Name: Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin Promoter Capture Hi-C yöntemiyle gen düzenleyici elemanları hedef genlere bağlama tekniğini. Bu yöntem, genom mimarisinin gen ifadesi kontrolüne etkisini araştırır ve hastalık ilişkili varyantları hedef genlere bağlayarak tedavi potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Valeriya Malysheva el yazması ve Şekil 1 ilgili uzman yardım eleştirel okuma için teşekkür ediyoruz. Bu eser tıbbi araştırma Konseyi, İngiltere (Bay/L007150/1) ve İngiltere'de Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi, UK (1/J004480/BB) tarafından desteklenmiştir.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Modüler tasarım organizatörü yakalama Hi-C
Organizatörü yakalama Hi-C özellikle Rehberleri ilgili etkileşimleri için Hi-C kitaplıklar zenginleştirmek için tasarlanmıştır. Bu etkileşimler yalnızca bir alt kümesini ligasyonu ürünleri bir Hi-C Kitaplığı'nda oluşturmaktadır.
Yakalama Hi-C yakalama sistemini değiştirerek herhangi bir genomik bölge ve bölgeler ilgi için Hi-C kitaplıklar zenginleştirmek için kolayca değiştirilebilir. Yakalama bölgeleri-ebilmek var olmak sürekli genomik kesimleri44,45,46,48, olmuştur arttırıcılar tespit PCHi-C (' ters yakalama Hi-C'35) veya DNaz ben aşırı duyarlı siteleri49 . Yakalama sisteminin boyutunu bağlı olarak deneysel kapsam ayarlanabilir. Örneğin, Dryden ve ark. meme kanseri44ile ilişkili üç gen çöller içinde 519 yem parçaları hedefleyin. Yakalama sistemi tarafından Martin ve ark. Her iki sürekli genomik segmentleri hedefleyen ('Bölge yakalama': Toplam 211 genomik bölgeleri; 2,131 kısıtlama parçaları) ve seçili Rehberleri (3,857 gen organizatör)45.
SureSelect kitaplıklarıdır farklı boyut aralıkları kullanılabilir: 1 kb ile 499 kb (5.190 – 4,806), 2.9 MB (5.190 – 4,816), 500 kb ve 3 Mb-5.9 Mb (5.190 – 4,831). Her tek tek yakalama biotin-RNA 120 nükleotit uzun olduğu için bu sistemleri yakalamak en fazla 4,158 karşılamak, 24,166 ve 49,166 tek tek yakalama probları, anılan sıraya göre. Bu 2.079, 12,083 ve 24,583 hedeflenen kısıtlama parçaları, sırasıyla karşılık gelen (kısıtlama parçaları için numaraları alt sınırlar iki tek tek yakalama problar her kısıtlama için dizayn edilebilir varsayımını temel olduğunu unutmayın parça — bu durum her kısıtlama için olmayacaktır nedeniyle tekrarlayan dizileri gerçekte (Ayrıca bkz: Şekil 1B, C) parçası, daha yüksek kullanılabilir yakalama probları sabit bir sayı için targetable kısıtlama parçalarının ortaya çıkmıştır ).
Burada açıklanan protokol Restriksiyon enzimi ile uzun menzilli etkileşimleri ortaya çıkarmak için 6 bp tanıma site kullanımı temel alır. Restriksiyon enzimi ile 4 bp tanıma site daha proksimal etkileşimleri büyük çözünürlük için de olası40,49kullanmaktır.
PCHi-C sınırlamaları
Bir doğal tüm kromozom conformation yakalama deneyleri onların çözünürlük kitaplığın oluşturulmasında kullanılan Restriksiyon enzimi tarafından belirlenir kısıtlamasıdır. Aynı kısıtlama parçası üzerinde bulunan DNA öğeleri arasındaki etkileşimleri 'C-type' deneyleri için görünmez olur. Ayrıca, PCHi-C, bazı durumlarda birden fazla transkripsiyon başlangıç site aynı organizatörü içeren kısıtlama parçası üzerinde bulunan ve PIRs bazı durumlarda her iki aktif ve baskıcı histon işaretleri hangi kesin olarak belirlemek zor yasal yapma liman öğeleri etkileşimleri, arabuluculuk ve organizatörü etkileşimlerin düzenleyici çıktı tahmin etmek. Enzimleri ile 4 bp tanıma siteleri kullanarak bu sorunu azaltır ama büyük ölçüde artan Hi-C Kitaplığı karmaşıklık pahasına gelir (4 bp tanıma sitesi enzimleri ile oluşturulan Hi-C kitaplıklarıdır Hi-C den en az 100 kat daha karmaşık Kitaplıklar) 6 bp tanıma sitesi enzimleri ile oluşturulan ve sonraki nesil sıralama için ilgili maliyetler.
Geçerli PCHi-C Protokolü malzeme, nadir hücre tipleri organizatörü etkileşimlerin analizi iyileştirmelerden başlangıç olarak hücreleri milyonlarca gerekir başka bir kısıtlamadır. Organizatörü kişiler'hücre popülasyonlarının 10.000 100.000 hücreleri (örneğin hücreleri hematopoetik kök hücre veya erken embriyonik gelişim sırasında) ile sorgulama etkinleştirmek için PCHi-C değiştirilmiş bir sürümü bu nedenle yakalama değerli bir ek olurdu Merhaba C araç.
Son olarak, üzerinde formaldehit tespit itimat tüm yöntemleri gibi PCHi-C yalnızca, Windows fiksasyon zaman noktasında 'dondurulmuş' etkileşimleri kaydeder. Böylece, kinetik ve organizatörü etkileşimleri dinamiklerini incelemek için Süper çözünürlük canlı cep mikroskobu gibi yöntemleri gerekli PCHi-c ile birlikte
Yöntemleri kayma kromozom organizasyon yüksek çözünürlükte incelemek için
Kromozom etkileşim kütüphanelerin büyük karmaşıklık istatistiksel anlamlılık ile iki belirli kısıtlama parçaları arasında etkileşim ürünlerin güvenilir kimlik yasaklar. Bu sorunu aşmak için sıra yakalama Hi-C33,34,40,44 veya belirli etkileşimler için 3 C50,51 kitaplıkları zenginleştirmek için kullanılmıştır. Hi-C kitaplıklar 3 C kitaplıklar için zenginleştirme adım kullanmanın en büyük avantajı Hi-C, hakiki ligasyonu ürünler için bir zenginleştirme adım 3 C kapsamaktadir. Sonuç olarak, geçerli okuma yüzdesi PCHi-C kütüphanelerde yaklaşık HiCUP süzme sonra yakalama-C'de kütüphaneler50civarında bulunan geçerli % 5-8, okur daha 10 kat yüksektir. Sahlen ve ark. doğrudan yakalama-C HiCap, kullandığı PCHi-C gibi Hi-C kitaplıklar için 3 C kitaplıklar kullanır yakalama-C aksine yakalama zenginleştirme ile karşılaştırıldığında. Bizim bulgular ile tutarlı, buldular yakalama-C kütüphaneler çoğunlukla un ve birleştirilmiş parçaları40/ oluşmaktadır. Ayrıca, yakalama-C kitaplıklar40daha yüksek bir karmaşıklık HiCap kütüphaneleri vardı.
