değiştirilmemiş (normal) deoxynucleotides aliquot sayar değerlerini belirleyin. Not: İkinci eski, RAL değerleri adduct düzeylerinin değerlendirilmesi için değiştirilmemiş (normal) deoxynucleotides sayısı uygulamak için dönüştürme faktörü olan bir rakam daha malzeme daha az 180.000 sayıları belirlenmesi gerekir. DNA RAL adducts yukarıda gösterilen denklem (2) göre hesaplanır.</li>
		</ol></li>
		<li>Bağlama test kanserojen veya uyuşturucu radyoaktif etiketli ilaç kullanarak DNA tespiti
		<ol>
<li>3H veya 14C radyoaktivite sıvı mercek sayarak kimyasallarla değiştirilmiş DNA değerlendirmesi.</li>
			<li>10-50 µL DNA çözüm mercek şişe bir mercek çözümde 3 mL ekleyin. İyice karıştırın. Mercek sayaç radyoaktivite ölçmek.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Bu yazıda, yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji bioactivated kovalent DNA'ın üretimi kaynaklanan metabolik ara ürün için olmak kimyasallar potens eğitim adducts gösterilmiştir. Bu çok önemli bir konudur, çevresel kimyasallar potens veya enzimatik onların harekete geçirmek için kovalent DNA üreten metabolitleri ilaçların değerlendirilmesi adducts çünkü kanser ve tedavisi, geliştirilmesinde önemli bir alandır. DNA'sı değişikliğe göre kanserojen tümör gelişiminin neden kabul şimdi kanserojen tarafından neden karsinojen...

