Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil
10 Mart 2018
Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.
Hücre bazlı Testin genel amacı, bir G proteinine bağlı reseptöre bağlanan molekülleri tanımlamaktır. Reseptöre bağlanmak için floresan etiketli bir ligand ile rekabet etme yeteneklerine dayanarak. Rekabet bağlama testi, G-proteinine bağlı reseptör ilaç keşfini destekleyebilir.
Kemokin reseptörü CXC4 için bu protokolle göstereceğimiz gibi. Bu yöntemin temel avantajı, canlı hücrelerin hafıza hazırlıkları yerine alıcı bağlanmayı analiz etmek için kullanılmasıdır. Ve radyoaktivite etiket problarının kullanımından kaçınılmıştır.
Bu yöntem başlangıçta kemokin reseptörü CXCR4'e bağlanmayı incelemek için kurulmuş olsa da, floresan etiketli ligandların bulunduğu diğer GPCR'ler için de geliştirilebilir. Başlamak için, önceden tanımlanmış bir deney düzenine göre 100 mikrolitre bileşik çözeltiyi 96 iyi yuvarlatılmış bir alt plakaya dağıtın. Çok kanallı bir pipet kullanarak bir reaktif rezervuarından 96 oyuklu plakaya 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, benzer bir reaktif rezervuarından 96 kuyucuklu plakanın kuyularına mililitre CXCL12 başına 50 mikrolitre floresan etiketli 100 nanogram ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca yerçekiminin 400 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Plakayı ters çevirerek süpernatanı peletlenmiş hücrelerden çıkarın. Plakayı bir mendil üzerinde kurutun.
Çok kanallı bir pipet kullanarak bir reaktif rezervuarından kuyucuklara 200 mikrolitre taze SA tamponu ekleyin. Hemen plakayı tekrar santrifüjlemeye devam edin, oda sıcaklığında yerçekiminin 400 katı sıcaklıkta beş dakika boyunca. Plakayı ters çevirerek ve ardından bir doku üzerinde kurutarak süpernatanı tekrar çıkarın.
Son olarak, hücre peletini PBS'de çözünmüş 200 mikrolitre% 1 paraformaldehit içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Bu adım hücreleri düzeltecektir. Numuneleri akış sitometrisi ile analiz etmek için cihazı başlatın ve ilgili yazılımı açın.
Nokta bloğu biçiminde görselleştirilecek hücresel parametreleri, ileri saçılma alanı, yan saçılma alanı ve histogram görünümünde floro dört algılama kanalı olarak seçin. Bir örnek seçin. Örneğin, ileri saçılma ve yan saçılma parametrelerine dayalı olarak tanımlanmış bir homojen hücre popülasyonunun geçitini gerçekleştirmek için bir negatif kontrol numunesi.
Hücreleri akış sitometri cihazına yüklemek için ayarları uyarlayın. Enjeksiyondan önce üç karışım seçin. 100 mikrolitre sabitlenmiş hücrenin otomatik enjeksiyonunu seçin ve saniyede 1,5 mikrolitrelik bir numune akış hızı kullanın.
Veri al'ı seçerek örneği çalıştırın. Bu örnek için ileri saçılma ve yan saçılma parametrelerinin yanı sıra floro dört algılaması artık ekranda görünecektir. Şimdi, yazılım geçit aracını seçin.
İleri saçılma ve yan saçılma nokta grafiği görselleştirmesine dayalı olarak, geçit ile homojen ve canlı bir hücre popülasyonunu önceden tanımlayın. Örnek başına 20.000 olayı analiz etmek için seçin. Bu, her bir numune için, önceden tanımlanmış bir kapıya giren 20.000 hücrenin sonunda analiz edileceği anlamına gelir.
Bu olay sayısına ulaşılana kadar veri toplama devam edecektir. Önce analiz edilecek kuyuları seçerek çalıştırmaya başlayın. Ardından çalışma kuyularını seçer.
Akış sitometri cihazı şimdi her numune için ortalama floresan yoğunluğunu kaydederek bu numuneleri tek tek analiz edecektir. Bu, önceden tanımlanmış kapıya giren 20.000 hücreden gelen ortalama floresan sinyaline karşılık gelir. Son olarak, protokolde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin.