Yakalama-C, yeni nesil yakalama-C52 (NG yakalama-C) adı verilen bir türevi olarak orijinal kullanılan problar örtüşen yerine PCHi-C33,34, daha önce kurulan kısıtlama parçası sonunda, başına bir oligo kullanır Yakalama-C Protokolü50. Bu mütevazi, yakalama-C'ye göre geçerli okuma yüzdesi artar ama NG yakalama-C istihdam yakalama zenginleştirme iki sıralı Tur ve PCR sayısının nispeten yüksek devir (20-24 döngüleri, toplam 11 döngüleri için PCHi-C için genellikle karşılaştırıldığında), hangi kaçınılmaz olarak daha yüksek sayıda sıra çoğaltmaları ve alt Kütüphane karmaşıklık sonuçlarında. PCHi-C en iyileştirme sırasında deneme deneylerde bulduk (değil çoğaltılamaz benzersizyani ) yüzdesini çiftleri sadece oldu yaklaşık %15 19 PCR döngüleri kullanıldığında okumak (yakalama 13 devir öncesi + 6 devir sonrası yakalama; verileri gösterilmez), ancak en iyi duruma getirme PCR döngüleri, daha küçük bir numarayla genellikle benzersiz okuma çiftleri % 75-90'ı verir. Böylece, PCR devir sayısını önemli ölçüde azaltarak bilgilendirici sıralı veri miktarını artırır.
Son yöntemi ChIP kromozom etkileşimleri faiz (HiChIP53) belirli bir protein tarafından aracılı odaklanmak için Hi-C ile birleştirir. Benzer mantığı üzerinde dayanır, çim54, karşılaştırıldığında HiChIP veri bilgilendirici sıra okuma,53çağrı güven derecesi yüksek etkileşim için izin daha yüksek bir sayıda içerir. Doğrudan karşılık gelen HiChIP karşılaştırmak çok ilginç olacak ve yakalama Hi-C veri kümeleri bir kez (bir antikor cohesin birim Smc1a karşı kullanarak HiChIP53 ile yakalama Hi-C tüm Smc1a için kısıtlama bağlı örnek için kullanılabilir parçaları) yan yana. Bu iki yaklaşım arasında bir doğal fark yakalama Hi-C kromatin immunoprecipitation dayanmaz ve bu nedenle protein doluluk bakılmaksızın kromozom etkileşimleri sorguya yapabiliyor olmasıdır. Bu gibi PRC1 fare ESC kayma genom mimari7anahtar bir düzenleyici tanımlamak için kullanılan belirli faktörü bağlayıcı olup 3D genom organizasyonu karşılaştırmasını sağlar.
PCHi-C ve GWAS
Genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) % 95'den büyük hastalığı ile ilişkili olduğunu ortaya sıra türevleri büyük mesafelerde kez protein kodlayıcı genlerin55için genom kodlamayan bölgelerinde bulunur. GWAS türevleri çoğu zaman bulundu yakın DNaz ben aşırı duyarlı siteleri, hangi potansiyel yasal faaliyet sıralarıyla özelliğidir. PCHi-C ve yakalama Hi-C GWAS risk loci meme kanseri44, kolorektal kanser48ve otoimmün hastalığı35,45,46karıştığı Rehberleri bağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. PCHi-C çalışma üzerinde 17 farklı insan hematopoietik hücre sıra türevleri trombosit ve kırmızı kan hücresi belirli özellikleri ile ilişkili ağırlıklı olarak bulundu, ancak türleri SNPs otoimmün hastalığı ile ilişkili lenfoid hücrelerde PIRs içinde zenginleştirilmiş bulundu makrofajlar ve erythroblasts, sırasıyla35,56. Böylece, doku belirli organizatörü PCHi-C tarafından ele geçen interactomes hastalık ilişkili kodlamayan işlevini anlamak için yardımcı olabilir türevleri sıra ve yeni potansiyel hastalık genleri terapötik müdahale için tanımlar.
Organizatörü etkileşim bölgeleri özellikleri
Kanıt bağlantı organizatörü interactomes gen ifade denetlemek için birkaç satırlık. İlk olarak, birçok PCHi-C araştırma (yüksek) ifade genlerin rehberleri ile etkileşim genomik bölgeler H3K27 asetilasyon ve p300 bağlama33,34 gibi artırıcı aktivitesiyle ilişkilendirilmiş işaretleri zenginleştirilmiş göstermiştir , 37. gen ifade düzey ve etkileşen arttırıcılar, artan gen ekspresyonu arttırıcılar sonucu artırıcı etkileri34,35düzeyleri düşündüren sayısı arasında pozitif bir korelasyon bulduk. İkinci olarak, doğal olarak meydana gelen Ifade eQTLs35tarafından etkilenen aynı genlere bağlı PIRs yılında niceliksel Özellik loci (eQTLs) zenginleştirilmiş ifade. Üçüncü olarak, gezi57 ' PCHi-C veri entegre ederek, Cairns vd. PIRs fare ESCs içinde eşleme gezi muhabir gen gen ekspresyonu reporter genler tümleştirme sitelerde daha organizatörü etkileşim bölgelerde daha güçlü muhabir göstermek bulundu PIRs transkripsiyon düzenleyici faaliyet sahip gösteren 58. Birlikte, bu bulgular PCHi-C tarafından çeşitli fare ve insan hücre türleri ele geçen organizatörü interactomes gen ifadesi denetim için anahtar yasal modülleri dahil öneririm.
