Name: Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, izole mitokondri ve kültürlü hücrelerde mitokondrial kalsiyum akışını ölçmek için plaka okuyucu ve konfokal mikroskopi yöntemlerini. Bu protokoller kalsiyum sinyallemesi ve hastalık mekanizmaları araştırmalarında değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Amerikan Kalp Derneği (J.Q.K.) üzerinden hibe fon tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Emory Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Not: Mitokondrial Ca2 + akını bir plaka okuyucu kullanarak izole kardiyak mitokondri içinde ölçmek için deneysel işlemin ilk bölümüdür.
1. reaktifler ve çözümleri
<ol><li>MS-EGTA arabellek mitokondrial yalıtım için 500 mL olun: 225 mM mannitol, 75 mM sukroz, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA), pH 7.4 için ayarlanabilir KOH ile. 0,22 mikron filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın MS-EGTA arabellek kullanmadan önce 4 ° c önceden soğutulmuş olduğundan emin olun.</li>
	<li>100 mL KCl arabelleği hazırlamak: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 mikron EGTA ve pH 7.2 KOH ile için ayarlanabilir. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>1 mM kalsiyum Dimetil sülfoksit (DMSO) yeşil-5N stokta hazır olun. Kalsiyum yeşil-5N stok aliquotted olabilir ve -20 ° C'de depolanan</li>
	<li>
Yüzeylerde Ca2 + alımı için hazırlayın.
	<ol>
<li>1 M sodyum pyruvate, pH 7.4 hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
		<li>500 mM malat, pH 7.4 hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kardiyak mitokondri yalıtım
<ol><li>Fareyi kurumsal standartlarına göre ötenazi. Not: ötenazi için bizim kurumsal olarak onaylanmış yöntemi fareler tarafından isofluorane inhalasyon anestezi ve servikal çıkığı tarafından kurban.</li>
	<li>Kalp, göğüs boşluğu açma, kaburga iki tarafında boyunca kesme, kalp kanat, uzakta diyafram kesme ve kalp doku bilincin tarafından toplamak. Not: Bu protokol için 3-4 deneyler için yeterli olmalıdır bir yetişkin fare (yaklaşık 120 mg), toplanan bütün yürekten mitokondrial yalıtım yapılır. Karaciğer gibi diğer mitokondri bakımından zengin dokular mitokondrial izolasyonu için en çok 200 mg doku açıklanan protokol sonrası kullanılabilir.</li>
	<li>Doku buz gibi 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) tüm kan ventrikül dışarı sıkılmış sağlanması x 25 mL içinde iyice durulayın. Not: kalp dışarı sıkılmış sıvı açık çalıştığında kalbi yeterince durulanır.</li>
	<li>Kalbin buz gibi 1 x PBS keskin makas kullanarak 5 ml küçük parçalar halinde kıyma.</li>
	<li>PBS atın ve kıyılmış kalp doku 0,10-0.15 mm giriş izni önceden soğutulmuş 7 mL cam-teflon dounce homogenizer transfer.</li>
	<li>Buz gibi MS-EGTA arabellek 5 mL ekleyin ve doku parçaları artık görünür (yaklaşık 11 vuruş) kadar örnek lunaparkçı. Not: sağlam ve işler durumda mitokondri elde etmek için amaç olduğu gibi doku aşırı homojenize değil.</li>
	<li>Homogenate 15 mL tüp aktarın.</li>
	<li>Homogenate 600 x g çekirdeği ve kesilen hücreleri cips 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir taze 15 mL tüp süpernatant aktarmak ve 10.000 x g mitokondri cips için 10 dakika için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atın ve buz üzerinde mitokondrial Pelet koruyun.</li>
	<li>İki kez buz gibi MS-EGTA tampon kullanarak mitokondrial Pelet yıkayın. Her yıkama için mitokondrial Pelet MS-EGTA arabellek 5 mL resuspend, 10.000 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak.</li>
