Name: Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin narenciye yaprak dokusunda Candidatus liberibacter spp. tespiti için geleneksel PCR yöntemini. Bu hızlı ve uygun maliyetli teknik, çiftçilerin ve araştırmacıların hastalığı doğru şekilde tanımlamasına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kavramsallaştırma, HC ve Z. s. F.; Soruşturma, H. C., J. C ve Z. s. F; Kaynaklar, Z. s. F.; Yazma - orijinal taslak, ı. A. s.; Yazma-İnceleme ve düzenleme, ı. A. s., J. C., H. C., S. L. T. ve Z. s. F.; Görselleştirme, H. C.; Gözetim, Z. s. F.; Satın alma, Z. s. F ve F. s. L. finansman
Bir South Carolina iyileştirilmesi öğretmen kalitesi yüksek öğrenim durumu başlıklı Grant tarafından desteklenen proje, artırılması orta sınıflarda Bilim Öğretmenler bilgi bitki işlemleri, yapıları ve işlevleri ile nişan bitki Bilimleri Araştırma (bitki Bilim)
Birleşik Sates Department of Education tarafından (CFDA numarası 84.367B) ödül fonları
Yazarlar Dr Nian Wang Florida Üniversitesi genomik DNA örnekleri sunan için teşekkür etmek istiyorum Citrus sinensis Valencia bulaşmış.

