Name: Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, yetişkin iskelet kası uydu hücrelerini immunofloresan boyama ile tanımlama yöntemini. Bu teknik, fizyolojik ve patolojik koşullarda kas kök hücrelerinin dağılımını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIAMS ışık Imaging mikroskoplar ve teknik yardım sağlamak için bölüm teşekkür ediyoruz. MF20 ve Pax7 antikor bankadan gelişim çalışmaları Hibridoma NICHD himayesinde geliştirilip Biyolojik Bilimler Bölümü Iowa Üniversitesi Iowa City tarafından elde edilmiştir. Bu eser Intramural araştırma programı, NIAMS tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri ile desteklenmiştir.

Bu protokol için yetişkin fareler (2-6 ay), tibialis anterior (TA) ve ekstansiyon digitorum longus (EDL), ön arka bacak kasları üzerinde onların SCs boyama ayirt gerçekleştirmek için bir örnek olarak istihdam edildi. Tüm belgili tanımlık merdiven fareler ve kas doku gruptakiler hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), NIAMS/NIH tarafından onaylanmış.
1. fare Hind Lime TA/Edi kas incelemek
<ol><li>Fareyi NIH ACUC kurallar altında bir CO2 dolu ötenazi odasında ötenazi. Servikal yerinden çıkması gerekiyorsa gerçekleştirin.</li>
	<li>Fare yukarı bir diseksiyon üzerinde (sırtüstü) koymak. % 70 etanol karın derisi üzerine sprey. Bir 1-2 cm yatay olarak fare göbek Cilt Merkezi üzerinde açma kesebilir ve sonra fareyi fare ayakları doğru açılış çekerek deskin. Fare hind bacak bir tarafı ortaya çıkarmak.</li>
	<li>İki keskin forseps kullanın: ayak bileği için TA/Edi eklemek tendonlar tutmak için kullanın ve break ve TA/Edi kapsayan fasya yamultmak için diğerini kullanın. Fasya soyulmuş sonra forseps keskin ucu ucunu TA/Edi kas altında çalıştırarak TA/Edi tibia kemikten ayırmak için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Ayak bileği tendon hala onları Forseps ile tutarak makasla kesme. Forseps ile TA/Edi ayak bileği taraftan kaldırma sırasında diz için TA/Edi ayak bileği dan uzunlamasına çizgi boyunca makasla kas kırpın. Bütün TA/Edi tibia dan ayırmak için diz tarafı tendonlar kesilmiş.</li>
</ol>2. Cryo-gömme TA/Edi kas
<ol><li>Bir kap içinde örneğinbir sıvı azot Banyosu hazırlamak., sıvı nitrojen Dewar flask. Methylbutane yarısı dolu için küçük plastik kabı (yaklaşık 20 mL) içine dökün. Sonra kabı dondur için sıvı azot banyoda koymak. Birkaç dakika sonra methylbutane donuk olduğunu denetleyin. Not: Sıvı azot kuru buz bir kova tarafından değiştirilebilir, ancak daha yavaş dondurma zamanı.</li>
	<li>Küçük plastik enjektör pompası düz yüzeyine disseke TA/Edi yatıyordu. Tam olarak TA/Edi ile birkaç damla, en uygun kesme sıcaklık (O.C.T.) bileşik (dondurucu orta) kapsar.</li>
	<li>Sıvı azot banyosu dışında methylbutane kabı alın ve sıcak bir nesne ile yüzey çözülme (örn., makas tanıtıcısı). Hızlı bir şekilde DIP O.C.T. TA/Edi pistonu üzerinde ek-doku dondurmak için erimiş methylbutane kapalı.</li>
	<li>Forseps ile pistonu katıştırılmış dokusundan ayırmak ve 1.5 mL microcentrifuge tüp içine koy. Daha fazla örnekleri işlerken depolamak için sıvı azot tüpü yerleştirin. Not: Katıştırılmış doku-80 ° C-20 ° C veya uzun vadeli (2 yıl) için kısa vadeli (6 ay) saklanır.</li>
</ol>3. cryostat kesit
<ol><li>O.C.T. bir cryostat numune sahibinin Merkezi bileşik bir damla ekleyin. O.C.T. bileşik neredeyse katılaşmış kadar bekleyin. Hızlı bir şekilde katıştırılmış TA/Edi O.C.T. karışımla, ayak bileği tarafı dik için sopa aşağı ve diz tarafı yukarı.</li>
	<li>Numune tutucu bir cryostat üzerine monte, doku 10 µm Aralık kesme ve cryo-bölümleri ile kaplı frost slaytlarda ilgili toplamak bir slayt bölümlerde 4-8.</li>
	<li>Bölümler için en az 3 saat gece oda sıcaklığında kuru. Not: dondurucu gece veya daha uzun bölümlerde kurutma kabul edilebilir olsa da, bu kaçınılmaz autofluorescence artıracaktır. En iyi sonuçlar için Kuru bölümleri için 0,5 h, sonra devam edin fiksasyon ve boyama adımları ile hemen.</li>
