Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon etkilerini incelemek için bir Syngeneic pankreas kanseri fare modeli

Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon (IRE) yerel olarak gelişmiş pankreas kanseri tedavisi için kullanılan bir sigara-termal ablasyon tekniği kullanıyor. Nispeten yeni bir teknik olarak, tümör büyüme IRE etkileri kötü anlaşılır. Pankreas kanseri IRE etkilerini eğitim kolaylaştırır bir syngeneic fare modeli geliştirdik.

Bu modelin genel amacı, immünokompetan farelerde pankreas kanseri üzerindeki geri dönüşümsüz elektroporasyon veya IRE'nin etkilerini incelemektir. Bu model, IRE'nin pankreas kanserindeki rolü ile ilgili birçok önemli soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, IRE lokal tümör mikroçevresini nasıl etkiler?

Bu modelin temel avantajı, nakavt veya mutant fare modelleri gerektirmeden, immünokompetan bir sistemde doğru tümör büyümesi değerlendirmesini kolaylaştırmasıdır. Bu yöntem, pankreas kanserinin immün yetmezliği olan bir fare modelinde IRE'nin bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri hakkında bilgi sağlayabilir. Deri altı tümör indüksiyonu için, önce anestezi uygulanmış altı haftalık, erkek, C57 siyah altı farede enjeksiyon bölgesini tıraş edin ve bölgeyi iki kez temizlemek için alkollü bir bez kullanın.

Daha sonra, bir ila iki çarpı on ila mililitre başına yedi hücre ve 250 mikrolitre bazal membran matrisi ile soğuk bir mililitrelik şırınga yükleyin. Şırıngaya 25 gauge bir iğne takın ve iğneyi tümör hücresi süspansiyonu ile yükleyin. Hava kabarcıklarını gidermek için pistona birkaç kez basın ve geri çekin.

İğneyi enjeksiyon bölgesinin derisinin altına 30 derecelik bir açıyla dikkatlice yerleştirin. İğne vücuda paralel olacak şekilde, tümör hücrelerinin 50 mikrolitresini yavaşça enjekte edin. 10 saniye sonra, iğneyi yavaşça geri çekin, herhangi bir yana doğru hareket etmeden paralel tutun ve fareyi kafesine geri koymadan önce enjeksiyon bölgesini alkollü bir bezle nazikçe temizleyin.

Tümör beş ila yedi milimetreye ulaştığında, periton boşluğunu delmemeye dikkat ederek, biyogüvenlik seviyesi iki başlıkta steril koşullar altında deri altı tümörü çıkarmak için steril forseps ve mikro makas kullanın. Eksize edilen tümörü hemen iki kez steril PBS'de yıkayın. Ve tümörü bir ila iki küp milimetrelik parçalara ayırmak için steril neşterler kullanın.

Daha sonra, tümör parçalarını buz üzerinde soğuk, steril DMEM bazal ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Tümör parçalarını implante etmek için, ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, anestezi uygulanmış alıcı hayvanın gözlerine merhem sürün ve fareyi sağ tarafına yerleştirin, böylece karnın sol tarafı açığa çıkar. Karın kıllarını tüy dökücü kremle çıkarın ve kremi gazlı bezle çıkarın.

Maruz kalan cildi üç ardışık %10 povidon artı iyot ve alkollü mendil ile dezenfekte ettikten sonra, ciltte 1,5 santimetre, orta hattın bir santimetre solunda, göğüs kafesinin altında ve dalağın hafif medialinde 1,5 santimetrelik bir kesi yapmak için steril bir neşter kullanın. Dalağı düz uçlu forseps ve steril bir pamuk aplikatör ile nazikçe dışsallaştırın ve dalağın altındaki pankreasın kuyruğunu yanal olarak geri çekmek için forsepsleri kullanın. Steril forseps kullanarak, ince kıyılmış bir tümör parçasını kavrayın ve parçanın içinden ince bir 6-O steril dikiş iğnesi geçirin.