Bu arttırıcılar yalnızca küçük bir bölümü (~ % 20) temsil eden tüm PIRs ortaya PCHi-C33tarafından,34, fazlalaştı. Diğer PIRs doğrudan transkripsiyon düzenleyici fonksiyonları yerine yapısal veya topolojik rolleri olabilir. Ancak, kanıt da PCHi-C klasik artırıcı işaretleri liman değil DNA öğeleri düzenleyici fonksiyonu ile ortaya çıkarmak. Bir insan lenfoid hücre kültürünü BRD7 organizatörü muhabir gen deneyleri33artırıcı faaliyete sahip gösterilmiştir bir bölge artırıcı işaretleri yoksun etkileşimli olarak bulundu. Benzer özelliklere sahip düzenleyici elemanlarının Şu anda takdir daha bol olabilir. Örneğin, gen ekspresyonu kontrol ancak artırıcı yoksun olan düzenleyici DNA öğeleri tanımlanan işaretsiz düzenleyici elemanlarının (UREs) için bir CRISPR tabanlı ekran59işaretler.
Diğer durumlarda, PIRs liman transkripsiyon baskı ile ilişkili kromatin işaretleri gösterilmiştir. PIRs ve PRC1 içinde fare ESCs bağlı etkileşen Rehberleri bastırılmış genleri taşıyan geniş bir kayma ağ baskıcı H3K27me37işaretlemek meşgul edildi. İnsan lymphoblastoid hücrelerde, uzak bir öğe BCL6 organizatörü ile etkileşim BCL6 transkripsiyon onun yerel bağlamda bastırmak için çalışabilir düşündüren transgene muhabir gen ifade33, baskı altında.
Doluluk insan ESCs ve NECs37 kromatin yalıtkan protein CTCF PIRs yeni bir sınıfı temsil edebilir için zenginleştirilmiş PIRs. Toplu olarak, bu sonuçlar PIRs gen düzenleyici faaliyetleri henüz işlevsel olarak karakterize edilebilir topluluğu liman öneririz.

Kanıt biriken üç boyutlu genom organizasyonu nükleer süreçler, gen harekete geçirmek1,2,3, baskı4 de dahil olmak üzere bir dizi önemli bir işlevsel rol oynar öneriyor ,5,6,7,8, rekombinasyon9,10, DNA onarım11, DNA çoğaltma12,13, ve hücresel yaşlanma14. Uzak arttırıcılar uygun spatio-temporal gen ifadesi denetim için gerekli olan15,16,17, düzenleyen Rehberleri kayma yakınında bulunur. Distal arttırıcılar hedef Gen transkripsiyonu18,19,20,21,22ve 'kromatin döngü zorla' için gerekli olan artırıcı silme işlemlerini göster bir artırıcı ve onun hedef organizatörü Hbb odağı içinde arasında mühendislik hayvan zinciri transkripsiyon harekete geçirmek23götürmek için yeterli olduğunu gösterir. Ayrıca, genler ektopik arttırıcılar kontrol altında getirmek genom düzenlemeler uygunsuz gen harekete geçirmek ve hastalık24,25,26neden olabilir. Birlikte, bu örnekler organizatörü artırıcı etkileşimleri gen kontrolü için gerekli olan ve uygun gen ekspresyonu emin olmak için sıkı düzenleme gerektirir göstermektedir. İnsan ve fare genleri her tahmin edilmektedir yaklaşık bir milyon arttırıcılar liman için. Bu arttırıcılar büyük çoğunluğu için hedef genlerin bilinmemektedir ve 'kuralları' organizatör ve arttırıcılar arasında kötü anlaşılır. Onların hedef genlerin transkripsiyon arttırıcılar atama böylece memeli gen ifadesi denetim deşifre içinde büyük bir meydan okuma olarak kalır.
Üç boyutlu genom mimari anlayışımız 3 C27 (kromozom conformation yakalama) giriş ve onun türevleri28,29,30,31 tarafından devrim . Bu tekniklerin, Hi-C (yüksek işlem hacmi kromozom conformation yakalama) en güçlü bir hücre nüfus içinde kromozom etkileşimler tüm topluluğu tanımlamak için tasarlanmıştır. Merhaba C kitaplıklar, genellikle üretilen milyonlarca hücre, son derece karmaşık bir tahmini 1011 bağımsız ligasyonu ürünlerinde insan genomu32~ 4 kb parçaları arasında. Bir sonucu, bireysel kısıtlama arasındaki etkileşimler güvenilir ve tekrarlanabilir tanımlaması (içerenler gibi bir organizatörü veya artırıcı) dan parçaları gibi Hi-C veri Hi-C kitaplıklar için Ultra Derin sıralama tabi olan sürece mümkün değildir, Hangi Hi-C kitaplıklar rutin olarak hazırlama laboratuarlar için ekonomik açıdan mantıklı bir çözüm değil. Bu eksiklik aşmak için organizatörü yakalama Hi-özellikle ligasyonu urun organizatörü içeren Hi-C kitaplıklar zenginleştirmek için C geliştirdi. Biz iki nedenden dolayı Rehberleri üzerinde duruldu. İlk olarak, organizatörü artırıcı kişiler uygun gen ifade düzeyleri (bkz. Yukarıdaki referanslar) çok sayıda çalışma için çok önemli olduğu gösterilmiştir ve organizatör hücre tipleri arasında büyük ölçüde sabit olduğundan, ikinci olarak, aynı yakalama yem sistemi sorgulamak için kullanılabilir birden çok hücre tipleri ve koşullar karşısında yasal devresi. Çözüm Hi-C kitaplıklar hibridizasyon on binlerce biotinylated RNA 120mers Hi-C ligasyonu ürünleri organizatörü içeren ve manyetik boncuklar streptavidin kaplı üzerinde sonraki yakalama için tamamlayıcı ile bizim yaklaşım kullanır. PCHi-C kütüphaneleri ile bu sonuçlar çok Organizatör önemli ölçüde yüksek frekanslarda bakmaksızın parçaları tanımlaması sadece odaklanan özgün Hi-C Kütüphanesi karşılaştırıldığında karmaşıklığı azaltmak.