Xenobiotics (çevresel kimyasallar veya ilaçlar) metabolizma iki aşama1' oluşur. Evre ı ve II amacı başlangıçta hidrofobik (suda çözünen) bileşikleri daha hidrofilik işlemek için (suda çözünen), böylece bunları kolayca yolu ile idrar, dışkı ya da ter excretable yapma. Aşama ı (functionalization) reaksiyonları içerir oksidasyon, Redüksiyon, ve prokollajen katalize enzimler tarafından sitokrom P450s gibi (P450s, CYPs), peroxidases (i.e., Siklooksijenaz, COX), aldo-keto redüktaz (AKRs) ve mikrozomal monooxygenases (FMOs) flavin içeren. Ayrıca çeşitli redüktaz Yani, mikrozomal NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitozolik NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), ksantin oksidaz (XO) ve aldehit oksidaz (AO)1 tarafından aracılı indirgeme reaksiyonu içerir faz . İkinci aşama (fiil), aşamasında bağlanmıştır Fonksiyonel grupların ben polarizasyonu daha da artırmak için küçük polar moleküller eşlenik için kullanılır. Faz II dahil sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases Katekol -O- Metiltransferaz (COMT), glutatyon Sgibi tepki katılmak için kabul enzim örnekleri- Transferazlar (GSTs) ve üridin nükleotittir glucuronosyltransferases (UGTs)1. Enzimler aşamasında sınıflandırılması ı ya da II olduğunu, ancak, değil katı ve bazı enzimler tartışmasız her iki kategoride gruplandırılabilir.
P450 enzimleri (AK 1.14.14.1) proteinler mevcut birçok kimyasallar, onların dönüşüm3,4katalizlerler Biyotransformasyon katılmak çeşitli organizmalarda içeren heme vardır. Oksijen ikinci atom formu su ile iki elektron [denklemi (1 gerektirir tepki azalır iken nerede dioxygen bir atom xenobiotics, molekül giriliyor bir tepki ile birçok yüzeylerde prokollajen P450 enzimleri katalizler )]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)
Memeli hücreleri (mikrozomal P450 sistemleri) endoplazmik retikulum membran lokalize P450 enzimleri daha fazla NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitokrom b5 içeren multienzyme monooxygenase sistem üyesi olan , NADH: sitokrom b5 alfa redüktaz enzim substrat olarak adlandırdığı. Genel kabul gören bir teori çelişkisiz P450 için gerekli iki elektron verici NADPH/POR sistemidir. Yine de, sitokrom b5 elektron bir donör P450 için yani olarak ikinci azalma, tepki döngüsü sırasında P450 azaltarak elektron bir donör NADH: sitokrom b5 ile birlikte hareket nereye hareket redüktaz2,3,4.
Memeliler çeşitli P450 enzimleri kullanmak (Örneğin, aileler 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 ve 27 enzimler) gibi steroid, değerli endojen bileşiklerin sentezi için ve doğal ürünler2,3 katabolizma için kullanabilirsiniz . Diğer CYP memeli enzimler, gibi insan CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ve 3A4, metabolize eksojen kimyasallar, ilaç olarak kullanılır. 5 , 6 ilaçların metabolizması katalizlerler en önemli 3A alt familya, özellikle CYP3A4 CYPs enzimlerdir. Xenobiotics pro-kanserojen ve pro-toxicants, gibi dönüşümleri insan CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 ve 3A42,5tarafından aracılık. Bu CYPs çoğu karaciğer (hariç, CYP1A1 ve 1B1) mevcut. Yine de, CYPs de birkaç extrahepatic organlarda ifade edilir. Böyle P450s büyük önemi, ağırlıklı olarak olabilir katıldığınız zaman onlar bioactivation kimyasallar (ilaçlar) metabolizmasında bu organları7reaktif ara ürün için. Bu durumda mutlaka olmamasına rağmen çeşitli P450s onların yüzeylerde vardır çeşitli bileşikler tarafından indüklenir.
Birçok P450 enzimleri kimyasal (ilaç) toksisite bir rol oynamaktadır. Onlar sadece onların detoksifikasyon metabolitleri xenobiotics dönüştürmek ama aynı zamanda onları Ayrıca genellikle onların toksisite neden farklı biyolojik özellikleri sergilemek endojen oluştururlar değiştirmek reaktif türler için harekete geçirmek. DNA, yağlar ve proteinler onların değişikliğe göre reaktif electrophiles ve aktif kimyasallardan üretilen radikaller için hedef olabilir. DNA söz konusu olduğunda, birkaç önemli gen yanıt ve mekanizmaları çözme zaten bilinen2,3,4,5.
Değişiklikler DNA hücre büyüme denetim azalmasına neden olabilir ve bu fenomen kanserojen süreçleri gelişimine lider baskın faktör olarak kabul edilir. Kimyasallar ile kovalent DNA nesil adducts kanserojen etki gücüne sahip kanserojen başlatma aşamasında en önemli adımlardan biri8,9,10,11işler gibi karar. Bu gösterilmiştir DNA oluşumu arasındaki ilişkileri adducts ve tumorigenesis oluşan, DNA miktarında azalma adducts ise chemoprevention8,9,10için, sorumludur 11 , 12 , 13 , 14. kanserojen/uyuşturucu-türetilmiş oluşumu DNA adducts DNA bireysel üsleri üzerinde bağlıdır ve bu üslerin DNA dizileri tarafından etkilenir. DNA onarım adducts kendi konumunda (kopya etmek veya sigara transkripsiyonu DNA dizisi) ve değiştirilmiş nükleotit dizileri8,11,12,15, türleri üzerinde bağlıdır 16.
Bu makalede, biz DNA değiştirilmiş metabolitleri aktif olması için onların potens araştırmak için (ilaçlar) kimyasal enzim katalize dönüştürme kullanan yordamlarda açıklanır (DNA üreten adducts). Kovalent DNA bağlama için genellikle test bileşik olmalıdır bağlı olarak bireysel uyuşturucu oksidatif veya indirgeyici reaksiyonlar tarafından aktive. Oksidatif veya indirgeyici harekete geçirmek test edilmiş kimyasal bir P450 bağımlı enzim sistemi mikrozomal hücre altı kesir mevcut tarafından aracılık ettiği ya da azaltma redüktaz ile tarafından microsomes (POR, NADH: sitokrom b5 hem de mevcut redüktaz, P450 enzimleri) ve hücresel sitozolik hücre altı fraksiyonları (NQO1, XO, AO, peroksidaz). Reaktif metabolitleri bundan sonra bağlamak DNA'yı oluşturan DNA adducts. İndirgeyici ve oksidatif reaksiyonlar Bu reaktif tür çeşitli ilaçlara etkinleştirmek önemli olduğundan, yükseltgeme-indirgeme enzimatik sistemi istihdam deneysel yordamlar açıklanmıştır. Ayrıca, adducts algılama ve bu DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Test kimyasal enzim sistemleri tarafından aktif olup olmadığını belirlemek için iki bağımsız yordam DNA'ya bağlı tavsiye edilir: 32P postlabeling tekniği ve radyoaktif etiketli kullanarak bileşik (e.g., 3H ya da 14 C). İlk pilot, 32P postlabeling tahlil eleme önerilir. DNA içeriği tam olarak değerlendirilir, çözümlerinde belirlenmesi her iki yöntem önce gelmesi gerekir.