	<li>Slaytları bir slayt kutusunda toplamak ve bunları hemen kullanmak veya slaytları-80 ° C veya daha sonra kullanmak için-20 ° C, depolama.</li>
</ol>4. ayirt boyama için hazırlanması reaktifler
<ol><li>
Arabellekleri hazırlayın:
	<ol>
<li>2 L 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 10 x PBS hazırlayın.</li>
		<li>1 x PBS % 16 dan % 4 paraformaldehyde (PFA) 40 mL hazırlayın PFA.</li>
		<li>PBST 2 L hazırlamak: 1 x PBS ile % 0,1 Triton-100.</li>
		<li>PBST-B: PBST 50 mL % 2 sığır serum albumin (BSA) ile hazırlayın.</li>
		<li>10 mL PBST-B-G: PBST % 2 BSA ve % 5 Normal keçi Serum ile hazırlayın.</li>
		<li>1 mL engelleme çözeltisi hazırlamak. Seyreltik AffiniPure Fab parçası keçi Anti-fare IgG (H + L) (1:10) PBST-d.</li>
		<li>200 mL 1 x sitrat arabelleği hazırlayın. Not: Yukarıdaki çözümleri hacimleri en az 5 slayt için yeterlidir. Birimleri istediğiniz slayt sayısını ve slayt konteyner boyutunu göre ayarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antikor lekeleri hazırlayın:
	<ol>
<li>Birincil antikorlar (çalışma konsantrasyonu): birincil antikor Mix 1.2 mL Pax7 fare Monoklonal antikor (Igg1) sulandrarak hazırlamak (1-5 µg/mL) + Laminin tavşan poliklonal antikor (0,5-2 µg/mL) + MF20 fare Monoklonal antikor (Igg2b) (0,5-2,5 µg / mL) içinde PBST-B-G. Not: MF20 fare Monoklonal antikor (Igg2b) isteğe bağlıdır.</li>
		<li>İkincil antikorlar (çalışma konsantrasyonu): ikincil antikor Mix 1.2 mL keçi Anti-fare Igg1 çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor 488 sulandrarak hazırlamak (0,5-2 µg/mL) + keçi Anti-tavşan IgG (H + L) son derece çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor artı 555 (0,5-2 µg/mL) + keçi Anti-fare Igg2b çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) içinde PBST-B-G. Not: Alexa Fluor 647 seçime bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ayirt boyama adımları
<ol><li>
Suyla temasa ve cryo-bölümler PFA ile düzeltin.
	<ol>
<li>Birkaç TA/Edi cryo-bölümü slaytları slayt kutusundan kaldırın. Slaytları bir slayt tutma tepsi oda sıcaklığında ısıtın.</li>
		<li>Bir sıvı engelleyici kalem (PAP kalem) tüm cryo-bölümleri slayt içeren bir çizmek için kullanın. Bu daire çözümleri slaytın dışına akan önlemek.</li>
		<li>Tepsiyi laboratuvar duman kukuIeta götür. 300-500 µL % 4'lük eklemek PFA daire içinde alanı içinde slayda 10 dk. dışarı PFA 1 x PBS ile yıkama için oda sıcaklığında bölümleri düzeltmek için en az 3 x 5 dk bir slayt kap içinde. Dikkat: PFA zehirli ve tehlikeli atık olduğunu; özenle işletilen ve tehlikeli atık konteyner içine atılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antijen alma
	<ol>
<li>Başka bir slayt konteyner sitrat arabellek 200 mL ile doldurulması.</li>
		<li>Slaytları konteyner içine aktarın. Slaytları yüksek basınç modunda 10 dk pişirmek bir düdüklü tencere kapsayıcı slaytlar ile aktarın.</li>
		<li>PBST (200 mL) ile yeni bir kapsayıcı tüm slaytlara 10 dk. Transfer için su boşaltma ile konteyner sakin, PBST ile slaytlar için en az 3 x 5 dakika yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Engelleme
	<ol>
<li>Kimwipes suya batırılmış slaytları slayt kurutma önlemek için nemli bir ortam oluşturmak için tutan tepsisi.</li>
		<li>Slaytlar geri tepsiye hareket ve çözüm her slayda engelleme 200 µL ekleyin. Tepsiyi bir kap ile kapak ve geliştirmek için 30 dk engelleme izin. Not: yüksek arka plan oluşturan fare IgG fare Kas dokularında belirsiz bağlama yani fare Monoklonal antikor Pax7 antikor var. AffiniPure Fab parçası keçi Anti-fare IgG (H + L) kullanarak fare fare belirsiz bağlama engeller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Birincil antikorlar uygulanır.
