Name: Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumunu enterik patojenlerde; yapışma, ekstraselüler matris oluşumu ve dağılma analizleriyle bakteri patogenezinde hayatta kalma mekanizmalarını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Rachael B. Chanin ve Alejandro Llanos-Chea teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski ve Bobby Cherayil bu çalışmada kullanılan suşları için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar Grant K22AI104755 (C.S.F.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>Safra tuzları orta: % 0.4 safra tuzları (ağırlık/hacim) içeren tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak için safra tuzları 200 mg 50 mL resuspend autoclaved tekerlekli sandalye Basketbolu. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Taze orta haftalık olun. Notlar: Safra tuzları rutin olarak kullanılan sodyum cholate ve sodyum deoxycholate ovine ve sığır gallbladders izole bir 1:1 karışımı var. Daha önce4gösterildiği, glikoz varlığı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için gerekli idi. Tekerlekli sandalye Basketbolu glikoz göre Luria-Bertani (LB) suyu ekledi; ve bu nedenle, Shigella ve analiz diğer enterik patojenler biyofilm oluşumu ikna etmek yeterliydi. Analiz edilebilir bakteri bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonu veya farklı şeker gereksinimleri gerekli olabilir.</li>
	<li>%0,5 w/v kristal violet su: 2.5 g kristal violet 500 mL distile suda çözülür. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) Birleşik floresein isothiocyanate (FITC): 1 x PBS stokta Reconstitute. 25 µg/mL nihai bir konsantrasyon PBS'ye 1 x 400 μL ile 10 mg konsantre stok sulandırmak ve ışıktan korumak.</li>
	<li>PBS + glikoz: 10 mL 1 x PBS (%2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>PBS + safra tuzları: 40 mg 10 mL 1 x PBS çözülür (% 0,4 w/v safra tuzları son). Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzları ve 10 mL 1 x PBS (% 0,4 w/v safra tuzları ve % 2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>LB Ağar kaplamalar hazırlayın.</li>
	<li>Formaldehit/oxazolidin düzeltme: ekleme 810 µL formaldehit (% 37 hisse senedi çözüm, % 3 son konsantrasyonu) ve 125 µL oxazolidin (% 25 hisse senedi çözüm, %0.25 son konsantrasyonu) 14 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve 4 ° C'de depolayın Belgili tanımlık saptamak için doğru kullanımı soğuk olmalıdır. Dikkat: Belgili tanımlık saptamak zehirli ve tehlikeli atık bertaraf gerektirir.</li>
	<li>Antifade mountant çözüm: 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke içeren antifade mountant çözüm photobleaching immünfloresan mikroskobu örneklerinin fluorescently bakteri DNA boyama sırasında inhibe için kullanın.</li>
</ol>2. bakteri hazırlanması
<ol><li>TSB 3 mL steril kültür tüp içinde bir tek, iyi izole koloni ile aşı test edilecek bakteri suşlarının gecelik kültürler büyümek. 37 ° C'de gecede kuluçka (16-24 h) için 225 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya. Not: Suşları dondurucu stokları her 2 4 hafta ve üzerinde tutulan plakaları Hayır 2 haftadan fazla restreaked.</li>
</ol>3. katı faz bağlılık tahlil
Not: Bu tahlil yapisan bakteri bir 96-şey plaka yöntemi kullanarak quantifies. Bakteri statik olarak düz dipli levha yetiştirilmektedir. Yapisan bakteri kristal violet ile lekeli ve çamaşır yapışık olmayan bakteriler kaldırmak için gerçekleştirilir. Kristal mor leke peptidoglikan bakteriyel hücre duvarı bağlar ve etanol kullanarak çözündürüldükten. Yapisan bakteri sayısı kristal violet saklama üzerinde bağlı olarak belirlenir.