Biz PCHi-C bir insan ve fare hücre tipleri daha iyi gen ifadesi denetim tarafından açığa çıkarmak uzun menzilli distal organizatörü etkileşen bölgeleri sözde düzenleyici fonksiyonu ile anlamak için katkıda bulunmak gibi rasgele kullanılmış çekirdeği üç boyutlu uzayda organizatörü organizatörü kişiler. Çalışmalar çok sayıda hücre türleri33,34,35,36,37,38arasında, yüz binlerce organizatörü artırıcı kişiler eşledikten 39, fare embriyonik kök hücre7kayma genom Polycomb baskıcı karmaşık aracılı kuruluşunda tanımlanan, büyük ölçekli organizatörü interactomes hücresel başkalaşım37sırasında, uyumlanma gösterdi 38 , 39ve bağlantılı kodlamayan hastalık ilişkili türevleri gen Rehberleri35sıra.
PCHi-C organizatör ile etkileşim DNA dizileri genom çapında topluluğu eşleştirmek için ideal bir yöntemdir. İlgili yaklaşımlar, gibi yakalama Hi-C ( konuyabakın) sürekli genomik bölgeler yüksek çözünürlüklü etkileşim profilleri seçilen genomik bölgeler için elde etmek için seçtiğiniz yöntemi vardır. PCHi-C ve yakalama Hi-C bir deneysel (tek fark olduğunu yakalama sistemi seçimi) açısından, son derece benzer böylece tavsiye ve yönergeleri biz sağlamak için her iki yaklaşımın tabidir. Burada, PCHi-c ayrıntılı bir açıklama mevcut Biz mantığı ve PCHi-C deney tasarımı anahat bir adım adım PCHi-C Kütüphanesi nesil protokol sağlar ve nasıl PCHi-C kitaplıklar kalitesini yüksek kaliteli veri vermeye protokolünde çeşitli adımlar takip edilebilir göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>% 16 (hacim / hacim) paraformaldehit çözeltisi</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) 1x</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS) steril filtreli</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Düşük tutma filtre uçları&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 ve S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>24740-011</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli (EDTA içermez);</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kısıtlama tamponu 2 (10x NEBuffer 2)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tüpü, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tüpü, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>%20 (ağırlıkça/hacim) SDS&nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>%20 (cilt/cilt) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimeraz I büyük (Klenow) fragmanı 5000 birim/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg / ml Sığır Serum Albümini&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz, 1 U/&mu; L&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K, rekombinant, PCR derecesi&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000 kez; g 50 ml santrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fenol pH 8.0&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol 25: 24: 1 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat pH 5.2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kısıtlama tamponu 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Mikro TÜP AFA Fiber Ön yarık çıtçıtlı kapak 6x16mm şişeler ve nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Sonikasyon için</td></tr><tr><td>SPRI boncukları (Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 boncuklar&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz 3000 birim/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 birim/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow eksi 5000 birim/mL&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı ligasyon reaksiyon tamponu&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA Hızlı ligaz ve nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>PE adaptörü 1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE adaptörü 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB Phusion PCR kiti ve nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR şeritleri&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 ve 401425</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect SSEL TE Reaktifi ILM PE tam adaptör kiti&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect özel 3-5.9 Mb kütüphanesi&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>özel tasarım fare veya insan PCHi-C sistemi</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 boncukları&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220 ve nbsp; yüksek performanslı odaklanmış ultrasonik</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

organizatörü yakalama merhaba-c: yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Üç boyutlu genom organizasyonu onun işlevine bağlıdır. Örneğin, sık sık önemli (bazı durumlarda yüzlerce kilobases) genomik mesafeler köprü ve yan yol fiziksel temas yoluyla onların hedef genlerin spatio-temporal ifade transkripsiyon arttırıcılar gibi düzenleyici elemanlarının kontrol Yakındaki genler. İnsan genomu büyük çoğunluğu var bilinmeyen bir tahmini bir milyon arttırıcılar limanlar gen hedefler. Hedef genleri distal düzenleyici bölgeleri atama böylece gen ifadesi denetim anlamanız çok önemlidir. Bir tek denemede tüm rehberleri için organizatörü yakalama Hi-C (PCHi-C) distal organizatörü etkileşim bölgeleri (PIRs), genom çapında algılamasını etkinleştirmek için geliştirilmiştir. PCHi-C, son derece karmaşık Hi-C kitaplıklar organizatörü serileri biotinylated RNA yemler tamamlayıcı bütün organizatörü içeren kısıtlama parçaları sonuna kadar binlerce çözüm karma seçim yoluyla için özel olarak zenginleştirilmiş. Sonra açılan organizatörü dizileri ve arttırıcılar ve diğer potansiyel düzenleyici elemanlarının gibi sık etkileşim eşleri için amaçtır. Yüksek üretilen iş eşleştirilmiş uç sıralama sonra kısıtlama parça düzeyinde önemli PIRs tanımlamak için her kısıtlama organizatörü bakmaksızın parçası bir istatistiksel test uygulanır. PCHi-C uzun menzilli organizatörü etkileşimlerin bir atlas onlarca insan ve fare hücre tipleri oluşturmak için kullandık. Bu organizatörü interactome haritalar memeli gen ifadesi denetim daha büyük bir anlayış için hedef genleri sözde düzenleyici bölgeleri atama ve Tercihli kayma organizatörü organizatörü etkileşim ağları açığa katkıda bulunmuştur. Bu bilgileri ayrıca insan genetik hastalık ve potansiyel hastalık genler, tanımlaması kodlamayan hastalık ilişkili bağlayarak anlamak için yüksek alaka vardır sıra türevleri veya kontrol dizilerini için onların hedef genlerin yakınında.