	<ol>
<li>Slaytlar slayt kapsayıcısında bir kez PBST ile yıkayın. Ardından slaytları yeniden boyama tepsi taşıyın.</li>
		<li>Birincil antikor Mix 200 µL her slayta uygulamak, tepsiyi bir kap ile kapak ve 1 h için oda sıcaklığında veya gece kalmak için 4 ° C'de geliştirmek tepki izin. Not: oda sıcaklığında reaksiyon gelişen tatmin edici sonuçlar verir, ancak en iyi sonucu 4 ° C'de gecede tepki verir. Myosin MF20 antikor karışımı bir üçlü (Pax7, Laminin, MF20) etiketleme gerçekleştirmek için eklenebilir. MF20 lekeleri kas lifleri farklı. Bu adımı da ikincil antikorlar (keçi antikorlar) aşağıdaki adımda potansiyel belirsiz bağlama azaltmak için PBST-B-G ile başka bir engelleme adım olarak hizmet vermektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İkincil antikorlar uygulanır.
	<ol>
<li>Oda sıcaklığında PBST ile antikor birincil dışarı yıkama en az 3 x 5 dak.</li>
		<li>İkincil antikor Mix 200 µL her slayta eklemek ve oda sıcaklığında en az 1 h için geliştirmek tepki sağlar. Not: Pax7 + Laminin, keçi Anti-fare Igg1 Alexa 488 ve keçi Anti-tavşan Alexa 555 kullanın. Pax7 + Laminin + MF20 için keçi Anti-fare Igg2b Alexa 647 karışımı ekleyin.</li>
		<li>PBST ile ikincil antikorlar dışarı yıkama en az 3 x 5 dak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) Counter leke ve montaj
	<ol>
<li>DAPI (1:20, 000) PBST slayt kapsayıcısında, örneğin, DAPI 10 µL PBST 200 ml seyreltik.</li>
		<li>3 dk. DAPI kapsayıcısı içindeki slaytları leke.</li>
		<li>PBST ile DAPI dışarı en az 5 x 5 dakika yıkayın.</li>
		<li>Montaj orta slaytlarla bağlayın. Coverslips ile slaytlar kapağı. Dikkat: Zehirli ve tehlikeli DAPI; dikkatli ve tehlikeli atık şişe bertaraf gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. floresan mikroskobu
Not: yukarıda bildirilen immünfloresan boyama protokolü ile bir geniş alanlı floresan veya confocal mikroskop SCs görselleştirme izin verir. SCs tanımlamak için başlangıçta zor olabilir. Burada yardımcı olabilir birkaç önerilen adımlar vardır.
<ol><li>DAPI kanal ve düşük büyütme hedefleri slaytlardaki bölümler görselleştirmek için kullanın.</li>
	<li>Düşük-yüksek boyuta geçiş. SCs gözlemlemek için en az bir 20 X amaç gereklidir).</li>
	<li>İkili filtre küp 488 (FITC) için kullanmak / 555 (rodamine) Pax7 ve Laminin gözlemlemek için SCs tanımlamak için aynı anda sinyalleri. Bu ayarı altında arka plan gürültü daha iyi bir kontrast Pax7 boyama sinyal var.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde FITC kanala doğru SCs tanımlamak için DAPI alternatif. Tüm SCs Pax7/DAPI-pozitif olmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıdaki Protokolü Pax7/MF20 Zebra balığı iskelet kas12tarihinde boyama yöntemi dayanıyordu. Kullanılan ve adımları engelleme çözümleri aynı veya benzer. Kullanılan antikor aynıdır. Ayarlanan adımları fare kas dokusu ve SCs özelliklerini temel. İlk olarak, Laminin antikor görselleştirmek ve SCs konumunu doğrulamak için mix eklendi. SCs mikroskop altında 488/555 çift filtre küp kullanırken saymak için özellikle yararlı; Bu büyük ölçüde gürültülü autofluorescent kökenli öne Pax7 SC elde edilen sin...