Tümör parçası içeren iğneyi pankreasın kuyruğuna yerleştirin ve dikişi dokudan yavaşça geçirin. Tümör tohumlanmasını önlemek için tümör ile karın duvarı kas sistemi ve periton arasındaki temastan kaçınmaya dikkat edin. Tümör fragmanı sabitlendiğinde, iğneyi dokudan tamamen çıkarın ve herhangi bir kanama belirtisi olup olmadığını kontrol ederken organları 60 saniye daha tamamen dışsallaştırılmış halde tutun.

Kanama gözlenmezse, dalak, pankreas ve tümörü nazikçe karın boşluğuna geri döndürmek için künt forseps veya pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Tümörün çapı altı milimetreye ulaşmadan önce, uyuşturulmuş hayvanı tümöre erişim sağlamak için sağ tarafına yerleştirin ve tümör bölgesini temizlemek için makas ve alkollü çubuk kullanın. Forseps kullanarak, cildi doğrudan tümörün altına kaldırın ve elektrotların periton boşluğuna nüfuz etmemesine dikkat ederek, tümörü braketlemek için vücuda paralel olarak deriden iki iğne dizisi elektrotu yerleştirin.

Elektroporatörü, toplam 150 darbe için santimetre başına 1500 voltta, bir hertz frekansında 100 mikrosaniye darbe verecek şekilde ayarlayın ve darbeleri iletmek için ayak pedalını kullanın, her 10 darbe setini 10 saniye ayırarak, her bir darbe seti arasında ısı dağılımına izin vermek için. IRE uygulaması sırasında kas seğirmesi meydana geldiğinden ve ilk darbe seti sırasında daha belirgin olduğundan, elektrotların hala istenen yerde olduğundan ve her darbe setinden sonra hayvanın hala sakinleştirildiğinden emin olun. 200 saniyeden fazla olmayan dozlamadan sonra, elektrotları çıkarın ve elektroporatörde gösterildiği gibi verilen gerçek voltajı kaydedin.

Ardından, fareyi kafesine geri koyun. Ortotopik bir tümörün IRE'si için, tümör implantasyonundan sekiz ila 10 gün sonra, tümörü forseps ile dışsallaştırmak için künt burunlu forseps kullanın ve tümörü Cımbızın platin elektrotları ile sıkıca yakalayın, elektroporasyon darbelerini iletin, az önce gösterildiği gibi, tümörü son darbe seti için en az 60 saniye boyunca dışsallaştırın, herhangi bir kanama belirtisi olup olmadığını izlemek için. Ardından, tümörü karın boşluğuna geri koyun ve gösterildiği gibi insizyonu kapatın, hayvanı tamamen iyileşene kadar izleyin.

Bu temsili deneyde, farelerin yaklaşık% 50'sinde deri altı tümörler, 150 IRE darbesinden sonra tamamen geriledi ve 75 darbeden sonra sadece küçük bir gerileme oldu. IRE'den bir hafta sonra tümör dokusunun histolojik analizi, eksik tümör regresyonu vakalarında, kontrolde, tedavi edilmemiş tümörlerde gözlenmeyen ve canlı tümör dokusu ile çevrili geniş merkezi tümör nekrozu bölgelerini ortaya çıkardı. İmplante edilmiş ortotopik tümörlerin büyüme oranlarının izlenmesi, alıcı hayvanlarda zaman içinde tutarlı bir tümör büyümesi ortaya çıkardı ve bu da IRE tarafından bozulabilir ve bu modelin immünokompetan bir fare modelinde IRE'nin etkilerini simüle etme yeteneğini gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa fare başına 15 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, daha büyük tümörler eksik ablasyon nedeniyle tutarsız yanıtlar üreteceğinden, tümör boyutunu mevcut IRE elektrotlarının çalışma mesafesi içinde tutmayı unutmamak önemlidir. Radyasyon veya kemoterapiler gibi diğer tedavi yaklaşımları, tedavilerin birleştirilmesinin IRE'ye tümör yanıtlarını iyileştirip iyileştiremeyeceği hakkında ek soruları yanıtlamak için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerde deri altı ve ortotopik pankreas kanserlerinin nasıl kurulacağını ve bu tümörler üzerinde IRE'nin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.