Radyoaktif olmayan kimyasallar (kanserojen/ilaç) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-radyoaktif fosfor (32P) ile ek fosforilasyon tarafından değiştirilmiş DNA'ın enzimatik hidroliz 32P postlabeling tekniği kullanır OH pozisyon ve kimyasal-deoxynucleotide ayrılması adducts normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides Kromatografi17 tarafından (şekil 1). Kimyasal bileşik tarafından değiştirilmiş DNA tarafından endonükleaz, micrococcal nükleaz ve dalak fosfodiesteraz bilinen eksonükleaz aktivitesi, hidrolize. Hem normal (değiştirilmemiş) içeren ve 3´-monophosphates [γ -32P] ATP pH 9,5 formu 5´- için taşıyıcı (radyoaktif olmayan) ATP ve T4-polinükleotit kinaz huzurunda ile tepki deoxyribonucleoside değiştiren hidrolize DNA karışımı 32P etiketli 3´, 5´-bisphosphates ( şekil 1' deki "Standart" bir prosedür). Kullanılan alkali pH deoxyribonucleoside 3´-monophosphates konumu 3´, dephosphorylate T4-polinükleotit kinaz enzim aktivitesinin en aza indirerek yeteneğine sahiptir. Ayrılık ve çözünürlük 32P olarak etiketlenmiş üzerinden adducts kimyasallar tarafından değiştirilmiyor etiketli deoxynucleotides gerçekleştirilir tarafından çok yönlü anyon-Satım ince tabaka Kromatografi (TLC) polyethyleneimine (PEI) Selüloz (Resim 2 ). (Yönde, D1 ve D2) birinci ve ikinci elüsyon adım etiketli normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides yanı sıra [32P] fosfat başlar, elektrolit kısa bir parçası üzerine su çözümleri kullanarak TLC-PEI-selüloz plaka eluted Kromatografik kağıt hidrofobik özellikleri (kanserojen/uyuşturucu-adducts) sergilenmesi ilişkili kimyasallar içeren deoxynucleotides Ayrıca çözülmesi için PEI-selüloz plaka başlangıcında korunur, ancak TLC plaka üstüne uygulanan birkaç farklı solvent sistemleri ile D3 ve D4 yönde (Şekil 2). Yerelleştirme adducts gelişmiş ekran autoradiography; kullanılarak yapılır ayrılmış adducts röntgen filmleri karanlık tanınabilir noktalar olarak algılanır. Noktalar alanlarında plaka eksize ve radyoaktivite ölçmek için sıvı mercek veya sayma Cerenkov tarafından kullanılır. Harita ve DNA ölçmek için adapte edilmiş yöntemi Imaging bir depolama fosfor tespit chromatograms adducts tarafından 32P postlabeling tahlil şimdi de kullanılır. 18 anlık görüntüleyici makine sık sık böyle algılaması için kullanılmaktadır ve miktar DNA'ın adducts. Bu yöntem daha autoradiography19ekran tekniği gelişmiş 32P algılamak için daha--dan 10 - kat daha yüksek hassasiyet sağlar.
DNA miktarda adducts göreli değerleri denklem (2) aşağıdaki gibi kullanarak hesaplanan (RAL), etiketleme adduct gibi belirlenir:
BGBM. Buna deoxynucleotides Sigara RAL =---(2) 32P-ATP belirli aktivite (BGBM. / pmol) x pmol deoxynucleotides
RALs adducted deoxynucleotides sayısı oranları oranı toplam [adducted ve normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides] saymak oranları değerleri deoxynucleotides20,21. Ancak, bu hesaplama eşittir üzerinde temel verimliliği etiketleme adducts ve normal deoxynucleotides22. Çeşitli DNA adducts için klasik ("Standart") 32P postlabeling tekniği uygun bir uygulamadır (hantal ve/veya hantal adducts), ancak, hassasiyeti tatmin edici değil algılamak için düşük miktarlarda bulunan DNA adducts. Bu yordamı kullanarak, bir adduct 10 değiştirilmemiş7 deoxynucleotides DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) içinde tespit miktarıdır.
Bu klasik 32P postlabeling yordam değişiklikleri çeşitli teknik duyarlılığını yükseltmek için kullanılan. En çok 10-100 kat daha yüksek hassasiyet belirlenmesi, adducts 32P etiketleme elde etti [γ -32P] ATP (yoğunlaşması yordam) sınırlayıcı Düzeyler'i kullanarak. 23 , 24 32P postlabeling yöntemi duyarlılık artışı sindirilir DNA içeren bir kuluçka kullanır sağlayan başka bir yordam nükleaz P1 (dan Penicillium citrinum)21 (şekil 1) ile adducts. Deoxynucleotides ile ilişkili kimyasallar (adducted nukleotid) aslında değil yüzeylerde Bu enzim ise bu enzim değiştirilmemiş deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate tercih ediyor. Bu nedenle, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (örneğin, deoxyribonucleosides) T4-polinükleotit kinaz tarafından [32P] fosfat γ -32P tarafından fosforile değil] ATP. Ancak, bazı kimyasallar nerede nükleotit (adducted deoxynucleotides) bağlı, arylamine adducts gibi deoxyguanosine, can bedephosphorylated Bu enzim tarafından C8, yerine. Buna ek olarak, çoğu diğer adducts (örneğin, adducts N2 deoxyguanosine yerine) nükleaz P1 tarafından dephosphorylated değil. Bu değişiklik 32P postlabeling bu yöntem çok daha hassas, duyarlı üçten fazla büyüklük artan getirir. Ayrıca, 32P postlabeling bu sürümü için bir yöntem sağlar nerede daha yüksek miktarda DNA (5-10 µg) ve taşıyıcı-Alerjik bir fazlalığı [γ - 32P] ATP kullanılan.
Zenginleştirmek için başka bir yöntem adducts, Gupta25tarafından açıklanan, fizikokimyasal kullanır özelliklerinin hantal deoxynucleotide adducts, hangi-ebilmek var olmak hulâsa n-butanol faz transfer Ajan tetrabutylammonium varlığında değiştirilmemiş deoxynucleotides kötü bu organik çözücü tarafından ayıklanır ise [32P] fosfat, etiketleme önce klorür (TBA) (şekil 1). Ancak, daha az hidrofobik adducts, oluşan deoxynucleotides örneği ile aromatik olmayan hantal moieties ya da küçük alkil artıkları, değişiklik için değil etkili çıkarılan nile-butanol. Bu nedenle, onlar ne zaman 32P postlabeling yöntemi bu değişikliğe göre analiz edilir aslında belirlenemeyen vardır.
Hem daha önce bahsedilen sürümleri 32P postlabeling artış duyarlılık ve miktar DNA'ın adducts son derece (üç büyüklük kadar), 109,10 başına normal sigara bir tespit edememek nükleotit (0.3 - 3 Ekrem/µg DNA). Bu iki yöntem kimyasallar kovalent DNA'yı bağlamak onların verimlilik için test etmek için tavsiye edilir ve bu nedenle, bu iş ayrıntılarda açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Roth</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>Fenol / Kloroform / İzoamilalkol</td><td>Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Penta</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>Buzağı timus DNA'sı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz 6-fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz 6-fosfat dehidrojenaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Süperzomları</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>İnsan karaciğer mikrozomları</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroksipirimidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Buzağı dalağından dalak fosfodiesteraz, Tip II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Penicillium citrinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630'dan</td> Bicine Sigma-Aldrich 163791 DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Spermidin Sigma-Aldrich S2626 Tetrabütilamonyum klorür Sigma-Aldrich 86870 n-Bütanol'den P8630 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-polinükleotid kinaz</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI emdirilmiş selüloz TLC plakaları</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Anında Görüntüleyici A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Eliptisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitrobenzanthrone</td>, <td>ref. 40'ta</td><td></td><td></td> gösterildiği gibi hazırlanmış (sentezlenmiş)</tr></tbody></table>