	<li>Son yıkama sonra süpernatant atın ve mitokondri buz soğuk MS-EGTA arabellek 100 μL içinde resuspend. Mitokondri buz üzerinde tutun. Not: Mitokondri deneme 1 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
	<li>Bir Bradford Protein tahlil26kullanarak mitokondrial protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
</ol>3. plaka okuyucu tabanlı ölçümü mitokondrial kalsiyum alımı
Not: Burası multimod plaka okuyucu kullanarak mitokondrial Ca2 + alımı analiz enjektörleri ile donatılmış için protokol açıklanan. Herhangi bir plaka okuyucu kalsiyum yeşil-5N Floresans okuma yeteneği ile (uyarma/emisyon 506/532 nm) enjektörleri ışıktan korunan tepki tutmak için otomatik reaktif bir Kinetik modunda kullanılabilir.
<ol><li>Program bir Kinetik gerçekleştirmek için plaka okuyucu her saniye Toplam tahlil vakit geçirmek 1.000 alınan ölçümlere ile kalsiyum yeşil-5N Floresans okumak Ayrıca s., 5 μL CaCl2 çözüm 30 dağıtmak için reaktif enjektörleri program s, 150 s, 300 s , 480 s ve 690 s zaman puan. Not: CaCl2 enjeksiyonları zamanlaması kullanıcı tanımlı olan ve deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.</li>
	<li>Reaktif enjekte edenlerin CaCl2 çözüm ile kullanılmak üzere Başbakan. Not: CaCl2 çözüm konsantrasyonu kullanıcıya özgüdür ve sonraki çalışır MPTP açılış tetiklemek için Ca2 + miktarı titre için ayarlanabilir.</li>
	<li>Mitokondri 200 μg 96 iyi plaka tek tek bir şey için ekleyin.</li>
	<li>Öyle ki toplam hacmi mitokondri ve KCl arabellek için 197 μL gelir KCl arabellek uygun hacmi kuyuya ekleyin.</li>
	<li>1 M pyruvate 1 μL ve 500 mM malat 1 μL mitokondri karışıma ekleyin. Damlalıklı hafifçe karıştırın ve mitokondri mitokondri enerjik olmak izin vermek için oda sıcaklığında 2 min için yüzeyler ile kuluçkaya için.</li>
	<li>1 mM kalsiyum yeşil-5N stokunun 1 μL ekleyin. Pipetting tarafından karışımı yavaşça. Not: tepki kalsiyum yeşil-5N boya eklenmesi aşağıdaki ışıktan korumak.</li>
	<li>Önceden programlanmış Kinetik iletişim kuralı ve monitör kalsiyum yeşil-5N Floresans başlatın.</li>
</ol>4. reaktifler ve çözümleri
Not: İkinci bölümde mitokondrial Ca2 + kültürlü hücrelerdeki confocal görüntüleme için deneysel bir işlem olduğunu.
<ol><li>Tyrode'nın çözüm (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glikoz ve 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile) olun. 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.</li>
	<li>Yıkama çözüm (100 mM potasyum asetat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0.35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM phosphocreatine, 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile) hazırlayın. 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.</li>
	<li>Permeabilization çözüm, %0,005 saponin yıkama çözüm içeren hazır olun. Taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>0 hazırlamak Ca2 + iç çözüm (100 mM potasyum asetat, 15 mM KCl, 0.35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile ayarlanır). 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.</li>
	<li>CA2 +içeren iç çözüm hazırlamak. Ücretsiz Ca2 +istenilen konsantrasyonu ulaşmak için CaCl2 iç çözüm ekleyin. Eklemek için CaCl2 miktarı MaxChelator programı (maxchelator.stanford.edu) kullanılarak hesaplanır.</li>
	<li>1 mM DMSO stokta Rhod-2/AM hazırlamak ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>1 mM MitoTracker yeşil DMSO stokta hazırlamak ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>5. kaplama hücreleri görüntüleme için
<ol><li>22 x 22 cm2 cam coverslips % 100 etanol ile yıkama ve kuru hava coverslips sağlar.</li>
