Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Bu yayının temel amacı, kemirgenlerin mikrobiyomunu normalleştirmek için bir yöntem sunmaktır. Bu gösteride, çevresel zenginleştirmenin mikrobiyom üzerindeki etkisi, kolon tümörü oluşumu sırasında test edilmiştir. Bu protokol, çevresel zenginleştirme müdahalesinden önce mikrobiyomun normalleştirilmesinin deneysel tekrarlanabilirliği nasıl geliştirdiğini göstermektedir.

Ayrıca, zenginleştirilmiş bir ortam kullanarak hayvan stresinin nasıl azaltılacağını ve etkileşimlerin nasıl geliştirileceğini de gösteriyoruz. Her ne kadar bir kolon tümörü modelinde çevresel zenginleştirmenin etkisine odaklanmış olsak da, yöntem mikrobiyomun hastalık etiyolojisindeki rolünü daha iyi anlamak için kolayca uygulanabilir. Kafesleri steril koşullar altında kurun, havalandırmalı bir başlık altında çalışın.

Bu deneyin kontrolleri, yuvalama için yatak takımları ve laboratuvar dokusu olan geleneksel kafeslerden oluşur, ancak bunun dışında zenginleştirme cihazlarından yoksundur. Yavru yetiştirme veya çevresel olarak zenginleştirilmiş kafesleri kurmak için, iki büyük otoklavlanmış kafesi sterilize edilmiş rondela ile güvenli bir tünel ile bağlayın ve taban alanını artırmak için her kafese sterilize edilmiş bir platform ekleyin. EE için ayrıca sterilize edilmiş koşu tekerlekleri, tüneller, iglolar, kulübeler, sürünme topları ve yuvalama malzemeleri sağlayın.

Eşit havalandırma sağlamak için hem zenginleştirilmiş hem de kontrol kafeslerini aynı rafa yerleştirin. Üreme için, normal kafeslerde bir sire ve iki potansiyel barajı birleştirin. Her sabah, hayvanın gece boyunca çiftleştiğini gösteren vajinal tıkaçları kontrol edin.

Bir tıkaç görülmezse, vajinal sondalamaya direnç, içselleştirilmiş bir tıkaç tespit edebilir. Bir dişinin vajinal tıkaç varsa, onu büyük bir yavru yetiştirme kafesine aktarın. 12 adede kadar hamile baraj, aynı hafta içinde teslim edilmeleri beklendiği sürece, çevresel olarak zenginleştirilmiş kafeslere yerleştirilebilir.

Yavrular 21 ila 28 günlük olduğunda, erkekleri ve dişileri genotipe göre kontrol ortamlarına veya zenginleştirilmiş ortamlara dağıtın. Her kafeste her genotipin bir oranını bulundurduğunuzdan emin olun. Zenginleştirilmemiş kafesler beşe kadar fareyi destekleyebilirken, zenginleştirilmiş kafesler sosyal uyarım için en az 20 fareye ihtiyaç duyar ve 41 fareye kadar destekleyebilir.

Farelere ötenazi yapmadan bir veya iki gün önce dışkı toplamaya başlayın. Her zaman günün aynı saatinde toplayın. Canlı hayvanlardan dışkı toplamak için, hayvanı temiz bir kafesin üzerine dikkatlice sürün.

Daha sonra steril forseps kullanarak dışkılamış dışkıyı toplayın ve steril bir mikrofüj tüpüne aktarın. Bir hayvan hemen dışkılamazsa, temiz bir kafese koyun ve hayvanın dışkılamasını bekleyin, bu bir saat kadar sürebilir. Ötenazi yapılmış bir hayvandan dışkı toplamak için, kolona erişmek için onu inceleyin.

Daha sonra çekumun hemen altındaki kolonu kesin ve kolonu bir parça filtre kağıdının üzerine koyun. Ardından kolon tüpünün üst kısmını kaldırmak için forseps kullanın ve lümeni makas kullanarak açın. Kolonu uzunlamasına açmak için uzunlamasına distalden proksimal kesin.

Daha sonra dışkıyı distal kolondan steril forseps kullanarak steril bir mikrofüj tüpüne toplayın. Dışkı örneklerini eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dışkıya ek olarak, kolon ve ince bağırsaktan, mikrozomlardan, yağ dokusundan vb. diğer doku örneklerini toplayın.