Kas iskelet multinucleated kas hücreleri oluşur, myotubes denilen, kuvvet ve daralma ile hareketleri oluşturmak myofibers düzenlenmektedir. En iskelet kasları kraniyofasiyal bazı kasları dışında bir somite1adında bir geçici embriyonik yapısından türetilir. Myogenic öncül hücreleri epitel somite myoblasts olmak için delaminate. Myoblasts daha da çok çekirdekli myofibers oluşturmak için myotubes olmak için sigorta miyositler ayırt etmek. Yukarıdaki işlem myogenesis denir ve gen ekspresyonu tarafından geçici düzenlenir kontrolünü ile karakterizedir. Myogenic Kara filmin tarih öncesi Pax3 ve Pax7, oysa myoblasts Tanrım hızlı ve/veya2,3myogenin ve myosins Myf5 ve miyositler hızlı hızlı. Kas büyüme hangi myofibers daha fazla myonuclei varolan lifleri (Hiperplazi) birleşmeyle ve kas lif boyutu (hipertrofisi)4bir artış daha büyük olmak bir süreçtir. Kas büyüme sırasında onlar ayırt etmek ve kendi kendini yenilemek kök hücre özelliklerine sahip myogenic hücre sürdürülebilir bir kaynağıdır. Bu hücreler uydu fiziksel konumlarını sarcolemma (myofiber, hücre zarı) ve Bazal lamina5arasındaki temel hücre denir. SCs şiddetle Juvenil aşamasında (doğum sonrası fareler ilk 2-3 hafta) kas büyümesine katkıda bulunmak, ama yetişkin kas6dinlenme sakin ol. Dikkat çekici, onlar-ebilmek var olmak yanıt kas olarak yeniden Aktif kişi yaralandı ve hasarlı kas7onarmak için yeni kas hücreleri ayırt etmek.
Kök hücre özellikleri SCs çalışmanın ilgili temel kas Biyoloji ve terapileri kas hastalıkları8için yapmak. Sonuç olarak, son yıllarda yoğun araştırma çalışmaları bir alan olmuştur. Bir muazzam genetik ve epigenetik SCs9,10dissekan ilerlemeler kaydedilmiştir. SCs in situ tespit ve yalıtma de tekniklerin geliştirilmiş olup yol11en iyi duruma getirilmiş. İmmünfloresan boyama SCs tanımlaması için Pax7 da dahil olmak üzere belirli antikor kullanımı sağlar. Ancak, kıtlık ve bir güçlü auto-floresan ile yetişkin iskelet kas dokusunun kombine SCs küçük boyutlu görselleştirme zorlu render. Burada, biz fare kas dokusu için Pax7 için optimize edilmiş ve Zebra balığı kas12için varolan bir yöntemine dayalı bir immünfloresan boyama iletişim kuralı tanımlamak. Buna ek olarak, farklı bir fluorophore ile etiketli bir Laminin antikor Bazal lamina altında SCs yer almaktadır belirlemek için istihdam edilmektedir. Bu iletişim kuralı sürekli Pax7 pozitif SCs ve tüm test fizyolojik şartlarda ve gelişim aşamalarında altında myogenic öncüleri görselleştirme sağlar.