Organizatörü yakalama Hi-C fare7,34,36,39 ve insan33,35,37,38 Hi-C kitaplıklar için zenginleştirmek için kullanılan organizatörü etkileşimler. (HiCap adlı) benzer bir iletişim kuralı tarafından Sandberg grubu40tarif edilmiştir. Şekil 1A şematik iş akışı organizatörü yakalama Hi-c için gösterir. Burada açıklanan iletişim kuralında, Hi-C kitaplıklar-çekirdek ligasyonu41sahte ligasyonu ürünleri42önemli ölçüde azaltılmış birkaç sonuç, kullanarak oluşturulur. PCHi-c, son derece karmaşık fare veya insan Hi-C kitaplıklar için çözüm hibridizasyon tabi olan ve 39,021 biotinylated RNA'ların 22,225 fare organizatörü içeren HindIII kısıtlama parçaları tamamlayıcı veya 37,608 biotinylated RNA'ları kullanarak yakalamak 22,076 insan organizatörü içeren HindIII kısıtlama parçaları, sırasıyla hedefleme. Kısıtlama parçaları içeren organizatörü biri veya her iki uçta da bireysel biotinylated RNA'ların (Şekil 1B) tarafından hedeflenebilir. Bulduğumuz her iki yakalama bireysel Rehberleri (Şekil 1 c; çiğ sıra okuma) neredeyse iki kat, geliştirilmiş kapsama beklendiği gibi sona erer. Böylece, ne zaman (biz tavsiye biotinylated RNA'ların her iki ucunda da bir kısıtlama parçası için tamamlayıcı yakalanması için kullanmak içinYani, tekrarlayan olmayan bölgelerde), mümkün.
PCHi-C Kitaplığı kalite Kütüphane hazırlık sırasında erken bir aşamada değerlendirmek için biz iki denetim DNA ligasyonu ve arıtma, yukarıda açıklanan31olarak sonra gerçekleştirmek. İlk tüp ligasyonu ürünler olduğu gibi 3 C27yükseltmek için belirli astar çiftleri kullanmaktır. Astar çiftleri (Tablo 1) hücre tipi sabit uzun menzilli ligasyonu ürünleri yükseltmek için kullanıyoruz, böyle Myc gen ve onun bilinen arttırıcılar yaklaşık 2 Mb uzakta (Şekil 2A) bulunan veya Hist1 odağı (genler arasında tarafından 1.5 Mb ayrılmış olarak) ve doğrusal yakın ('kısa menzilli denetimi') bulunan iki bölgeler arasında.
İkinci kalite kontrol Klenow-aracılı doldurma sırasında biotin birleşmesiyle kısıtlama sitesi çıkıntılar biotin-dATP ile verimliliğini belirlemek için yapılır. Başarılı Klenow doldurma ve ortadan kaybolması sonraki künt uçlu ligasyonu sonuçlarında arasında yeni bir NheI tanıma sitesi (Şekil 2B oluşumu DNA molekülleri HindIII durumunda ve bir tüp ligasyonu ürünün orijinal kısıtlama sitesinin ). HindIII NheI sindirilmiş ligasyonu ürün için biotin birleşme verimlilik doğrudan bir okuma oranıdır. Yüksek kaliteli kitaplıkları yakınındaki tamamlamak NheI sindirim ligasyonu ürünleri (Şekil 2B) var ise bir kalitesiz Hi-C Kütüphanesi HindIII sindirim, yüksek düzeyde gösterir.
Sonra (biotin streptavidin Hi-C ligasyonu ürün boyutu seçili, bağdaştırıcı ligasyonu ve yakalama öncesi PCR aşağı çekin sonraYani, ) Hi-C Kitaplığı hazırlık, Hi-C Kütüphanesi bütünlüğü ve boyut dağılımı (Şekil Bioanalyzer tarafından değerlendirilir 2 C). aynı denetimi PCHi-C Kitaplığı hazırlık (Yani, sonra hibridizasyon yakalama ligasyonu ürünleri organizatörü içeren ve çekim sonrası PCR) sonunda yapılır. Hi-C ve PCHi-C Bioanalyzer profilleri karşılaştırmasını gösterir beklendiği gibi Hi-C kitaplıklarıdır karşılık gelen PCHi-C kitaplıklar çok daha yoğun, ama belgili tanımlık kütüphaneci boyutu dağılımı son derece benzerdir yakalama adım gösteren PCHi-C (Şekil 2C, D) bir boyutu önyargı tanıtmak değildir.
Eşleştirilmiş uç sıralama sonra PCHi-C okuma eşleştirilir, kalite kontrol ve HiCUP boru hattı43kullanarak filtre. Yüksek kaliteli PCHi-C kitaplıkları içerir % 70-90 'geçerli çiftleri arasında' (Yani, eşleştirilmiş uç sıra okuma doğrusal genomik haritada; komşu değil iki kısıtlama parçaları arasında Şekil 3A, B). -Çekirdek ligasyonu protokol41,42kullanarak, trans yüzdesi (Yani, eşleştirilmiş uç sıra farklı kromozom üzerinde bulunan iki kısıtlama parçaları arasında okur) çiftleri genellikle düşüktür okumak, 5 ile % 25 arasında kromozom bölgelerin ve iyi Kütüphane kalite gösteren varlığını yansıtan. Doğrudan karşılaştırma 'geçerli çiftleri' Hi-C kitaplıklar ve onların karşılık gelen PCHi-C kitaplıklar35arasında yüzdesi tüm durumlarda geçerli çiftleri yüzdesini gösterir daha yüksek PCHi-C kitaplıklarda (3B rakam). Bu PCHi-C (Şekil 3 c) olarak geçerli olmayan 'aynı iç parçası' okuma yüzdesi bir azalma eşlik ediyor. Bu, beklenen yakalama adım sadece organizatörü içeren ligasyonu ürünler için zenginleştirir, ama aynı zamanda parçaları kısıtlama parçası amaçları için kısıtlama üzerinde yakalama oligos konumu nedeniyle (bkz. Şekil 1B) gibi.
Filtreleme HiCUP sonra yakalama verimliliği belirleriz. PCHi-C kitaplıkları geçerli sıralama okuma HiCUP süzme sonra üç tür içerir: 1.) Organizatörü: genom okur (Yani, yakalanan organizatörü parçası ve genom herhangi bir yerinde bir sigara organizatörü HindIII kısıtlama parçası arasında okuma) 2.) Organizatörü: organizatörü okur (iki yakalanan organizatörü parçaları arasında okuma) 3.) genom: genom okur (arka plan Hi-C ligasyonu ürünleri nerede ligasyonu ürün ortakları hiçbiri haritalar için yakalanan organizatör). Bunlar önce aşağı akım analizleri atılır.
