Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti

Bu prosedürün genel amacı, turunçgil yaprağı dokusunda turunçgil yeşillendirme patojeni Candidatus liberibacter spp.'yi doğru bir şekilde tespit etmektir. Bu yöntem, narenciye çiftçilerinin ve araştırmacıların, turunçgillerin yeşillenmesine neden olan patojenin varlığını hızlı ve doğru bir şekilde belirlemelerini sağlar.

Gösterme prosedürü, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Ian Palmer olacak. Bu yöntem verimli, uygun maliyetli ve kantitatif analiz için uyarlanabilir. Ek olarak, minimum düzeyde laboratuvar deneyimi ve ekipmanı ile gerçekleştirilebilir.

Önce bir narenciye ağacından bütün taze bir yaprağı kesmek için temiz makas kullanın ve temiz bir plastik sandviç torbasına koyun. Daha sonra bir havan ve havan tokmağını az miktarda sıvı nitrojen ekleyerek soğutun. Daha sonra, yaprak dokusunun yaklaşık bir inç kare boyutunda küçük parçalarını kesmek için makası kullanın.

Yaprak parçalarını hemen dondurmak için harcın içine koyun. Sıvı nitrojen buharlaşana ve ince yeşil bir toz kalana kadar yaprak dokusunu harçla hızlı bir şekilde öğütmeye başlayın. Daha sonra metal bir spatulayı sıvı nitrojen içinde 10 ila 15 saniye soğutun.

Ardından, 1.5 ML'lik bir mikro santrifüj tüpünde harçtan zemin dokusunu almak için soğuk spatulayı kullanın. Numuneye 600 ML çekirdek lizis çözeltisi eklemek için 1000 ML'lik bir pipet kullanın. Ardından numuneyi bir ila üç saniye girdaplayın.

Tüpü 65 santigrat derecede, 15 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Kuluçka süresi sona erdiğinde, RNA'yı çıkarmak için likata 3 ML RNA çözeltisi eklemek için 10 ML'lik bir pipet kullanın. Daha sonra tüpün içeriğini iki ila beş kez ters çevirerek karıştırın.

Bir kabin inkübatörde 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 15 dakika sonra numuneye 200 ML protein çökeltme çözeltisi ekleyin. Tüpü 20 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın.

Daha sonra numuneyi 13000G'de üç dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, oda sıcaklığında tutulan 600 ML izopropanol ilave edilerek yeni bir 1.5 ML mikro santrifüj tüpüne eklenmiştir. Santrifüjleme bittikten sonra, süpernatanı santrifüj tüpünden izopropanol içeren tüpe dikkatlice çıkarın.

Peleti atın. DNA'nın iplik gibi bir iplik gibi görünür olması için tüpü ters çevirin. Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 13000G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra süpernatanı boşaltın. Ardından pelete 600 ML %70 etanol ekleyin. Peleti yıkamak için tüpü birkaç kez ters çevirin.

Tüpü 13000G'de bir dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme bittikten sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin. Ardından, 15 dakika boyunca havada kuruması için kapağı açık olarak tüpü emici bir kağıt üzerinde ters çevirin.

Kuruduktan sonra, pelete 100 ML DNA yeniden hidrasyon çözeltisi ekleyin. DNA süspansiyonunu 65 santigrat derecede bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin. Karıştırırken tüpü periyodik olarak vurun.

Bir mikro küvete 1 ML arıtılmış su ekleyin. Suyu spektrofotometrede boş olarak okuyun. Daha sonra numunenin 1 ML'sini mikro küvete ekleyin.

Mikro küveti spektrofotometre üzerine yerleştirin ve DNA konsantrasyonunu elde edin. 50 ML'lik bir PCR tüpüne tüm reaktifleri ve 100 nanogram genomik DNA'yı ekleyerek PCR reaksiyonunu oluşturun. Tüpü hafifçe vurarak reaktifleri karıştırın ve ardından hızlı bir santrifüjleme yapın.

PCR tüpünü termo-döngüleyiciye yerleştirin ve programı çalıştırın. Agaroz jeli hazırlamak için 0.4 gram agaroz tozu tartın. Daha sonra agaroz tozunu 200 ML'lik bir Erlenmeyer şişesine ekleyin ve hacmi 1X TAE tamponu ile 50 ML'ye ayarlayın.

Agaroz karışımını yaklaşık 1,5 dakika yüksekte mikrodalgada pişirin. Agaroz tamamen eriyene kadar her 30 saniyede bir çalkalayın. Daha sonra sıvı agaroza mililitre etidyum bromür başına 2.5 ml 10 miligram ekleyin.

Daha sonra etidyum bromürü karıştırmak için şişeyi sallayın ve sıvı agaroz jeli hızlı bir şekilde düz bir jel kalıba dökün. Hemen standart bir 12 dişli jel tarağı yerleştirin. Jeli oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika soğumaya bırakın ve ardından jel tarağı çıkarın.

Şimdi katılaşmış jeli 1X TAE tamponu ile doldurulmuş elektroforez ünitesine yerleştirin. Toplam amplifiye edilmiş DNA örneğini ve 5 ML DNA'yı daha sonra jel üzerindeki ayrı kuyucuklara yükleyin. Elektroforez ünitesini 35 dakika boyunca sabit 90 voltta başlatın.

Ardından jeli elektroforez ünitesinden çıkarın. Ardından jeli bir UV aydınlatıcıya yerleştirin. 302 nanometrede transilluminatördeki jel bantlama desenlerinin fotoğraflarını çekin.

Yeşillenen bakteriyi tanımlamak için, hem enfekte olmuş hem de enfekte olmamış numunelerden elde edilen PCR amplifiye genomik DNA'lar elektroforeze edilir. Jelde, 500 baz çiftine karşılık gelen bu bantlar, CL asiaticas bakterisinde Las16S ribozomal DNA'nın belirli bir bölgesinin varlığını gösterir. 700 baz çiftine karşılık gelen bu bantlar, LAA2/LAJ5'in varlığını gösterir ve bakteride 16S ribozomal beta operon DNA dizisinde bulunur.

400 baz çiftindeki bu farklı bantlar, yalnızca dahili amplifikasyon kontrolüne atıfta bulunan turunçgil F-box geninin amplifikasyonunu gösterir. Sonuçlarımızın geçerli olduğunu kabul etmek için bu bandın varlığı gereklidir. Buna karşılık, sadece 400 baz çiftinde bir bandın varlığı, 500 ve 700 baz çiftinde ise diğer bantların olmaması sağlıklı bir turunçgil dokusuna işaret eder.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedür, mevcut patojen miktarını tespit etmek için RTQPCR gibi daha kantitatif yöntemlerin performansına izin verecek şekilde uyarlanabilir.