kovalent dna oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu vitro ve kararlılıklarını 32p-postlabeling tarafından adducts

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Kovalent DNA adducts kimyasallar tarafından kurulan veya uyuşturucu kanserojen etki gücü ile kanserojen işlemleri başlatma aşamasında en önemli faktörlerden biri değerlendirilecektir. Tumorigenesis nedeni olarak kabul edilir, bu kovalent bağlama şimdi kimyasal karsinojenezis merkezi bir dogma olarak değerlendirilir. Burada, sitokrom P450 tarafından katalize reaksiyonlar istihdam yöntemleri açıklanmıştır ve ek Biyotransformasyon enzimler kimyasal madde veya ilaç metabolitleri bu DNA şekillendirme için onların harekete geçirmek için potens araştırmak için adducts. Hücresel kesirler Biyotransformasyon enzimler (mikrozomal ve sitozolik örnekleri ile cytochromes P450 ya da diğer Biyotransformasyon enzimler, Yani, peroxidases, NADPH: sitokrom P450 sahip yalıtım açıklayan yordamlar sunulmaktadır oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase veya ksantin oksidaz). Ayrıca, yöntem açıklanmıştır kullanılabilir analiz kimyasallar metabolik aktivasyonu için bu enzimler DNA izolasyonu için hem de. Ayrıca, algılama ve kimya/ilaç-elde edilen DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri adducts, Yani, 32P postlabeling tekniğinin farklı değişiklikler ve radyoaktif etiketli istihdam kimyasal analiz, vardır ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Kimyasal maddeler (kanserojen/ilaçlar) potens onların kovalent sonuçlanan ara ürün için metabolize araştırmak için harekete geçirmek enzim katalize (Yani, P450, peroksidaz, redüktaz) kullanımı için burada açıklanan protokolleri kullanarak DNA için bağlama (DNA nesil adducts), antikanser Ajan ellipticine farmakolojik eylem (için bir daha gözden geçirme gördüğünüz gibi29,30,31), (i) bir ro...