<ol><li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + safra tuzları (BS) ile.</li>
	<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
	<li>Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim wells (TSB ve tekerlekli sandalye Basketbolu + BS) test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
	<li>130 µL/iyi kültürü aşılamak üç kuyu ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.</li>
	<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kültür plaka hafifçe eğerek ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına orta aspirating bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan bakteriyel nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun. EPS matris kuluçka döneminde üretilen, matris beyaz çökelti görüntülenir. EPS matris rahatsız etmeyin.</li>
	<li>Yavaşça wells bir kez 200 µL steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Kuru için plaka tersine çevirin. En az 20 dk kurumaya izin. Not: biyofilm iyice boyama önce kurutulmuş gerekir beri Protokolü birkaç saat için bu adım, duraklatılmış veya bile gece olabilir. Eksik kurutma sonuçları ve tekrarlanabilirlik miktar etkiler iken eklenen kuruma süresi boyama yordamı değiştirmez.</li>
	<li>%150 0.5 kristal violet için her deneysel µL ve denetimi de ekleyin.</li>
	<li>(RT) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Wells bir kez 400 µL distile su ile yıkayın. Eklenen birim artık kristal mor leke kuyuları taraftan kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama vakum hattı ile kaldırın.</li>
	<li>Wells beş kez 200 µL distile su ile yıkayın. Yıkama vakum hattı ile kaldırın. Not: Ayrıntılı çamaşır miktar için önemlidir. Ne zaman boş wells distile su açık ve herhangi bir kalıntı kristal mor leke içermeyen, sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Kuru için plaka ışıktan korunan tersine çevirin. Yukarıda da belirtildiği gibi plaka tam kurutma emin olun.</li>
	<li>Wells 200 µL % 95 etanol ile destain. Plaka için 30 dk shaker üzerinde kuluçkaya. Özellikle yüksek sıcaklıkta buharlaşma önlemek için bu adım 4 ° C'de uygulayın</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD540kaydedin. Not: Kristal violet maksimum Absorbans için dalga boyu 590 olduğunu nm. Belgeleri OD540 - kristal violet Absorbans için OD5954,13,14,15,16 Aralık raporları; Böylece bir dalga boyu kullanılabilir plaka okuyucu göre seçin.</li>
</ol>4. EPS matris algılama
Not: Bu ücretsiz deneyleri ölçmek ve aka görselleştirin. İkimiz de EPS polisakkaritler bağlamak için bir lektin kullanılarak algılanır. Fluorescently Birleşik protein miktar (Adım 4.1) ve görsel öğeler (Adım 4.2) sağlar.
<ol><li>EPS yarı kantitatif tespiti<ol>
<li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
		<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
		<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
		<li>Bir steril, siyah, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için kuyu eklemek ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar tekrarlayın.</li>
		<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
		<li>Kültür orta açık 96-şey plaka bir pipet, ideal olarak bir çok kanallı pipet ile aktarın. Yapisan nüfus ve/veya plastik yüzeyde bulunan EPS aksatmadan kültür orta toplamak için dikkatli olun. Bir kenara koyun.</li>
		<li>15 dakika siyah plaka RT 200 µL/kuyu formaldehit/oxazolidin 1 x PBS kullanarak düzeltmek.</li>
		<li>Yapisan nüfus tespit ederken, adım 4.1.6 süpernatant kesir değerlendirin. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın.<ol>
<li>Alternatif olarak, tüm tahlil bir siyah açık alt plaka gerçekleştirilebilir. Bu gibi durumlarda aşırı doz600 değerleri kaydedilebilir ve kültür orta daha sonra 4.1.7 adıma devam etmeden önce iptal edilecek. OD600 değerleri verileri normalleştirmek için kullanılabilir durumda büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar vardır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.</li>
		<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama hafifçe eğerek plaka ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına yıkamada aspirating vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
		<li>150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça iki kez 200 µL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>PBS 150 µL her şey için ekleyin. 488, Floresans kaydetmek nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal mikroskobu görselleştirme EPS üretim ve biyofilm kalınlığı hesaplanması<ol>
<li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
		<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
		<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
		<li>Steril bir 24-şey plaka ile 12 mm cam coverslips steril ayarlayın. Boş denetimi hizmet için üç kuyu 400 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
		<li>Yinelenen wells aşısını kültürünün 400 µL eklemek ve tüm deneysel koşullar kaplama kadar tekrarlayın.</li>
