Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Bu yöntem, bilim adamlarının, immünostimülatör özelliklerini incelemek için tümör taşıyan farelerin kanından ve tümörlerinden monosit türevli DC'leri izole etmelerine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu işlemin diğer yöntemlere göre en büyük avantajının, elde edilen monosit türevi DC'lerin tümör ve kandaki aktivasyon durumlarını daha iyi yansıtması olduğunu düşünüyorum. Muhtemelen en zor şey, tüm reaktiflerinizin ve aletlerinizin steril olduğundan ve bu prosedür sırasında kontaminasyona neden olmayacağınızdan emin olmaktır.

15 yılı aşkın bir süredir miyeloid hücreleri ve dendritik hücreleri tümörlerden izole ediyorum ve farklı izolasyon protokollerinin farklı hücre aktivasyon modelleriyle sonuçlandığını fark ettiğimde bu yöntem fikrine sahip oldum. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Bayan Santana-Magal olacak.

Fareleri laminer bir akış başlığı içinde karbondioksit kullanarak ötenazi yaptıktan sonra, tümörleri çıkarın ve fetal sığır serumu olmadan RPMI ortamına yerleştirin. Ardından, tümörü küçük parçalara ayırmak için ameliyat makası kullanın. Tüm tümör parçalarını tek bir fareden, manyetik karıştırma çubukları ile birlikte kollajenaz IV ve DNaz I ile desteklenmiş HBSS tamponu içeren 30 mililitrelik düz tabanlı bir tüpe aktarın.

Tüpü, tümör parçaları ile birlikte 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde, içinde manyetik bir karıştırıcı ile dakikada 200 ila 400 devirde 20 ila 30 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, 8,5 mililitre HBSS'ye 1,5 mililitre yoğunluk gradyan orta stok çözeltisi ekleyin. Ardından, yoğunluk gradyan ortamını kuvvetlice karıştırın. Sonra, karışımı pelete pipetleyin.

Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme bittikten sonra süpernatanı boşaltın. Peletlenmiş hücreleri iki kez yıkadıktan sonra, bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu 30 mikrolitre CD11b konjuge manyetik boncuklara ekleyin. Daha sonra, karışımı 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu önceden yıkanmış bir manyetik kolon üzerine uygulayın. Ardından, sütunu iki kez yıkamak için üç mililitre izolasyon tamponu kullanın. Ardından, sütunu mıknatıstan çıkarın.

Ardından, sütuna altı mililitre izolasyon tamponu ekleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri steril bir toplama tüpünde temizlemek için bir pistonla itin. Bir kez daha, hücreleri dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin.

Hücreleri yeniden askıya aldıktan ve boyadıktan sonra, küçük yan ve küçük ileri saçılma kullanarak küçük hücreleri geçitleyerek hücreleri sıralayın. Fareye ötenazi yaptıktan sonra üzerine %70 etanol püskürtün. Ardından, laminer başlığın altındaki kalbi kaplayan cildi çıkarmak için cerrahi makas kullanın.

Ardından, makası etanol ile temizleyin. Boşluğu 20 milimolar EDTA HBSS ile yıkayın ve kalbin sağ atriyumunu kesmek için makası kullanın. Ardından, kalbin sağ ventrikülünü 20 milimolar EDTA HBSS ile yavaşça yıkamak için 25 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından, plevral boşluktan kan almak için steril bir şırınga kullanın. Kanı heparan sülfat ve EDTA içeren bir tüpe aktarın. Ardından, kanı yoğunluk gradyan ortamına pipetleyin.

Kan hücrelerini düşük frenli oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücreleri bir tüpte toplayın. Hücreleri yıkamak için hücreleri 10 mililitre izolasyon tamponunda çözün.

Yine, hücreleri dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. CD11b hücrelerini seçmek için, hücre peletini bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Dört santigrat derecede 50 mikrolitre CD11b konjuge manyetik boncuk ile 15 dakika inkübe edin.

Dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de yeniden santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Peleti bir mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, hücre süspansiyonunu önceden yıkanmış bir manyetik sütuna uygulayın. Sütunu izolasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Sütunu mıknatıstan çıkarın ve sütuna altı mililitre izolasyon tamponu ekleyin.