1. bitki doku genomik ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA izole
<ol><li>Bütün taze temiz makas kullanarak bir narenciye ağaçtan yaprak ve yaprak temiz plastik sandviç torbaya koyun kesme narenciye yaprak dokusu elde. Not: yaprak dokusu içeren torba 4 ° C buzdolabı veya buz izole edilmiş bir kap içinde bozulma önlemek için en kısa zamanda toplandıktan sonra yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Bir harç ve havaneli chill için sıvı azot az miktarda ekleyin. Onlar soğutma, yaprak dokusu, yaklaşık 1 kare inç boyutunda küçük bir parça kesmek için makas kullanın. Kesme doku anında dondurmak için havanda yerleştirin. Daha fazla sıvı azot, gerekirse ekleyin. Not: İzoleli eldiven her zaman sıvı azot taşıma sırasında giyilmelidir.</li>
	<li>Hızlı bitki doku harçla ince bir toz eziyet. Tamamen sıvı azot buharlaşır ve ince yeşil toz kalır kadar taşlama devam edin.</li>
	<li>Kısa bir süre için 10-15 s sıvı azot metal bir spatula chill sonra zemin dokusu içinde harç spatula kullanarak 1.5 mL microcentrifuge tüp kepçe.</li>
	<li>600 µL çekirdeği lizis çözüm Ekle 1000 µL pipet (bakınız Tablo reçetesi) kullanarak ve girdap örnek için 1-3 s, daha sonra kuluçkaya 15dk için 65 ° C su banyosunda.</li>
	<li>10µL pipet lysate kullanmaya RNase çözüm 3 µL ekleyin, tüp 2 - 5 kez karıştırın ve bir kabine kuluçka 15dk için 37 ° C'de kuluçkaya için ters çevir. Not: devam etmeden önce oda sıcaklığında soğumaya karışım izin verin.</li>
	<li>200 µL Protein yağış çözüm, girdap 20 s için yüksek hızlı, sonra 3 dk santrifüj adlı bir firma Pelet oluşturmak için 13.000 x g de ekleyin. Örnek centrifuged iken, oda sıcaklığında isopropanol 600 µL taze 1.5 mL microcentrifuge tüp ekleyin.</li>
	<li>1000 µL pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde süpernatant isopropanol içeren taze 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarma centrifuged örnekten çıkarın. Pelet şimdi atılabilir. Not: süpernatant protein ile Pelet yukarıda süpernatant minik bir miktar terk ederek bulaşıcı kaçının.</li>
	<li>DNA iplik benzeri lifler bir kitle görünür hale gelinceye kadar tüpü ters çevir, sonra oda sıcaklığında 1 dk. için 13.000 x g, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak, 600 µL % 70 etanol için Pelet eklemek, tüp birkaç kez DNA yıkama ve 13.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi için ters çevir.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde gevşek DNA Pelet bırakarak etanol, Aspire edin sonra açın ve emici kağıt üzerine istirahat Tüp, tersine çevirin. Hava kuru 15 dakika oda sıcaklığında.</li>
	<li>DNA rehidrasyon çözeltinin 100 µL kurutulmuş DNA Pelet ekleyin, sonra düzenli olarak tüp dokunarak karıştırma sırasında bir 65 ° C su banyosu için 1 h, DNA'da kuluçkaya.</li>
	<li>Arıtılmış su 1 µL bir microcuvette ve boş kullanılmak üzere bir spektrofotometre içine yerleştirin. Örnek 1 µL microcuvette koyup spektrofotometre ekleme DNA mevcut konsantrasyonu hesaplayın. DNA toplama (ng/µL) (bir260-320) olarak hesaplanan × seyreltme faktörü × 50 ng/µL olabilir. Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnek 4 ° C'de depolanan</li>
</ol>2. PCR genomik DNA örnekleri üzerinde gerçekleştirin
<ol><li>Birleştirmek 10 µL 2 x PCR Master Mix ( malzemelerin tabloyabakın), 1 µL ileri astar (10 pM/µL), 1 µL ters astar (10 pM/µL) (bkz Tablo 2 . astar dizileri için) 100 ng genomik DNA örneğinden ayıklanmış ve arıtılmış su (ilâ 20 µL son hacim) bir 50 µL PCR Tüp, flick karıştırın ve kısaca santrifüj.</li>
	<li>PCR tüp thermocycler eklediğinizde ve buna göre (bkz. Tablo 1). Not: Protokol burada duraklatılmış. Reaksiyon tamamlandıktan sonra gerekirse, örnek 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. bir özel jel güçlendirilmiş DNA'da electrophorese
<ol><li>0.4 g özel toz tartmak ve temiz 200 mL Erlenmeyer flask, ilâ 50 mL dolum için 1 x TAE arabellek ile birlikte ekleyin.</li>
	<li>Mikrodalga 1,5 dk her 30 sallayarak, yüksek s, özel tamamen eriyene kadar. Not: Yanık önlemek için sıvı özel taşıma sırasında İzoleli eldiven giyilmelidir.</li>
	<li>10 mg/mL arasında etidyum bromür 2.5 µL sıvı özel ve shake karıştırın ekleyin, sonra bir seviye jel kalıp içine sıvı özel jel dökmek. Hızlı bir şekilde standart 12-diş jeli tarak dökme sonra ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 20 dakika serin, daha sonra jel tarak kaldırmak jel izin ve jel ile 1 x TAE tampon dolu bir düzey jel kutusu içine yerleştirin.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, toplam güçlendirilmiş DNA örnekleri kuyu yükleyin. 5 µL DNA örneklerini ayrı bir kuyudan içinde merdiven ( Tablo malzemelerigörmek) ekleyin.</li>
	<li>Örnekleri için bir sabit 90 V, 35 dk. electrophorese sonra jel çıkarın ve bir UV transilluminator yerleştirin.</li>
	<li>Fotoğrafını çekip 302 UV transillumination kullanırken deseni bantlama jel analiz nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu ve Zheng Qing Fu hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Tüm adımları tam olarak en iyi deneysel koşullar elde etmek için takip çok önemlidir. Bütün yaprak dokusu bu gösteri sırasında kullanılan; Ancak, protokol teorik olarak her türlü bitki doku eklemek için değiştirilebilir. Daha önce araştırmacılar, bütün yaprak doku yerine yaprak damar dokusu, genomik DNA elde ve benzer sonuçlar11elde. Narenciye FBOX gene ile karşılık gelen grup görünmesini başarısız olursa, sonuç geçersiz olur ve bir veya daha fazla çalışma yordamdaki bazı teknik hatalar o...

Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye ağaçları önemli bir kaybına neden oldu. Florida, bir % 70 azalma Florida portakal kutu üretiminde 244 milyon kutularından 1997-1998 sezonunda 70 milyon kutularına aynı derecede-in 2016-2017 sezon1neden olduğu hastalık nerede tahmini bir temsilcisi durumdur. Florida narenciye ağaçları % 90'ı enfekte2var ve bu Florida narenciye sanayi neyin narenciye greening3önemli rol oynar, narenciye hastalıklar nedeniyle her yıl yaklaşık bir milyar dolar kaybeder tahmin edilmektedir. Narenciye greening öncelikle invaziv Asya narenciye psyllid tarafından Diaphorina citri, yaymak ama da virüslü dokusunun. aşılama tarafından yayılır Damarlar, asimetrik sarı yaprak distrofileri, erken yapraksızlaşma, dal dieback, kök çürümesi ve ölüm bitki sarılık hastalığı neden olur. Önemlisi, hastalık nadiren meyve üreten çiçek Sezon dışında üretmek için narenciye bitki neden olur. Virüslü narenciye bitkiler tarafından üretilen meyve olgunlaşmamış, yeşil ve acı4tatma.
Bu yöntemin amacı doğru olduğunu ve tam olarak hareketli bakteri olan liberibacter spp., narenciye greening virüslü narenciye ağaçları5phloem içinde yaşayan, hastalığının tanımlar. Genomik DNA canlı bakteri içeren bütün yaprak dokudan elde edilir. Bu ayıklanan genomik DNA'yı nerede oligonucleotides bakteri'nın 16S rDNA dizisine tamamlayıcı bu dizi yükseltmek için kullanılan geleneksel PCR için şablon olarak kullanılır. Oligonucleotides bir narenciye FBOX gen için tamamlayıcı bir iç amplifikasyon denetimi olarak kullanılır. Bu yöntemi kullanmak seçtik çünkü önceki araştırma6' başarılı olmak için kanıtlanmış oldu.
Bu yöntem basit, nispeten ucuz ve herhangi bir normal donanımlı Biyokimya Laboratuarı'nda gerçekleştirilen mümkün olmanın avantaj vardır. Buna ek olarak, PCR Bu patojen7ve patojen'ın yeteneği hayatta kalmak ve yıl için asemptomatik ana bilgisayar8içinde yeniden zorluğu nedeniyle bu patojen tespit için en doğru ve kesin yöntem kalır. Birçok farklı uzmanlık PCR deneyleri başarılı bir şekilde bu patojen tespit etmek için kullanılmıştır; Ancak, geleneksel PCR basit tahlil için doğru ve belirli algılama, özellikle asemptomatik ana bilgisayarlar8içinde kalır.

<table><tbody><tr><td>Sihirbaz Genomik DNA Saflaştırma Kiti</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Çekirdek Lizisi, RNaz, Protein Çökeltme ve DNA Rehidrasyon Çözeltileri</td></tr><tr><td>Kaynağı Sıvı nitrojen</td><td>Hava Ürünleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro kontrol panelli</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Mikrodalga</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 masa üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 dijital su banyosu</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Metal spatula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td> Harç ve havaneli Sigma-Aldrich Z247464 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSE Vorteks Karıştırıcı</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Steril 10 & mu; L uçlar</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Steril 200 & mu; L uçlar</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1250 & mu; L uçları</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Değişken Hacimli Pipet Kiti</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; küvet</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>İstiflenebilir döküm tepsisi ve taraklar</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Temel Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Hücre GT Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biyospektrometre temel</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tüpleri</td><td>Fisher bilimsel</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Yeşil PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>İleri Astar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ters Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Su, PCR sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Jel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA merdiveni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