Bir dışkı patojeni tespit protokolünü takiben mikrobiyal DNA'yı dışkıdan izole etmek için ticari bir kit kullanın. Bunu yaparken, numuneleri eksi 80 santigrat derece dondurucudan kuru buz üzerine aktarın ve tartın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi mikrobiyal DNA'yı çoğaltan bir PCR ayarlayın.

Ardından reaksiyon ürünlerini manyetik boncuklar kullanarak temizleyin. Temizlemek için, reaksiyon ürünlerini bir araya getirmek için önce amplikon PCR plakasını kısaca santrifüjleyin. Daha sonra, manyetik boncukları eşit şekilde dağıtmak için girdaplayın ve her reaksiyona 20 mikrolitrelik alikot aktarın.

Tüm hacmi 10 kez yavaşça pipetleyerek boncukları solüsyonla iyice karıştırın. Sonra boncukların beş dakika oturmasına izin verin. Ardından, PCR plakasını manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve boncukların manyetik olarak toplanmasını takiben süpernatantların temizlenmesi için iki dakika bekleyin.

Ardından süpernatanları çıkarın ve atın. Daha sonra, plaka hala mıknatısın üzerindeyken, her bir boncuk kuyusunu 200 mikrolitre taze% 80 etanol ile doldurun ve 30 saniye bekleyin. Sonra süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın ve boncukları 10 dakika kurumaya bırakın. Şimdi, plakayı manyetik standdan çıkararak ve her bir oyuğa 52.5 mikrolitre Tris ekleyerek reaksiyon ürünlerini boncuklardan ayırın. Tüm hacmi 10 kez yavaşça pipetleyerek boncukları tamamen çözelti içinde karıştırın.

Daha sonra boncukları daha önce olduğu gibi manyetik stand üzerinde toplayın ve 50 mikrolitre süpernatanı temiz bir PCR plakasına aktarın. Plakayı şeffaf bir yapıştırıcı ile örtün ve eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın. Adaptör dizisine barkodlar eklemek için bir indeks PCR gerçekleştirmek için toplanan süpernatanı kullanın.

Daha sonra ürünleri saflaştırın ve indekslenmiş kütüphaneyi sıralama için hazırlayın. Farelerde, çevresel zenginleştirmenin yaşam süresini ve tümör yara onarımını iyileştirdiği bilinmektedir. Mikrobiyotanın bu fenotipteki rolünü tanımlamak için, üreyen hayvanlar, mikrobiyotayı normalleştirmek için en az bir ay boyunca fare kolonisine entegre edildi.

Daha sonra yetiştirildiler ve dölleri zenginleştirilmiş bir ortamda veya normal bir ortamda yetiştirildi. Döller ayrıca tümör taşıyan veya vahşi tipti. 16 hafta sonra, hayvanlara ötenazi yapıldı ve mikrobiyal DNA'yı izole etmek için dışkı örnekleri toplandı.

Daha sonra, mikrobiyom bileşenlerini araştırmak için örneklerdeki 16S ribozomal alt birimini amplifiye etmek için PCR kullanıldı. Reaksiyon ürünleri daha sonra barkod indeksleme kullanılarak tanımlandı. İlginç bir şekilde, gelişmiş ortamlar vahşi tip hayvanlarda biyolojik çeşitliliği iyileştirmez, ancak tümör taşıyan hayvanlarda biyolojik çeşitliliği büyük ölçüde artırır.

Bu, yöntemin hassasiyetini gösterir. Biyoçeşitlilikteki bu artış, alfaproteobakteri ve betaproteobakteri sınıflarında önemli artışlar ve patojenik gamaproteobakterilerde azalma ile Proteobakteri filumunun varlığının artmasına bağlandı. Betaproteobakteri sınıfındaki en büyük artış, salgılanan immünoglobulin A bozunmasında rol oynayan muhtemel bir kommensal olan Sutterella cinsindeydi.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz müdahalelere başlamadan önce deney hayvanları arasındaki mikrobiyomu normalleştirmek için hayvancılık uygulamalarını nasıl değiştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hayvanların çevre içinde kendi bölgelerini kurduklarını unutmayın. Bu nedenle, çevredeki değişiklikler hayvanın mikrobiyomunu etkileyecek strese neden olabilir.

Hayvanın davranışındaki ani bir değişiklik, stresin fiziksel bir işaretidir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan mikrobun hastalığın ilerlemesi üzerindeki yeterliliğini test etmek için spesifik mikroplar izole edilebilir ve daha fazla karakterize edilebilir.