		<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
		<li>Görsel olarak TSB koşulu, büyüme ve EPS çökelti (TSB beyaz) + BS koşulu, büyüme ve hiçbir büyüme ve/veya steril kontrol Wells beyaz çökelti onaylayın. Supernatants kaldırın.</li>
		<li>RT 200 µL/iyi formaldehit/oxazolidin çözüm 1 x PBS kullanarak, 15 dk fix.</li>
		<li>Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.</li>
		<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
		<li>150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça iki kez 200 µL/kuyu ile PBS yıkayın.</li>
		<li>Antifade mountant çözüm DAPI ile bağlayın. Not: Aynı anda bir counterstain olarak görselleştirme için bakteri hücrelerindeki DNA boyama sırasında floresan etiket korumak için DAPI içeren bir hazır, gliserol tabanlı bağlama çözüm çözümdür. Kit'in yönergeleri ve önerileri örnekleri Imaging önce kuluçka süreleri için izleyin. Yordam boyama DAPI DAPI içermiyor antifade mountant çözüm uygulanmadan önce gerçekleştirilir.</li>
		<li>Tarafından confocal mikroskobu değerlendirin. Confocal mikroskobunun lazer 495 nm/519 nm uyarma/emisyon FITC görselleştirme için ayarlayın. İkinci bir lazer 360 nm/460 nm uyarma/DAPI görselleştirmek için emisyon için ayarlayın. Biyofilm DAPI kanal üzerinde odaklanarak bulun. DAPI ve FITC kanalları tam kalınlıkta belirlemek ve üst ayarlamak için kullanın ve alt kenarlıklarını görüntüleme. Tam kalınlıkta Z-yığın görüntüleri tarafından esir alma imge her 0.25 µm z yığının altında ve üst için parametreleri ayarladıktan sonra kaydedin. Confocal mikroskobu hakkında daha fazla bilgi için lütfen yayınlar için Paddock ve ark. tarafından bakın. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Tam biyofilm oluşumu görselleştirmek ve biyofilm kalınlığı hesaplamak için ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 3D görüntülerde yeniden. S. flexneri safra-tuz indüklenen biyofilmler için elde edilen ortalama kalınlık 14 µm4oldu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. dağılım tahlil
Not: Bu tahlil biyofilm bakteri dağılımı ile sökme algılanır. Burada, olgun biyofilmler kurulan ve daha sonra (genellikle ertesi gün), medya PBS ile değiştirilir veya PBS desteklenmiştir. Süpernatant bileşeni sonra biyofilm ayrışmış bakteri sayısı quantitate için tabi.
<ol><li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
	<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
	<li>Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyu test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
	<li>130 µL/iyi kültürü aşılamak için üç kuyular ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.</li>
	<li>4-24 h 37 ° C'de plaka statik olarak kuluçkaya.</li>
	<li>Devam etmeden önce sıcak PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + 37 ° c glikoz Bu reaktifler taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kültür bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun.</li>
	<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Aşağıdaki üç kuyu içine 130 µL/iyi yıkamak yerine: PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikoz. Bu reaktifler 37 ° C'ye Önceden ısıtılmış olmalıdır</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk plaka kuluçkaya</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde plaka 37 ° C kuluçka çıkarın. Supernatants bir taze, steril 96-şey tabağa aktarın.</li>
	<li>96-iyi blok, levha veya seyreltme kullanarak hazırlamak 10 kat (1:10) steril PBS içine süpernatant, seri dilutions. Not: Seyreltme serisi su katılmamış 10-6 bağlı olarak test edilecek bakteriyel zorlanma alanı. Pilot deneyler en uygun seyreltme aralığı belirlemek için gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Plaka 5 µL üzerine bir çok kanallı pipet kullanarak LB agar her seyreltme, nokta. 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Koloniler ertesi gün ve seyreltme faktörü hesaba birimleri (CFU) oluşturan kurtarma koloni belirlerken güvenirim. 1 x PBS denetimi (% 100 ayarlamak) göre yüzde dağılımı hesaplamak için 1 x PBS denetimi örneğini kurtarma CFU tarafından her tedavi durum CFU kurtarma bölün. Not: Rutin medya plakaları bakteriyel zorlanma ilgi için de kullanılabilir. Örneğin, Shigella Kongo kırmızısı Tabaklarda kaplama. Tabakları için uygun yer kaplama teknikleri kuru olduğundan emin olun.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Biyofilm oluşumu analizini biyofilmler ve suşları, malzemeleri, laboratuar ve deneyleri arasında değişkenlik dinamik doğası nedeniyle zordur. Burada, çeşitli stratejiler enterik patojenler safra tuzları pozlama deneysel fikir tekrarlanabilirlik tanıtmak için sağlanan takip biyofilm oluşumu belirlemek için sunulmuştur. Tekrarlanabilirlik emin olmak için ek konuları vardır. Her şeyden önce en az üç bağımsız gerçekleştirme her gözlem ve istatistiksel önemi nedeniyle oluşabilir değişim onaylamak için teknik triplicates ile d...

