Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Bu protokolün genel amacı, immünofloresan yoluyla yetişkin iskelet kası uydu hücrelerini tanımlamaktır. Bu yöntem, hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda kas kök hücrelerinin sayısı ve dağılımı ile ilgili temel soruları cevaplayabilir. Tekniğin temel avantajı, kas kök hücrelerinin fizyolojik ortamlarında sadece sınırlı bir manipülasyon ile tanımlanabilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Faiza Naz olacak. Başlamak için, sıvı nitrojeni bir Dewar şişesine dökerek bir sıvı nitrojen banyosu hazırlayın. Daha sonra, 20 mililitrelik plastik bir behere 10 mililitre metilbütan dökün ve beheri sıvı nitrojen banyosuna aktarın.

Disseke edilmiş tibialis anterior kasını küçük bir plastik şırınga pistonunun düz yüzeyine yerleştirin. Daha sonra, disseke edilmiş kası birkaç damla Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiği veya OCT ile örtün. Metilbütan kabını sıvı nitrojen banyosundan çıkarın, ardından bir makasın saplarını kullanarak yüzeyi çözün. OCT kaplı dokuyu hızlı bir şekilde erimiş metilbütan içine daldırın ve onu dondurun.

Daha sonra, gömülü dokuyu pistondan ayırmak ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için forseps kullanın. Ardından, mikrosantrifüj tüpünü sıvı nitrojen içinde saklayın. Kriyostat kesit almaya başlamak için, bir kriyostatın numune tutucusunun ortasına bir damla OCT bileşiği ekleyin ve kısmen katılaşmasına izin verin.

Ardından, gömülü dokuyu ayak bileği tarafı aşağı ve diz tarafı yukarı bakacak şekilde OCT bileşiğine yapıştırın. Ardından, numune tutucuyu kriyostat üzerine monte edin ve dokuyu 10 mikrometre aralıklarla kesin. Donmuş her slaytta dört ila sekiz kriyoseksiyon toplayın.

Bölümleri oda sıcaklığında üç saat kurutun, ardından slaytları bir slayt kutusunda toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ardından, slayt kutusundan bir slayt çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın. Ardından, sıvıların yandan akmasını önlemek için kriyokesitlerin etrafındaki bir alanı işaretlemek için bir sıvı engelleyici kalem kullanın.

Bir davlumbazda, işaretli alana 300 ila 500 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Bölümleri sabitlemek için slaydı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, slayttan paraformaldehiti bir slayt kabında PBS ile durulayın.

Antijen alımına başlamak için, bir slayt kabını 200 mililitre sitrat tamponu ile doldurun ve slaytı kaba aktarın. Ardından, sürgülü kabı 10 dakika boyunca yüksek basınçta bir düdüklü tencereye aktarın. Antijen alma adımı, bölümler oda sıcaklığında 30 dakika kurutulursa ve hemen devam edilirse isteğe bağlıdır.

Daha sonra antijen alma aşaması gerekli değildir. Ancak bölümler oda sıcaklığında üç saatten fazla kurutulursa ve ardından eksi 80 santigrat derecede saklanırsa, antijen alma aşaması gereklidir. Ardından, slayt kabını 10 dakika akan su altında soğutun.

Ardından slaytı 200 mililitre PBST içeren yeni bir kaba aktarın ve PBST ile durulayın. Tepsiye suya batırılmış laboratuvar mendillerini ekleyin, ardından durulanmış slaytı bir PAP kalemiyle kontrol edin ve tepsiye yerleştirin. Slayta 200 mikrolitre engelleme solüsyonu ekleyin.

Ardından tepsiyi kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bloke etme adımı çok önemlidir çünkü kullanılan Pax7 antikoru bir fare mono-klonal antikorudur. Fare üzerinde fare engelleme adımı, belirli olmayan bağlamaları azaltır.

Ardından, sürgüyü PBST ile sürgü kabında durulayın ve tepsiye geri koyun. Slayta 200 mikrolitre Primer Antikor karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, slaytı PBST ile durulayın, ardından 200 mikrolitre İkincil Antikor karışımı ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Kuluçka süresinden sonra, slaytı PBST ile durulayın. DAPI'yi bir slayt kabında seyreltin ve slaydı kapta üç dakika inkübe edin. Ardından, DAPI'yi PBST ile beş dakika durulayın.

Son olarak, sürgüyü montaj ortamıyla monte edin ve bir lamel uygulayın. Bu çalışmada, uydu hücreleri, floresan mikroskobu altında yetişkin dinlenme kas bölümlerinde başarılı bir şekilde görüntülenmiştir. Genellikle yetişkin kas dokusunda ve belirli lif türlerinde görülen arka plan gürültüsü, fare-fare engelleme kullanılarak azaltılır.

Spesifik immünostain sinyalleri, parlak Alexa boyaları ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar kullanılarak arttırılır. İki fotonlu konfokal mikroskop, geniş alanlı floresan mikroskobuna kıyasla daha keskin bir görüntü yakalar. Aynı protokol, genç farelerden, fare embriyolarından ve yaralı yetişkin kas dokularından alınan kas dokusuna da uygulanabilir.

Hem juvenil hem de embriyonik kas dokuları, daha aktif uydu hücrelerini veya nispeten daha büyük çekirdeklere sahip Pax7 miyojenik öncülerini gösterir. Böylece, genç farelerin uydu hücrelerini görselleştirmek yetişkin farelere göre daha kolay hale gelir. Yaralı kas dokusunda, daha aktif Pax7 pozitif hücreler görülebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, otofloresan ve spesifik olmayan fare-fare immüno-bağlanmasından gelen gürültünün tamamen ortadan kaldırılamayacağını, ancak bu protokolle gürültünün büyük ölçüde azaltılabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kas kriyokesitlerinde uydu hücrelerini nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.