Yüksek konsantrasyonlarda AMD3100, kurulmamış ve spesifik CXCR4 antagonisti ile jurkat hücrelerinin ön inkübasyonunu takiben. Etiketli CXCL12'nin bağlanmasını yansıtan ortalama floresan yoğunluğu neredeyse tamamen arka plan seviyelerine düşürülür. Bu, CXCL12'nin jurkat hücrelerinde eksprese edilen CXCR4'e oldukça spesifik bağlanmasını gösterir.
CCR5 antagonisti Maraviroc gibi CXCR4 reseptörüne bağlanmak için etiketli CXCL12 ile rekabet edemeyen bileşikler, ortalama floresan yoğunluğunu etkilemeyecektir. Buna karşılık, yüksek derecede aktif bileşikler bunu doza bağlı bir şekilde yapacaktır. Videoyu izledikten sonra, canlı hücreler ve akış sitometrisi kullanarak bir rekabet alıcı bağlanma testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, CXCL12'nin CXCR4'e bağlanmasını inhibe eden bileşikleri tanımlamayı amaçlayan, akış sitometrisi tabanlı bir hücresel bağlanma testi tanımlamaktadır. Yöntem, radyoaktif etiketlerin kullanımından kaçınarak reseptör bağlanmasını analiz etmek için canlı hücreleri kullanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel bağlanma deneyleri
- G proteinine kenetli reseptörler
- İlaç keşfi
Arka Plan
- CXCL12, G protein-coupled bir reseptör olan CXCR4'e bağlanan bir kemokindir.
- Bu bağlanmanın inhibitörlerinin belirlenmesi, ilaç geliştirmeye yardımcı olabilir.
- Geleneksel yöntemler genellikle radyoaktivite içerir; bu analiz ise radyoaktivite kullanımından kaçınmayı amaçlamaktadır.
- Canlı hücrelerin kullanılması, biyolojik etkileşimlerin daha doğru bir temsilini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- CXCL12'nin CXCR4'e bağlanmasını inhibe eden bileşikleri tanımlamak için bir tarama aracı geliştirmek.
- Bağlanma analizlerinde canlı hücre kullanmanın avantajlarını göstermek.
- G proteini kenetli reseptör ilaç keşfi çalışmalarını desteklemek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücresel bağlanmayı analiz etmek için akış sitometrisi.
- Bağlanma rekabetini değerlendirmek için floresan işaretli ligandların kullanımı.
- Reseptör etkileşimlerini değerlendirmek için canlı hücre analizleri.
- Deneysel düzenekte radyoaktif işaretlemeden kaçınılması.
Ana Sonuçlar
- Analiz, CXCL12 bağlanmasını inhibe eden bileşikleri başarıyla tanımlamaktadır.
- Canlı hücre analizi, geleneksel yöntemlere kıyasla daha ilgili veriler sağlar.
- Yöntem, potansiyel ilaç adaylarının taranmasında etkilidir.
- Sonuçlar, bu analizin ilaç keşfinde kullanılabilirliğini desteklemektedir.
Sonuçlar
- Akış sitometrisi tabanlı analiz, CXCR4 inhibitörlerini belirlemek için değerli bir araçtır.
- Canlı hücrelerin kullanılması, bağlanma çalışmalarının doğruluğunu artırır.