<table><tbody><tr><td>metilbütan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşik</td><td>elektron mikroskobu Bilimleri</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>%16 PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Parçası Keçi Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Sitrat Tamponu</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 mono-klonal fare antikoru (IgG1) (süpernatant)</td><td>Gelişimsel Çalışma Hibridoma Bankası</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laminin poliklonal tavşan antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 mono-klonal fare antikoru (IgG2b) (süpernatant)</td><td>Gelişimsel Çalışma Hibridoma Banka</td><td>N / A Keçi</td><td></td></tr><tr><td>anti-Fare IgG1 çapraz emilen ikincil antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG2 b çapraz emilen ikincil antikor, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1860 kriyostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000 geniş alan floresan mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR geniş alan floresan mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 konfokal mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 konfokal mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuisinart elektronik düdüklü tencere</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kas iskelet uydu hücreleri tarafından pax7 ve laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Ayirt doku bölümlerinde farklı hücre tipleri tanımlamak için yardımcı olan etkili bir yöntemdir. İstenen hücre nüfus çalışma için antikorlar belirli hücre işaretçileri için doku bölümlerde uygulanır. Yetişkin iskelet kas, uydu (SCs) kas onarım ve rejenerasyon katkıda kök hücre hücrelerdir. Bu nedenle, görselleştirmek ve uydu hücre nüfus farklı fizyolojik koşullar altında izlemek önemlidir. İskelet kas istirahat, SCs Bazal lamina ve myofiber plazma zarı arasında yer alır. Myofibers veya hücre kültürü SCs tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici Pax7 Eşli kutu proteindir. Bu makalede, en iyi duruma getirilmiş bir Pax7 ayirt protokol kas iskelet bölümleri üzerinde non-spesifik boyama ve arka plan en aza indiren sunulur. Bir protein (laminin) Bazal lamina tanır başka bir antikor SCs. benzer protokoller tanımlamanıza yardımcı olması için de Pax7 ve ilgi ek proteinler için antikorlar ile ikili veya üçlü etiketleme gerçekleştirmek için kullanılabilir da eklendi.

Belgili tanımlık yukarıda merdiven SCs floresan mikroskop (şekil 1) altında yetişkin dinlenme kas bölümlerde başarıyla görüntülenmeyecektir. Yetişkin kas dokusu lifleri belirli tür güçlü auto-floresan olsa da, parlak Alexa serisi boyalar arka plan gürültü üstesinden gelebilir ve sinyal öne çıkmaktadır (şekil 1A, B; ok uçları). İki fotonlu confocal mikroskobu nispeten temiz görüntü (şekil 1B</...

Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Bu protokolün genel amacı, immünofloresan yoluyla yetişkin iskelet kası uydu hücrelerini tanımlamaktır. Bu yöntem, hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda kas kök hücrelerinin sayısı ve dağılımı ile ilgili temel soruları cevaplayabilir. Tekniğin temel avantajı, kas kök hücrelerinin fizyolojik ortamlarında sadece sınırlı bir manipülasyon ile tanımlanabilmesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Faiza Naz olacak. Başlamak için, sıvı nitrojeni bir Dewar şişesine dökerek bir sıvı nitrojen banyosu hazırlayın. Daha sonra, 20 mililitrelik plastik bir behere 10 mililitre metilbütan dökün ve beheri sıvı nitrojen banyosuna aktarın.Disseke edilmiş tibialis anterior kasını küçük bir plastik şırınga pistonunun düz yüzeyine yerleştirin. Daha sonra, disseke edilmiş kası birkaç damla Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiği veya OCT ile örtün. Metilbütan kabını sıvı nitrojen banyosundan çıkarın, ardından bir makasın saplarını kullanarak yüzeyi çözün. OCT kaplı dokuyu hızlı bir şekilde erimiş metilbütan içine daldırın ve onu dondurun.Daha sonra, gömülü dokuyu pistondan ayırmak ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için forseps kullanın. Ardından, mikrosantrifüj tüpünü sıvı nitrojen içinde saklayın. Kriyostat kesit almaya başlamak için, bir kriyostatın numune tutucusunun ortasına bir damla OCT bileşiği ekleyin ve kısmen katılaşmasına izin verin.Ardından, gömülü dokuyu ayak bileği tarafı aşağı ve diz tarafı yukarı bakacak şekilde OCT bileşiğine yapıştırın. Ardından, numune tutucuyu kriyostat üzerine monte edin ve dokuyu 10 mikrometre aralıklarla kesin. Donmuş her slaytta dört ila sekiz kriyoseksiyon toplayın.Bölümleri oda sıcaklığında üç saat kurutun, ardından slaytları bir slayt kutusunda toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ardından, slayt kutusundan bir slayt çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın. Ardından, sıvıların yandan akmasını önlemek için kriyokesitlerin etrafındaki bir alanı işaretlemek için bir sıvı engelleyici kalem kullanın.Bir davlumbazda, işaretli alana 300 ila 500 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Bölümleri sabitlemek için slaydı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, slayttan paraformaldehiti bir slayt kabında PBS ile durulayın.Antijen alımına başlamak için, bir slayt kabını 200 mililitre sitrat tamponu ile doldurun ve slaytı kaba aktarın. Ardından, sürgülü kabı 10 dakika boyunca yüksek basınçta bir düdüklü tencereye aktarın. Antijen alma adımı, bölümler oda sıcaklığında 30 dakika kurutulursa ve hemen devam edilirse isteğe bağlıdır.Daha sonra antijen alma aşaması gerekli değildir. Ancak bölümler oda sıcaklığında üç saatten fazla kurutulursa ve ardından eksi 80 santigrat derecede saklanırsa, antijen alma aşaması gereklidir. Ardından, slayt kabını 10 dakika akan su altında soğutun.Ardından slaytı 200 mililitre PBST içeren yeni bir kaba aktarın ve PBST ile durulayın. Tepsiye suya batırılmış laboratuvar mendillerini ekleyin, ardından durulanmış slaytı bir PAP kalemiyle kontrol edin ve tepsiye yerleştirin. Slayta 200 mikrolitre engelleme solüsyonu ekleyin.Ardından tepsiyi kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bloke etme adımı çok önemlidir çünkü kullanılan Pax7 antikoru bir fare mono-klonal antikorudur. Fare üzerinde fare engelleme adımı, belirli olmayan bağlamaları azaltır.Ardından, sürgüyü PBST ile sürgü kabında durulayın ve tepsiye geri koyun. Slayta 200 mikrolitre Primer Antikor karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, slaytı PBST ile durulayın, ardından 200 mikrolitre İkincil Antikor karışımı ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.Kuluçka süresinden sonra, slaytı PBST ile durulayın. DAPI'yi bir slayt kabında seyreltin ve slaydı kapta üç dakika inkübe edin. Ardından, DAPI'yi PBST ile beş dakika durulayın.Son olarak, sürgüyü montaj ortamıyla monte edin ve bir lamel uygulayın. Bu çalışmada, uydu hücreleri, floresan mikroskobu altında yetişkin dinlenme kas bölümlerinde başarılı bir şekilde görüntülenmiştir. Genellikle yetişkin kas dokusunda ve belirli lif türlerinde görülen arka plan gürültüsü, fare-fare engelleme kullanılarak azaltılır.Spesifik immünostain sinyalleri, parlak Alexa boyaları ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar kullanılarak arttırılır. İki fotonlu konfokal mikroskop, geniş alanlı floresan mikroskobuna kıyasla daha keskin bir görüntü yakalar. Aynı protokol, genç farelerden, fare embriyolarından ve yaralı yetişkin kas dokularından alınan kas dokusuna da uygulanabilir.Hem juvenil hem de embriyonik kas dokuları, daha aktif uydu hücrelerini veya nispeten daha büyük çekirdeklere sahip Pax7 miyojenik öncülerini gösterir. Böylece, genç farelerin uydu hücrelerini görselleştirmek yetişkin farelere göre daha kolay hale gelir. Yaralı kas dokusunda, daha aktif Pax7 pozitif hücreler görülebilir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, otofloresan ve spesifik olmayan fare-fare immüno-bağlanmasından gelen gürültünün tamamen ortadan kaldırılamayacağını, ancak bu protokolle gürültünün büyük ölçüde azaltılabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kas kriyokesitlerinde uydu hücrelerini nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı...

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu protokol, 9 haftalık farenin branchiomeric merkez kas uydu hücreleri izolasyonunu anlatmaktadır. kaslar, farklı brankiyal kemerlerin kaynaklanmaktadır. Daha sonra, uydu hücreleri farklılaşma çalışma milimetre boyutta bir Noktası kaplama üzerinde kültürlenmiştir. Bu yaklaşım, uydu hücrelerinin genişleme ve pasajlanmasını önler.

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

İskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanması ve kendi kendine teslim edilen siRNA enjeksiyonunun bir kombinasyonunu kullanarak uydu hücrelerinde belirli bir genin fonksiyonel kaybını araştırmak için in vivo yöntemini tanımlıyoruz.

İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokolde, kas kök hücreleri için endojen nişleriyle etkileşimlerinin çoğunu koruyan bir in vitro kültleme ve fonksiyonel analiz yöntemi tanımlanmıştır.

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin, yetişkin iskelet kası uydu hücrelerini immunofloresan boyama ile tanımlama yöntemini. Bu teknik, fizyolojik ve patolojik koşullarda kas kök hücrelerinin dağılımını incelemek için kullanılır.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Daha fazla video keşfet