belirli ve narenciye greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel pcr narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Narenciye greening, olarak da bilinen huanglongbing, narenciye çiftlikleri küresel ravaging yıkıcı bir narenciye hastalıktır. Bu hastalık asimetrik sarı yaprak distrofileri, damar sararma, yapraksızlaşma, kök çürümesi ve sonuçta, narenciye bitkinin ölümüne neden olur. Ne zaman bulaştırmak, narenciye bitki büyüme bodur ve çiçek sezon dışı üretmek. Bu çiçekler, nadiren meyve verim ve bu da küçük, sert, düzensiz şekilli Narenciye meyve bu verim tercih edilmez. Bu hastalık Asya narenciye psyllid, Diaphorina citri ve virüslü narenciye dokusunun aşılama tarafından yayılır. Patojen narenciye bitki içinde bir uzun ve değişken kuluçka dönemi vardır — bazen belirtiler ortaya çıkmadan önce yıl. Bu patojen vitro kültür girişimlerini muhtemelen düşük nedeniyle başarısız oldu ve düzensiz konsantrasyon patojenin içinde narenciye doku enfekte veya çevre çoğaltmak zor olduğundan büyümesine elverişli koşullar patojen. Bu, onun uzun bir kuluçka dönemi ve araştırmacıların patojen kültür yetersizlik nedeniyle yayıldı önce hastalık tespit etmek çok zordur. Sonuç olarak, hastalık sadece aniden bir narenciye çiftçinin tüm verim yok sonra ortaya çıkıyor. Burada sunulan narenciye greening patojen olan liberibacter spp. genomik DNA ekstraksiyon kiti ve PCR kullanarak doğru ve belirli algılanması için bir yöntemdir. Bu yöntem basit, verimli, uygun maliyetli ve kantitatif analiz için uyarlanabilir. Bu yöntem narenciye herhangi bir doku kullanmak için adapte edilebilir; Ancak, bu potansiyel olarak patojen dokuda mevcut miktarı ile sınırlıdır. Yine de, bu yöntem daha önce virüslü narenciye bitki tanımlamak narenciye çiftçilerin izin ve daha da yayılabilir önce yıkıcı bu hastalığın yayılmasını engellemek.

500'e karşılık gelen ayrı bir grup olumlu bir sonuç üretir olan Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, ve/veya 700 için karşılık gelen ayrı bir grup için bp bp Laa2/Laj5, 16S ribozomal β bir INSERT için operon9. İç amplifikasyon kontrol grubu da 400 görünmelidir bp. Bu grup narenciye FBOX gene10amplifikasyon için karşılık gelen ve bir sonuç geçerli kabul edilmesi görünmesi ger...

Narenciye Greening narenciye bitkileri genel olarak etkileyen özellikle yıkıcı bir hastalıktır. Burada sunulan basit bir yöntem PCR ve narenciye yaprak doku genomik DNA ekstraksiyon narenciye greening patojen olan liberibacter spp. doğru ve kesin tanımlaması için kullanıyor

Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Bu prosedürün genel amacı, turunçgil yaprağı dokusunda turunçgil yeşillendirme patojeni Candidatus liberibacter spp.'yi doğru bir şekilde tespit etmektir. Bu yöntem, narenciye çiftçilerinin ve araştırmacıların, turunçgillerin yeşillenmesine neden olan patojenin varlığını hızlı ve doğru bir şekilde belirlemelerini sağlar.Gösterme prosedürü, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Ian Palmer olacak. Bu yöntem verimli, uygun maliyetli ve kantitatif analiz için uyarlanabilir. Ek olarak, minimum düzeyde laboratuvar deneyimi ve ekipmanı ile gerçekleştirilebilir.Önce bir narenciye ağacından bütün taze bir yaprağı kesmek için temiz makas kullanın ve temiz bir plastik sandviç torbasına koyun. Daha sonra bir havan ve havan tokmağını az miktarda sıvı nitrojen ekleyerek soğutun. Daha sonra, yaprak dokusunun yaklaşık bir inç kare boyutunda küçük parçalarını kesmek için makası kullanın.Yaprak parçalarını hemen dondurmak için harcın içine koyun. Sıvı nitrojen buharlaşana ve ince yeşil bir toz kalana kadar yaprak dokusunu harçla hızlı bir şekilde öğütmeye başlayın. Daha sonra metal bir spatulayı sıvı nitrojen içinde 10 ila 15 saniye soğutun.Ardından, 1.5 ML'lik bir mikro santrifüj tüpünd

specific-accurate-detection-citrus-greening-pathogen-candidatus

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Kaynak: Gulla, S. ve diğerleri. Çoklu lokus değişken sayı Tandem tekrarı Balık patojenik bakteri Yersinia ruckeri'nin Multiplex PCR ve Kapiller Elektroforez ile analizi. J. Vis. Exp. (2019).Bu protokol, izole kolonileri ultra saf suda askıya alarak ve hücreleri lizlemek için ısı uygulayarak Yersinia ruckeri'den genomik DNA çıkarır. Santrifüjleme, DNA içeren süpernatantı hücre kalıntılarından ayırır ve PCR tabanlı genotipleme ve epidemiyolojik analiz için uygun şablon DNA elde eder.