Yüksek kaliteli PCHi-C kitaplıkları (3D şekil) % 65-90 arasında yakalama verimliliği (Kategori 1 ve 2 yukarıdaki toplamı) sahiptir. PCHi-C sonuçlanan Hi-C kitaplıklar için doğrudan bir karşılaştırma gösterir bir ~ 15-fold zenginleştirme organizatörü içeren ligasyonu ürünleri için (3D şekil), bazı durumlarda 17-fold. Bu varsayımsal maksimum yakın olduğunu (19.6-fold) PCHi-C, genom kısıtlama parçaları yüzdesi bağlıdır için zenginleştirme kaplı yakalama sistemi tarafından. Yakalama sistemleri daha az kısıtlama parçaları44,45,46hedefleme tasarlayarak büyük zenginlik elde edilebilir.
Hücre türü ve soy-özgüllük33,34,35, hücresel başkalaşım37,38,39 sırasında belirgin değişikliklerle organizatörü interactomes analizini gösterir . Rakamlar 4 ve 5 lineage özgüllük ve farklılaşma dinamiği belirli Rehberleri örnekler. Örneğin, ALAD yapısal tüm hücrelerde ifade edilir ancak onun ifade upregulated erythroblasts47olduğunu. ALAD düzenleyici tüm hematopoetik hücreler içinde birkaç distal parçaları kurar ve özellikle de erythroblasts (Şekil 4) ek etkileşimleri yürütmektedir. B hücreleri, T hücreleri, ama hücre tipi belirli etkileşimler de dahil olmak üzere monosit, nötrofil ve megakaryocytes () içinde miyeloid soyundan hücrelerdeki etkileşimleri onlarca çok az etkileşimlerde hiçbir istatistiksel olarak anlamlı etkileşimler Il-8 gösterir Şekil 5). Bu örnekler, PCHi-C hücre tipi belirli interactomes çözmeye ve düzenleyici potansiyeli ile organizatörü etkileşim bölgeleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Resim 1 : Organizatörü yakalama Hi-C mantığı ve yakalama yem tasarım. PCHi-c (A) şematik iş akışı -Çekirdek ligasyonu Hi-C41,42 (I) biotinylated RNA yemler (II) ile çözüm hibridizasyon izledi (burada tasvir) insan kısıtlama parçaları hedefleme veya fare gen Rehberleri (III). (B) tasarım PCHi-c için yem. Biotinylated RNA yakalama yemler (kırmızı eğri çizgiler) Organizatörü içeren kısıtlama parçaları (gri; Eğer kısıtlama bulundukları organizatörü dizileri (kırmızı) kendilerini sadece RNA yakalama yemler tarafından hedeflenir Not biter karşı tasarlanmıştır parça biter). Sıra tamamlayıcılık hibridizasyon RNA yem ve DNA hedef arasındaki aracılığıyla izole ve sonraki organizatörü içeren kısıtlama parçaları (gri) ve onların etkileşen kısıtlama parçaları (sarı ve yeşil) oluşan ligasyonu ürünleri biotin streptavidin açılan, A. (C) karşılaştırma PCHi-C yakalama verimliliği organizatörü içeren kısıtlama parçaları için gösterildiği gibi iki RNA yem yakalama problar (şematik b bakınız) bir RNA yem yakalama sonda vs tarafından hedef. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Resim 2 : PCHi-C öncesi sıralama kalite denetimleri. (A) sol, organizatörü ve PIR, bir organizatörü içeren kısıtlama parçası (gri; organizatörü sıra kırmızı) ve bir PIR kısıtlama parçası (sarı) oluşan bir Hi-C ligasyonu üründe sonuçlanan arasında kayma yan yana şematik. Doğru DNA (solda şematik tasvir) belirli astar çiftleri kullanılarak güçlendirilmiş Hi-C ligasyonu ürünlere örnekler gösterilen Elektroforez jel. (B) yaptı, HindIII, NheI ve HindIII/NheI kısıtlama temsilcisi örnekleri digests Hi-C ligasyonu ürünleri (A gösterilen PCR ürünleri). Doğru DNA'ın şematik sıra başarısız takip Hi-C ligasyonu sonra (üst) veya başarılı (alt) dNTP Klenow doldurularak kısıtlama kavşaklar ve sonraki ligasyonu. (C) temsilcisi Hi-C Kitaplığı bioanalyzer profil (1/5 seyreltme). (D) temsilcisi PCHi-C Kitaplığı bioanalyzer profil (seyreltme). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Şekil 3 : PCHi-C sonrası sıralama kalite denetimleri. (A) yüzde geçerli sıralama karşılaştırılması HiCUP43 Hi-C kitaplıklar (Javierre et al.verilerden, 201635) karşılık gelen PCHi-C vs içinde işleme sonra çiftleri okuyun. (B) temsilcisi HiCUP PCHi-C sonuç geçerli gösterilen çiftleri ve aşağı akım analizleri (Javierre et al.verilerden, 201635) önce atılır diğer sıralı Kategoriler okuyun. (C) HiCUP sonra PCHi-C vs Hi-C kitaplıklar (Javierre et al.verilerden, 201635) karşılık gelen işleme yüzdesi 'aynı parça iç' karşılaştırılması okur. (D) karşılaştırma yüzde sırası içeren baited organizatörü parçaları (yakalama verimliliği) PCHi-C vs Hi-C kitaplıklar (Javierre ve ark., 201635verileri) karşılık gelen okur. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Şekil 4: ALAD PCHi-C profili insan hematopoetik hücrelerin. Organizatörü etkileşimleri myeloid hücre tiplerinin mavi kemer gösterilir ve organizatörü etkileşimleri lenfoid hücre tiplerinin mor kemer gösterilir. Erythroblast özel etkileşimleri (Javierre et al.verilerden, 201635) kırmızı oklarla belirtilmiştir. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Şekil 5 : IL8 PCHi-C profili insan hematopoetik hücrelerin. Organizatörü etkileşimleri myeloid hücre tiplerinin mavi kemer gösterilir ve organizatörü etkileşimleri lenfoid hücre tiplerinin mor kemer gösterilir. Monosit özel etkileşimleri yeşil oklarla belirtilmiştir, nötrofil özel etkileşimleri kırmızı oklarla belirtilmiştir ve megakaryocyte özgü etkileşim kahverengi bir okla (Javierre et al.verilerden, 201635) belirtilir. <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">İnsan</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td colspan="3">Sıra</td>
			<td>Kromozom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Başlangıç GRCh38/hg38</td>
			<td>Son GRCh38/hg38</td>
			<td>3 C etkileşimleri ve biotin birleşme sınamak için astar bileşimleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>hs AHF66 Dekker ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>hs AHF64 Dekker ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC odağı</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>hs MYC +1820 ile birlikte veya hs MYC-538 kullanmak</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>hs MYC odağı ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>hs MYC odağı ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>hs HIST1 R ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>hs HIST1 F ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Fare</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Sıra</td>
			<td>Kromozom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Başlangıç GRCm38/mm10</td>
			<td>Son GRCm38/mm10</td>
			<td>3 C etkileşimleri ve biotin birleşme sınamak için astar bileşimleri</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>mm Calr2 ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>mm Calr1 ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>Gapdh4 Dekker ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>Gapdh3 Dekker ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>mm Hoxa13 ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>mm Hoxa7 ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>mm Hist1h3e veya mm Hist1h4i ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>mm Hist1h2ae ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>mm Hist1h2ae ile birlikte kullanın</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Kalite kontrol insan için astar serileri ve fare Hi-C kitaplıklar.