- Radyoaktiviteden kaçınılması, deneysel süreci basitleştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulanabilirlik Özeti
Bu akış sitometrisi tabanlı kompetitif bağlanma testi, biyofarma ekiplerinin onkoloji ve inflamatuar hastalık boru hatlarında temel bir hedef olan CXCL12-CXCR4 etkileşimlerini bozan küçük molekülleri belirlemesine olanak tanır. Canlı hücreler ve floresan ligandlar kullanan bu yöntem, fizyolojik olarak anlamlı bağlanma verileri sağlarken radyoaktivite kullanımından kaçınır. Bileşiklerin önceliklendirilmesi için kantitatif ve tekrarlanabilir sonuçlar sunarak erken aşama hedef doğrulamayı ve öncü bileşik belirlemeyi destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Doğal bir hücresel bağlamda, bileşiklerin reseptör-ligand bağlanması üzerindeki doğrudan etkilerini ölçerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Bileşik aktivitesinin mekanistik onayı aracılığıyla, hedef olarak CXCR4'ün risklerini azaltan fonksiyonel bir okuma sağlar.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşimine işaret eden doz bağımlı inhibisyon profillerine sahip bileşikleri belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Ortalama floresan yoğunluğu aracılığıyla kantitatif bağlanma inhibisyon verileri üreterek yapı-aktivite ilişkisi analizine olanak sağlar.
- Operasyonel Değer: 96 kuyucuklu plaka formatına uyarlanabilir; bu sayede analiz tutarlılığını korurken tarama kampanyalarının kapasitesini artırır.
- Yeniden Kullanılabilirlik: Floresan ligandlar mevcut olduğunda diğer GPCR'ler için uygulanabilir standartlaştırılmış bir platform oluşturarak yeniden geliştirme çabasını azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Fizyolojik reseptör ekspresyonunu ve bağlanma dinamiklerini yansıtmak için canlı Jurkat hücrelerini kullanır ve böylece translasyonel ilgiyi artırır.
- Operasyonel Değer: Hedefe özgü bileşik etkilerini doğrulayarak, sonraki aşamalardaki preklinik değerlendirmelerle uyumlu veriler üretir.
- Risk Azaltma: Spesifik CXCR4 inhibitörlerini spesifik olmayan bileşiklerden (örneğin, Maraviroc etki göstermez) ayırt ederek yanlış pozitifleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Analiz, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye kadar olan keşif sürecine uyum sağlayarak, hit-to-lead (başlangıç bileşiğinden öncü bileşiğe) ilerlemesine ışık tutan bağlanma verileri sunar. Bileşik karakterizasyonuna mekanistik derinlik ekleyerek fenotipik taramayı tamamlar.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücrelerde bileşiklerin CXCL12'nin CXCR4'e bağlanmasını bozma miktarını ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Akış sitometrisi okumalarıyla uyumlu standart inkübasyon, yıkama ve fiksasyon adımları aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analizler: Dozlar arası bileşik potensini ve etkinliğini karşılaştırmak için nicel bir çıktı olarak ortalama floresan yoğunluğu sunar.
- Translasyonel Araştırma: CXCR4 eksprese eden hastalıkla ilişkili bir hücre hattı (Jurkat) kullanarak bağlanma verilerini kanser ve inflamasyondaki potansiyel terapötik etkiyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: GPCR hedefleri arasında aktarılabilir modüler bir bağlanma platformu olarak işlev görerek analiz geliştirme yatırımının geri dönüşünü maksimize eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: CXCL12'nin CXCR4'e spesifik ve yer değiştirebilir bağlanmasını göstererek hedef etkileşimindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış hücre işlemleri, inkübasyon süreleri ve akış sitometrisi gating protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Keşif sürecinin erken aşamalarında hedef spesifik aktivite göstermeyen bileşikleri eleyerek devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Net doz bağımlı inhibisyon profillerine sahip bileşiklerin belirlenmesiyle riskle uyumlu ilerlemeye olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Akış sitometrisi kullanımı, kompanzasyon ve canlı hücre popülasyonları için kapılama stratejileri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Uygun kanaldaki (örneğin FITC veya eşdeğeri) floresan sinyalleri tespit edebilen akış sitometrelerine erişime bağlıdır.
- Tarama partileri boyunca hücre hazırlama, bileşik dilüsyonu ve inkübasyon koşullarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer GPCR'lara adaptasyon, hedef reseptöre özgü floresan işaretli ligandların geliştirilmesini veya temin edilmesini gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında analiz süresi (~90 dakika artı analiz süresi) ve güçlü sinyal-gürültü oranlarını sağlamak için ligand konsantrasyonunun optimizasyon ihtiyacı yer alır.