Ardından, pistonu iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri steril bir toplama tüpünde yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Hücreleri izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve florofor konjuge antikorlarla boyayın.

Küçük kenar ve küçük ileri saçılma kullanarak küçük hücreleri geçitleyerek hücreleri sıralayın. İlk olarak, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1.8 tamponlu paraformaldehit içinde sabitleyin. Hücre süspansiyonunu U şeklinde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tohumlayın.

Daha sonra, her bir oyuğa değişen tümör bağlayıcı antikor dilüsyonları ekleyin. Daha sonra, hücreleri 15 ila 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri 150 mikrolitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın.

Daha sonra, dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı dışarı atın ve hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri, florofor konjuge ikincil antikor içeren 100 mikrolitre FACS tamponunda çözün.

Daha sonra, plakayı 15 ila 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. 15 ila 20 dakika sonra, hücreleri yıkamak için 200 mikrolitre FACS tamponu ekleyin. Plakayı beş ila 10 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı boşaltın. Tümör bağlanmasını analiz etmek ve hücreleri kaplamak için gereken minimum immünoglobulin G konsantrasyonunu belirlemek için akış sitometrisi yapın. Hücreler minimal immünoglobulin G konsantrasyonu ile kaplandıktan sonra, CFSE etiketli tümör bağışıklık kompleksini monositten türetilmiş dendritik hücrelere bire beş oranında ekleyin.

Ardından, karışımı gece boyunca tam ortamda 12 ila 16 saat inkübe edin. Monosit kaynaklı dendritik hücre aktivasyonunun FACS analizini gerçekleştirin. Ortalama floresan yoğunluğu, LMP tümör hücrelerini ex vivo olarak bağlayan IgG ve M antikorlarının varlığını incelemek için akış sitometrik analizini takiben hesaplanır.

Sonuçlar, C57-Black/6 allojenik farelerden elde edilen IgG antikorlarının, tümör hücrelerini 129S1 sinjeneik farelerden gelen antikorlardan çok daha güçlü bağladığını göstermektedir. Daha sonra, B16F10 tümör hücrelerinin IgG ile bağlanma kapasitesinin ortalama floresan yoğunluğu hesaplanır. 129S1 allojenik farelerden elde edilen IgG, C57-Black/6 farelerden elde edilen sinjeneik IgG'ye kıyasla B16F10 tümörü ile 10 kat daha yüksek boyama yoğunluğu gösterir.

Daha sonra, B16F10 tümörlerinden tümörle ilişkili, monosit türevli dendritik hücreleri göstermek için DIC mikroskobik görüntüleri yakalanır. Burada, B16F10 tümör taşıyan farelerin kanından izole edilen inflamatuar ve devriye gezen monosit türevli dendritik hücreleri göstermek için DIC görüntüleri yakalanır. Dalak ve kemik iliğinden elde edilen monosit türevli dendritik hücrelerin aktivasyon modellerini, immün kompleks ile inkübe edildiğinde tümör ve kanınkiyle karşılaştırmak için akış sitometrik analizi de yapılır.

Sonuç, kemik iliği ve splenik dendritik hücreler tarafından immün komplekslerle artan CD86 ve MHC II ekspresyonunu gösterir. Daha sonra, dendritik hücreler CFSE işaretli tümör immün kompleksi ile inkübe edildiğinde tümör tutulumunu ve MHC II ekspresyonunu gösteren konfokal immünohistokimya yapılır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür kullandığınız fare sayısına bağlı olarak birkaç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, tüm reaktiflerinizi ve aletlerinizi her zaman steril tutmayı unutmamanız önemlidir. Fare kürkü, kontaminasyonlar için önemli bir kaynaktır. Kılların hiçbirinin dokularınıza temas etmediğinden emin olun.

Bu videoyu izledikten sonra, monositten türetilmiş DC'leri fare kanı ve tümörlerinden nasıl izole edeceğinizi ve erken aktivasyonlarından kaçınırken daha sonra bunları bağışıklık kompleksi hücreleriyle nasıl aktive edeceğinizi iyi bir şekilde anlayacağınızı umuyoruz.