	<li>Cam coverslips 6-iyi doku kültürü çanak bireysel kuyu yerleştirin. Not: Coverslips laminin, Poli-L-lizin veya hücre eki tanıtmak için benzer matrix ile kaplı olması.</li>
	<li>Trypsinize ve hücreleri görüntüleme gün üzerinde yaklaşık % 70 izdiham için amaçlayan coverslips üzerine plakası.</li>
</ol>6. yükleme hücreleri Rhod-2/AM ve MitoTracker yeşil
<ol><li>Rhod-2/AM-MitoTracker hazırlamak yeşil çalışma çözüm. 20 μL Rhod-2/AM 1 mM hisse senedi, MitoTracker yeşil 1 mM stokunun 0.2 μL ve Tyrode'nın çözüm % 20 pluronic F-127 1 ml 2.5 μL ekleyin. Rhod-2 son konsantrasyonu çalışma çözüm içinde 20 µM ve MitoTracker yeşil son konsantrasyonu 200 nM.</li>
	<li>Yavaşça büyüme medya coverslip çıkarın. Not: Bir yıkama adım boya çözüm ek önce gerekli değildir.</li>
	<li>Rhod-2/AM-MitoTracker eklemek kadar coverslip sadece coverslip üzerine dropwise bir biçimde yeşil çözüm kaplı (yaklaşık 3-4 damla coverslip başına).</li>
	<li>Işık hücreleri Boyar maddeler ile yüklemek izin vermek için korumalı oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Rhod-2/AM de-esterify. Yavaşça çıkarın Rhod-2/AM-MitoTracker yeşil çözüm, eski yerine koymak o ile taze oda sıcaklığında Tyrode'nın çözüm ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
</ol>7. mitokondrial Rhod-2/AM ve MitoTracker yeşil Floresans confocal görüntüleme
<ol><li>Coverslip odası Imaging mikroskop aktarmak ve odası yıkama çözüm ile doldurun.</li>
	<li>Faz kontrast 40 X hücrelerde gözlemlemek için Ayarlar'ın altında hücreleri görünür hale gelene kadar ve odak odak ayarlamak.</li>
	<li>
Rhod-2/AM-MitoTracker plazma zarı permeabilize yeşil boya mitokondri lokalize koruyarak sitozol lokalize Rhod-2, kaldırmak için hücreleri yüklü.
	<ol>
<li>Yıkama çözüm coverslip kaldırın.</li>
		<li>Yaklaşık 1 dak Permeabilization çözüm ile değiştirin.</li>
		<li>Görsel olarak permeabilization sürecinde plazma zarı Morfoloji izlemek. Permeabilized hücre yapısı bir yüzey gelişecektir.</li>
		<li>Permeabilization tamamlandığında, hemen Permeabilization çözümü kaldırmak ve 0 Ca2 + ile iç çözüm değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aynı anda Rhod-2 floresan (559 nm lazer çizgi ve emisyon dalga boylarında 575-675 nm arasında toplanan kullanarak uyarma) görüntü ve MitoTracker yeşil floresan (uyarma 488nm lazer çizgi ve dalga boyu arasında toplanan emisyon kullanma 505-525 nm). Permeabilized hücre Rhod-2 ve MitoTracker yeşil açık bir colocalization görüntüleme odaklanın.</li>
	<li>Mikroskop lazer azaltmak ve mitokondrial Rhod-2 floresan loş ve sadece görünür olacak ayarları kazanç.</li>
	<li>Belirli bir uygulama için bir uygun çerçeve oranı ve saat ders 2-boyutlu taramalar elde etmek için mikroskop ayarları'nı seçin. En az 30 kare/s kare hızı doğru değişimler mitokondrial Ca2 +Kinetik yakalamak için önerilir.</li>
	<li>0 Ca2 + iç çözüm hücreleri ya da mikroskop odak bozmadan kaldırın.</li>
	<li>Resim alma başlatın.</li>
	<li>CA2 +Ekle-10 s zaman dolu iç çözüm noktası el ile veya bir perfüzyon sistemi ile.</li>
	<li>Faiz (ROIs colocalization arasında mitokondrial Rhod-2 ve MitoTracker yeşil sinyal görüntü edinme yazılımında bölgelerinde kapsayacak şekilde) bölgeleri seçin. Not: Rasgele floresan (F) değerleri kayıt her zaman için her yatırım Getirisi için elde edilir. Bu değerler çıkartılır ve (önce Ca2 + ek; ilk floresan için normalleştirilmiş arka plan F0) ve veri sunumu ve genlik değişikliğinin mitokondrial Ca2 +miktar için zaman içinde F/F0 çizilen.</li>
</ol>