DNA arttırıcılar gibi düzenleyici elemanlarının Gen ifadesinin fiziksel olarak hedef gen rehberleri, sık sık büyük genomik mesafeleri kapsayan uzun menzilli kromozom etkileşimleri aracılığıyla irtibata geçerek kontrol. Organizatörü yakalama Hi-C (PCHi-C) hedef genleri için potansiyel yasal sıralarının atama etkinleştirme rehberleri ve distal bölgeler arasındaki önemli etkileşimler tanımlar.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Transkripsiyonel arttırıcılar gibi düzenleyici elemanlar, uzun menzilli kromozomal etkileşimler yoluyla düzenledikleri hedef genlerinden büyük genomik mesafelerde bulunabileceğinden, Promoter Capture Hi-C'nin amacı, gen düzenleyici unsurları hedef genlerine bağlamaktır. Bu yöntem, bir genomun üç boyutlu mimarisinin gen ekspresyon kontrolünü nasıl etkilediği gibi genom yapısı ve işlevi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çözümden tek bir kısıtlama olan önemli promotör etkileşimlerinin tespit edilmesine izin vermesidir.Bu tekniğin etkileri tedaviye kadar uzanır, çünkü düzenleyici kontrol dizileri içinde veya yakınında kodlamayan hastalık ilişkisel dizi varyantlarını hedef genlerine bağlayabilir. Deneme başına en az 20 milyon hücre ile başlayın. Süspansiyon hücreleri için, hücreleri üç dakika boyunca 400 kez g ve 20 santigrat derecede toplayın ve santrifüjleyin.Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini oda sıcaklığında% 10 FBS ile 30.625 mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra 4.375 mililitre %16 metanol içermeyen paraformaldehiti %2'lik bir nihai konsantrasyona ekleyinHücreleri bir külbütör üzerinde hafifçe karıştırarak oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. 5 mililitre taze hazırlanmış bir molar buz gibi soğuk glisin ekleyerek reaksiyonu söndürün.Oda sıcaklığında hafifçe sallayarak beş dakika karıştırın. Daha sonra ara sıra ters çevirerek 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, süspansiyon hücrelerini beş dakika boyunca 760 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 50 mililitre buz gibi soğuk PBS pH 7.4'te yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri 10 dakika boyunca 400 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücre parçalanmasını takiben, hücre çekirdeklerini 1.25x kısıtlama tamponu 2 ile yıkayın.Bunu yapmak için, peleti bir mililitre buz gibi soğuk tamponda yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş çekirdekleri 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Süpernatanı çıkarmadan önce çekirdeği beş dakika boyunca 760 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Peleti 1790 mikrolitre 1.25x kısıtlama tamponu 2'de yeniden askıya alın.Daha sonra süspansiyonu, her biri 358 mikrolitrede beş ila 10 milyon hücre çekirdeği içeren beş alikota bölün. Alikot başına hacim başına 11 mikrolitre ağırlık% 10 SDS ekleyin ve bir termomikserde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca dakikada 950 devirde çalkalayın. Hücre kümeleri ortaya çıkarsa, kabarcık yapmaktan kaçınarak pipetleyerek bunları ayırın.Daha sonra, alikot başına 75 mikrolitre% 10 Triton X-100 ekleyin ve bir termomikserde 15 dakika boyunca 950 rpm ve 37 santigrat derecede çalkalayın. Alikot başına mikrolitre HindIII başına 12 mikrolitre 100 birim ekleyin. Bir termomikserde 950 rpm'de çalkalarken gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Sindirimi takiben, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kantitatif PCR gerçekleştirin. Daha sonra, alikot başına 60 mikrolitre biyotinilasyon ana karışımı ekleyin ve karıştırın. Alikotları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, her 30 saniyede bir 700 rpm'de beş saniye çalkalayın.Bir saat sonra alikotları buzun üzerine yerleştirin. Hi-C kitaplığını metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi gerçekleştirin. 500 nanogram ile Hi-C kütüphanesinin bir mikrogramı arasında yeni bir tüpe aktarın, ardından numuneyi kuruyana kadar bir vakum yoğunlaştırıcı üzerinde buharlaştırın.3,6 mikrolitre moleküler biyoloji sınıfı su, 2,5 mikrolitre bloker 1, 2,5 mikrolitre bloker 2 ve 0,6 mikrolitre özel bloker ekleyerek buharlaşan Hi-C kitaplığını yeniden askıya alın. Numuneyi yeni bir PCR tüp şeridinin kuyusuna aktarın, PCR başlık şeridi ile kapatın ve numuneyi buzun üzerine yerleştirin. Hi-C DNA için kuyuyu D olarak etiketleyin.Hibridizasyon arabelleğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Tamponu bir termomikserde beş dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Tamponu yeni bir PCR tüp şeridinin kuyusuna aktarın, PCR kapak şeridi ile kapatın ve oda sıcaklığında tutun.Hibridizasyon tamponu için kuyuyu H olarak etiketleyin. Yeni bir PCR tüp şeridi kuyusuna, mikrolitre biyotinile RNA probu, 0.5 mikrolitre SRNase B RNaz inhibitörü ve 1.5 mikrolitre moleküler biyoloji sınıfı su başına beş mikrolitre 100 nanogram karıştırın. PCR tüp şeridini bir PCR başlık şeridi ile kapatın ve buzun üzerine yerleştirin.Tüpü RNA için R olarak etiketleyin. PCR makinesini metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarlayın. Numunenin buharlaşmasını önlemek için PCR makinesi çalışırken tüm prosedürler sırasında mümkün olduğunca çabuk ilerleyin.D PCR tüp şeridini PCR makinesine yerleştirin, PCR makinesinin kapağını kapatın ve PCR reaksiyonunu başlatın. PCR programı 65 santigrat dereceye