Çevresel kimyasallar ve ilaçlar enzimatik bioactivated kovalent DNA oluşturma ara ürün için adducts, olmak, potens değerlendirilmesi, kanser ve tedavisi geliştirilmesinde önemli bir alandır. Yöntemleri teknikleri onların algılama ve miktar yanı sıra DNA adducts forma bileşik harekete geçirmek için açıklanmıştır.

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Bu protokolün genel amacı, kimyasalların veya ilaçların kovalent DNA eklentileri oluşturan metabolitlere aktivasyonları için potansiyellerini araştırmak için sitokrom p450 ve ek biyotransformasyon enzimleri tarafından katalize edilen reaksiyonları kullanan yöntemlerin tanımlanmasıdır. Bu yöntem, kanserin gelişimi ve tedavisi alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kanser gelişiminin başlangıcını temsil eden kovalent DNA eklentileri oluşturmak için çevresel kimyasalların veya ilaçların potansiyelini değerlendirmek için bir tür yöntem göstermesidir.Kimyasalların kanserojen etkisini belirleyen tekniğin etkileri. Çevresel potansiyel, toksik maddeler ve ilaçlar ve ayrıca bu tür bileşikler tarafından oluşturulan kovalent DNA eklentilerinin oluşumu için nispeten basit yöntemler belirler. Bu yöntem, kanserin gelişiminin başlangıcı ve tedavisi hakkında fikir verebilse de, diğer bilimsel alanlara da uygulanabilir.Moleküler mekanizmalar, DNA hasarı çalışmaları ve enzimatik aktivasyon ve kimyasalların toksifikasyonu üzerine sözlü çalışmalar gibi. Bu yöntem fikrini ilk olarak kimyasal karsinogenezin başlangıç aşamasında yer alan süreçleri araştırdığı

formation-covalent-dna-adducts-enzymatically-activated-carcinogens

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz topoizomeraz bir protein tarafından desteklenmektedir moleküler ölçekli cihaz montaj ve uygulama göstermektedir. Inşa uçları iki farklı fluorophores ekleyerek doku kesitlerinde DNA kırıkları başlıca iki tipi etiketler moleküler biyo-sensör.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Radikal tabanlı biomimetic kimya biyolojik gelişimi için gerekli bina-up kütüphaneler uygulanmıştır.

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Α-prokollajen sitokrom P450s tarafından kanserojen nitrozaminler ve mutasyonlar neden DNA-zarar intermediates üretir kabul edilen metabolik yoludur. Ancak, yeni verileri daha fazla nitrosamides oksidasyon oluşabilir gösterir. Biz genel bir tarif yöntemi nitrosamides tespit için üretilen vitro sitokrom P450 katalize metabolizması nitrozaminler.

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Keşfedin, çevresel kimyasalların ve ilaçların kovalent DNA adduktları oluşturma potansiyelini sitokrom P450 enzimleri kullanarak değerlendirme yöntemini. Bu teknik, kanser gelişiminin başlangıcını incelemek için kritik öneme sahiptir.

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını ³²P-postlabeling tarafından Adducts

Daha fazla video keşfet