<ol><li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li>
<li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li>
<li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart%3A+energetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li>
<li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li>
<li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium%3A+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li>
<li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2%2B+trigger+site%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li>
<li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li>
<li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li>
<li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger+is+essential+for+Ca2%2B+homeostasis+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li>
<li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li>
<li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li>
<li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li>
<li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document%3A+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li>
<li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li>
<li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59(2016).</li>
<li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li>
<li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca%282%2B%29+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li>
<li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li>
<li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141(2010).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li>
<li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li>
<li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bradford+method+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li>
<li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2%2B+uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamaları rapor var.

Burada, mitokondrial Ca2 + akını ölçmek için iki farklı yaklaşımlar açıklayın. Plaka okuyucu tabanlı kalsiyum yeşil-5N yöntemi monitörler extramitochondrial Ca2 + düzeyleri ve izole mitokondri ölçümlerde için de uygun olan bir Ca2 + alımı tahlil olduğunu. Biz izole fare kardiyak mitokondri temsilcisi sonuçlar göstermiştir, bu tahlil dokulardan karaciğer, kas iskelet ve beyin de dahil olmak üzere yüksek mitokondrial bereket ile izole mitokondri için kolayca adapte olabilir. Ayrıca, plaka o...

Mitokondri intrasellüler Ca2 + depolama ve sinyal kritik siteler vardır. Onlarca yıllık araştırma mitokondri yeteneği alma ve Ca2 + 1,2çekilmek zorunda gösterdi. Mitokondri, ancak, Ca2 + depolama sadece pasif siteler değildir. CA2 + mitokondrial yuvası, metabolik çıkış düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel sinyal işlevleri gerçekleştirir ve olmuştur harekete geçirmek-in mitokondrial aracılı hücre ölüm yolları, daha önce3gözden. Metabolik regülasyon için Ca2 + üç matris lokalize dehydrogenases tricarboxylic asit döngüsü hem de solunum zinciri kompleksleri, mitokondrial enerji üretim4,5 artırmak için etkinliğini artırır . Mitokondrial Ca2 + aşırı yük ve mitokondrial Ca işleme2 + dysregulated ile Ca2 + Tetikleyicileri mitokondrial geçirgenliği geçiş (MPTP) açılış, mitokondriyal iç zar permeabilization için önde gelen gözenek, membran potansiyel kaybı, şişme, mitokondrial disfonksiyon rüptürü ve sonuçta, hücre ölüm6,7,8,9. Böylece, mitokondrial Ca2 + sinyal doğrudan hücresel yaşam ve ölüm yolları metabolik kontrol ve MPTP-ölüm eksen etkiler.
Son yıllarda, orada hızla mitokondrial Ca2 + dinamikleri nedeniyle çalışmanın ilgi genişleyen büyük kısmı mitokondrial Ca2 + uniporter karmaşık moleküler bileşenlerin tanımlaması için mitokondri iç bir baş tarz-in Ca2 + şey zar ışınlama mitokondrial matris 10,11,12alın. Bu yapısal ve düzenleyici alt birimleri uniporter, tanımlaması ileri genetik olarak mitokondriyal Ca2 + akını mitokondriyal işlev ve fonksiyon bozukluğu modüle için hedefleme olasılığı getirdi ve çalışma kolaylaştırdı uniporter karmaşık ve mitokondrial Ca2 + akını hastalığı13,14,15' e katkı. Nitekim, mitokondrial Ca2 + sinyal hastalıkları kalp hastalığı ateş ve kanser16,17,18kadar çeşitli bir dizi patolojiler de karıştığı olmuştur, 19,20.
Temel metabolizması ve hücre ölümüne içinde sinyal mitokondrial Ca2 + önemi göz önüne alındığında ve biyolojik sistemleri geniş ulaşmak ile kombine o mitokondrial Ca2 + sinyal etkiler, mitokondrial Ca2 + değerlendirmek için yöntemleri akın büyük ilgi vardır. Doğal olarak, çeşitli teknikler ve araçlar mitokondrial Ca2 + ölçmek için geliştirilmiştir. Bu alet öyle aynı derecede floresan Ca2 +kullanmak yöntemleri içerir-hassas boyalar21,22 ve mitokondri cameleon ve aequorin23, gibi hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörler 24. Bu makalede, farklı yöntemler ve mitokondrial Ca2 + alımı ölçülebilir sistemleri modellemek vurgulamak için hedeftir. Biz mitokondrial Ca2 + akını kapasitesini değerlendirmek için iki deneysel yöntem mevcut. Kardiyak mitokondri örnek olarak kullanarak, bir plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı mitokondrial Ca2 + ölçmek için Ca2 + hassas kullanarak alımı boya kalsiyum yeşil-5N izole doku mitokondri14 için idealdir . Kültürlü NIH 3T3 hücreleri kullanarak, Ayrıca görüntüleme tabanlı bir confocal mikroskobu tahlil mitokondrial Ca2 + permeabilized hücrelerdeki Ca2 + hassas boya Rhod-2/AM25kullanarak ölçüm için açıklar.