ulaştığında, PCR makinesinin kapağını açın ve H PCR tüp şeridini PCR makinesine yerleştirin. PCR makinesinin kapağını kapatın ve üç dakika inkübe edin.Ardından PCR makinesinin kapağını açın, R PCR tüp şeridini PCR makinesine yerleştirin ve PCR makinesini kapatın. İki dakika sonra PCR makinesinin kapağını ve tüm PCR tüp şeritlerini açın. 13 mikrolitre H kuyusunu R kuyusuna ve ardından D kuyusunun tamamını R. Reaksiyonu karıştırmak ve PCR tüp şeridini kapatmak için üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.H ve D PCR tüp şeritlerini çıkarın ve PCR makinesi kapağını kapatın. Reaksiyonu 24 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Yeni bir tüpe 60 mikrolitre streptavidin bağlı manyetik boncuk ekleyin.Süpernatanı çıkarmadan önce tüpü manyetik ayırma standına bir dakika yerleştirin. Boncukları 200 mikrolitre 1x bağlama tamponu ile yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında üç dakika ve dönen bir tekerlek üzerinde 15 rpm döndürün. Numuneyi toplamak için tüpü bir tezgah üstü santrifüjde iki ila üç saniye yumuşak bir şekilde döndürün.Tüpü manyetik ayırma standına üç dakika yerleştirdikten sonra, süpernatanı çıkarın. Bu yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra boncukları 200 mikrolitre 1x bağlayıcı tamponda tekrar askıya alın.PCR programı hala çalışırken PCR makinesini ve PCR tüp şeridini açın ve hibridizasyon reaksiyonunu manyetik boncuklarla tüpe aktarın. Reaksiyonu ve boncukları oda sıcaklığında üç rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakika inkübe edin. Manyetik ayırma standındaki boncukları geri alın ve şeffaf süpernatanı çıkarın.Boncukları 500 mikrolitre yıkama tamponu 1 içinde yeniden askıya aldıktan sonra, numuneyi bir termomikserde 950 rpm'de çalkalarken 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Tekrar boncukları geri alın ve şeffaf süpernatanı çıkarın. Şimdi boncukları 500 mikrolitre yıkama tamponu 2 içinde tekrar askıya alın ve karıştırın.Numuneyi bir termomikserde 950 rpm'de çalkalarken 65 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bu yıkamayı yıkama tamponu 2 ile iki kez daha tekrarlayın. Ardından numuneyi manyetik ayırma standına yerleştirin, şeffaf süpernatanı çıkarın ve boncukları 200 mikrolitre 1x kısıtlama tamponu 2 içinde yeniden askıya alın.Boncukları geri kazandıktan ve süpernatanı tekrar çıkardıktan sonra, boncukları 30 mikrolitre 1x kısıtlama tamponu 2'ye yeniden süspanse edin. Bu şekil, 17 insan hematopoietik hücre tipinde IL8 promotörü için promotör yakalama Hi-C etkileşim profilini göstermektedir. Lenfoid hücre tiplerinin promotör etkileşimleri mor arklar ve miyeloid hücre tiplerinin promotör kesintileri mavi arklar olarak gösterilmiştir.Monosit spesifik etkileşimler yeşil oklarla, nötrofil spesifik etkileşimler kırmızı oklarla ve megakaryositlere özgü etkileşimler kahverengi oklarla gösterilir. Bu prosedürü denerken, mümkün olduğunca hassas çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu bir kara büyü değil, ancak uzun bir protokoldür, bu nedenle küçük hatalar sonunda veri kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir.Bu prosedürü takiben, promotör Capture Hi-C tarafından ortaya çıkarılan promotör etkileşim bölgelerinin biyolojik işlevini sorgulamak için CRISPR / Cas9 genomore epigenom düzenlemesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, laboratuvarınızda promotör Capture Hi-C'yi nasıl uygulayacağınızı iyi bir şekilde anlayacağınızı umuyoruz.

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Bu roman proteinler DNA etkileşim belirli hedef loci, çapraz kromatin sonraki proteomik analizleri için yakalanması fingerprinting dayanarak, tanımlamak için bir yöntemdir. Potansiyel proteinler, ne de hücre değişiklikleri hakkında hiçbir ön bilgi gerekli. Başlangıçta Maya için geliştirilen, teknoloji şimdi memeli hücreleri için adapte edilmiştir.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Embriyonik kök hücrelerden üretilen embriyoid cisimlerde yüksek iş eldeli sıralamanın ardından kantitatif kromozom konformasyon yakalama uygulamasını rapor ediyoruz. Bu teknik, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında belirli bir genin putatif arttırıcılar ve promotör bölgeleri arasındaki temasları tanımlamaya ve quantitate sağlar.

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5'i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.

Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Biyologların yalnızca tarayıcı tabanlı araçları kullanarak dokuya özgü gen arttırıcıları tanımlamaları için kodlama gerektirmeyen bir iş akışı sunuyoruz. Protokolümüz, halka açık H3K4me1/H3K27ac histon işaretlerinden ve Hi-C verilerinden yararlanarak, programlama uzmanlığı olmayan araştırmacıların ilgilendikleri genlerle ilişkili potansiyel düzenleyici unsurlara erişmesine, bunları analiz etmesine ve tanımlamasına olanak tanır.

Gen ve dokuya özgü güçlendiricileri seçmek için web tabanlı bir iş akışı

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Öğrenin Promoter Capture Hi-C yöntemiyle gen düzenleyici elemanları hedef genlere bağlama tekniğini. Bu yöntem, genom mimarisinin gen ifadesi kontrolüne etkisini araştırır ve hastalık ilişkili varyantları hedef genlere bağlayarak tedavi potansiyeli sunar.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

Daha fazla video keşfet