Patojenik Bakterilerle Enfekte Bitki Yaprak Dokusundan Genomik DNA Çıkarılması

Kaynak: Chen, H. ve diğerleri. Narenciye Yeşilleştirici Pathogen Candidatus liberibacter spp.'nin Geleneksel PCR kullanılarak narenciye yaprağı dokusu örneklerinde spesifik ve doğru tespiti. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, patojenik bir bakteriyle enfekte edilmiş narenciye yaprağı dokusundan toplam genomik DNA'nın çıkarılmasını gösteriyor. Protokol, floem sınırlı patojenin PCR tabanlı tespiti için güvenilir DNA geri kazanımı sağlar.

Bakteriyel Enfeksiyonun Tespiti İçin Yapraklardan Toplam DNA Çıkarılması

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Bitki patojenleri yerinde, özellikle toprak kaynaklı patojenler, hızlı ve doğru tespiti daha fazla inoculum üretim ve alanında bitki hastalıklarının yayılması önlemek için çok önemli olduğunu. Burada bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanılarak geliştirilen yöntem yerinde tanı alan koşullarında sağlar.

Toprak kaynaklı Phytopathogens bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak yerinde moleküler tespiti

Bu kağıt için döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) teknolojisini temel alan Bemisia tabaci hızlı kimlik tahlil için protokol bildirir. En az laboratuvar eğitim gerektirir ve bu nedenle, Tesis içi giriş bitki ithalat liman ve Havaalanı gibi noktalarda uygulanabilir iletişim kuralı.

Bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) tahlil hızlı teşhis edilmesi için kullanılan Bemisia tabaci

Tarlada veya laboratuvarda analiz edilebilen döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi ile birleşen bir filtre kağıdı DNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak su kaynaklarında Fitophthora capsici zoosporları tespit etmek için bir yöntem geliştirdik.

Loop Aracılı İzofenel Amplifikasyon Kullanarak Sulama Suyunda Fitophthora Capsici'nin Saptanması

Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

Floem bakımından zengin kabuklu narenciye tomurcuk ağacı dokularını hızla işleyen bir alet tasarladık, ürettik ve onayladık. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı (BTE), numune verimini artırdı ve gerekli işçilik ve ekipman maliyetlerini azalttı.

Narenciye tomurcuk ağacı işlemenin, cihaz mühendisliği yoluyla aşağı akış patojen tespiti için otomatikleştirilmesi

Bu el yazmasında, moleküllerin bakterilere (Candidatus Liberibacter asiaticus) veya böcek vektörüne (Diaphorina citri, Kuwayama) karşı etkinliğini taramak için yeni bir doğrudan bitki infüzyon cihazı tanımlanmaktadır.

Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı

Bu protokolde, istilacı bitki patojeni Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropikal ırk 4'ün tespiti için kombine bir rekombinaz polimeraz amplifikasyonu CRISPR/Cas12a testi gösterilmektedir.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropikal Irk 4'ün Tespiti için Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu CRISPR/Cas12a Testi

Burada, amplifikasyona hazır hücre lizzi, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR/Cas12a tahlilleri kullanarak Lotmaria passim ve Nosema ceranae gibi arı patojenlerinden DNA'yı tespit etmek için basit ve hızlı bir prosedürü açıklıyoruz.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Öğrenin narenciye yaprak dokusunda Candidatus liberibacter spp. tespiti için geleneksel PCR yöntemini. Bu hızlı ve uygun maliyetli teknik, çiftçilerin ve araştırmacıların hastalığı doğru şekilde tanımlamasına yardımcı olur.

Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti (Video) | JoVE Journal

Belirli ve narenciye Greening patojen olan liberibacter spp. kullanma geleneksel PCR narenciye yaprak doku örnekleri üzerinde doğru tespiti

Daha fazla video keşfet