<table><tbody><tr><td>Olympus FV1000 Lazer Taramalı konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Enjektörlü çok modlu mikroplaka okuyucu</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Homojenizatörü</td><td>Kimble</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm lameller</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyu plakası</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Yeşili-5N</td><td>Canlandırıcı</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker yeşil FM</td><td>Canlandırıcı</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2,</td><td>Canlandırıcı</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Canlandırıcı</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Canlandırıcı</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>L-malik asit</td><td>Sigma</td><td>M1125</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum asetat</td><td>Fisher</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5 asal; -trifosfat magnezyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatin disodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>Calbiochem</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondri tarafından işleme Ca2 + hücreleri geniş bir yelpazede fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerinde düzenleyen bir kritik işlevdir. Yeteneği doğru akın ve sızma Ca2 + mitokondri üzerinden ölçmek için bu işlemlerde işleme mitokondrial Ca2 + rolünü belirlemek için önemlidir. Bu rapor halinde mitokondrial Ca2 + işleme izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için iki yöntem sunar. Biz ilk Ca2 + hassas boya kalsiyum yeşil-5N kullanarak mitokondrial Ca2 + alımı ölçmek için plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı. Plaka okuyucu tabanlı biçimi özel ekipman ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve kalsiyum yeşil-5N boya Ca2 + izole doku mitokondri üzerinden ölçmek için idealdir. Bizim uygulamamız için ölçüm mitokondrial Ca2 + Alım fare kalp dokusundan izole mitokondri içinde açıklar; Ancak, bu yordamı diğer doku karaciğer, kas iskelet ve beyin gibi gelen izole mitokondri mitokondrial Ca2 + anlamazdın ölçmek için uygulanır. İkinci olarak, biz bir confocal mikroskobu tabanlı tahlil mitokondrial Ca2 + Ca2 + hassas boya Rhod-2/AM kullanarak ve 2 boyutlu lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleme permeabilized hücrelerdeki ölçüm için tanımlamak. Bu permeabilization Protokolü sitozolik boya kirlenme, mitokondrial Ca2 +değişikliklerin belirli kayıt için izin ortadan kaldırır. Ayrıca, lazer tarama mikroskobu yüksek kare hızları mitokondrial Ca2 + çeşitli ilaçlar veya dış çözümde uygulanan reaktifler yanıt olarak hızlı değişimlerin yakalamak için izin verir. Bu iletişim kuralı mitokondrial Ca2 + anlamazdın kardiyak miyositler ve nöronlar ve ölümsüzleştirdi hücre hatları gibi Primer hücre de dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ölçmek için uygulanır.

Şekil 1 gösterir mitokondrial Ca2 + alımı ölçümleri plaka okuyucu tabanlı platformu kullanarak izole kardiyak mitokondri içinde ve Ca2 + boya kalsiyum yeşil-5N. Denetim koşullarda (şekil 1A), kardiyak mitokondri kalsiyum yeşil-5N içeren KCl arabellekte askıya ve 30'eklendi CaCl2 (0.6 mm CaCl2 çözüm 5 μL) ve ardışık darbeleri ile meydan s, 150 s, 300 s, 480 s ve 690 s zaman puan. Zamanla...

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş mitokondri ve kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum akışını ölçmektir. Bu yöntem, mitokondrinin sitozolik kalsiyum manzarasını şekillendirmeye nasıl yardımcı olduğu ve hastalık koşullarında mitokondriyal kalsiyum dinamiklerinin rolü gibi kalsiyum sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protokollerimizin mitokondriyal kalsiyum akış kapasitesini değerlendirmek için çeşitli model sistemlere uyarlanabilmesidir.Plaka okuyucu bazlı mitokondriyal kalsiyum alım prosedürünü göstereceğim. Pediatri Bölümü'nde öğretim görevlisi olan Dr. Joshua Maxwell, mitokondriyal kalsiyum akışını ölçmek için konfokal mikroskop tabanlı prosedürü gösterecek. Bu deneye, önceden izole edilmiş kalbi 25 mililitre buz gibi soğuk one-X PBS'de iyice durulayarak başlayın ve kanın ventriküllerden tamamen sıkıldığından emin olun.Beş mililitre buz gibi soğuk one-X PBS'de, bir çift keskin makas kullanarak, kalp dokusunu küçük parçalara ayırın. PBS'yi dikkatlice atın ve dokuyu önceden soğutulmuş yedi mililitrelik bir cam Teflon Dounce homojenizatöre aktarın. Ardından, beş mililitre buz gibi MSEGTA tamponu ekleyin

analyses-mitochondrial-calcium-influx-isolated-mitochondria-cultured

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu videoda, izole mitokondride mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için plaka okuyucu tabanlı bir test açıklanmaktadır. Tahlil, mitokondriyal kalsiyum alımının ve aşırı kalsiyum yükünün kinetiğini incelemek için kalsiyuma duyarlı bir floresan boyanın floresan sinyalini analiz eder.

Mitokondriyal Kalsiyum Alım Testi: İzole Mitokondride Kalsiyum Alımını Ölçmek İçin Plaka Okuyucu Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Bu video, mitokondri alımı kalsiyum olarak floresandaki gerçek zamanlı değişiklikleri izleyerek mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini değerlendirme prosedürünü göstermektedir. Bu test, apoptoz ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyon ve kalsiyumla ilgili süreçleri incelemek için yararlıdır.

İzole Mitokondrinin Kalsiyum Tutma Kapasitesinin Belirlenmesi

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.

Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Öğrenin, izole mitokondri ve kültürlü hücrelerde mitokondrial kalsiyum akışını ölçmek için plaka okuyucu ve konfokal mikroskopi yöntemlerini. Bu protokoller kalsiyum sinyallemesi ve hastalık mekanizmaları araştırmalarında değerlidir.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Daha fazla video keşfet