Biyofilm oluşumu sırasında sert çevre koşullarına bağlı bir önemli bakteriyel hayatta kalma stratejisidir. Bakteri yok edici bileşikler maruz gibi antibiyotikler veya besin değişimler ya da oksijen durumu biyofilm oluşumu ile hafifletti bakteri stresli bir durumda neden olmaktadır. Bir biyofilm bakteri eki bir yüzey veya diğer bakteri ile karakterizedir ve öncelikle polisakkaritler1,2,3oluşan bir EPS matris salgı tarafından eşlik eder. Biyofilm oluşumu olayları bir çağlayan bir olgun yapisan bakteriyel topluluk1,2,3oluşumunda culminates dinamik bir süreçtir. Bakteri adhesin gen ifade profilleri eki biyofilm olgunlaşma sırasında güçlendirmek için değişen süre erken ek kolaylaştırmak için adhesins üretir. Aynı anda, EPS üretim kat ilk tetikleyici hücreleri korumak için bir matris bakteriyel toplumda için oluşur. Biyofilm içinde bulunan bakteriler yavaş büyüyen vardır; ve bu nedenle, en antibiyotikler etkisiz vermektedir. Ayrıca, yavaş büyüme Bakteriyel büyüme1,2,3iyilik için koşullar değiştirene kadar enerji tasarruf sağlar. Sert koşulları geçtikten sonra bakteri biyofilm dağıtmak ve planktonik yaşam tarzı1,2,3devam edin. Geleneksel olarak, biyofilmler yüzeylerinde gözlenen ve kalıcı bir klinik meydan okuma nedeniyle enfeksiyon rezervuarlar Kateterler ve konut cihazlar1,2,3mevcut temsil eder.
Biyofilm oluşumu son zamanlarda birkaç enterik patojenler için tanımlanmıştır; ince bağırsak veya iki nokta üst üste4bulaştırmak bakteri. Shigella türleri, enfeksiyonu gastrointestinal sistem çoğunluğu üzerinden transit sonra insan kolonda oluşur. İnce bağırsak yoluyla geçiş sırasında Shigella safra için maruz kalmaktadır; aynı anda birçok bakteri5öldürme süre lipidler hazım kolaylaştırmak için bağırsak içine salgılanan lipid aşağılayıcı deterjan. Enterik patojenler safra6bakteri yok edici etkileri karşı koymak için eşsiz bir yeteneği var. Bizim son analiz vivo içindekullanılan-hangi tarihlerde glikoz ve S. flexneri sağlam biyofilm oluşumu göstermek için safra tuzları birleşimleri yanı sıra diğer türler, Shigella, patojenik Escherichia colive Salmonella4. Daha önce Salmonella enterica serovar Typhi safra kaynaklı bir biyofilm safra kesesi benzersiz kolonizasyon kronik enfeksiyon7,8,9, sırasında nedeniyle oluşturmak için gösterildi 10. Ayrıca, Vibrio11ve Campylobacter12 ile önceki araştırma biyofilm oluşumu yanıt safra olarak gösterdi. Bu nedenle, analizler safra kaynaklı biyofilm oluşumu gözlemler diğer patojenler için genişletilmiş ve safra korunmuş enterik patojen yanıt bir gösteri kurmak için yardım. Bakteriyel gen transkripsiyonu sınırlıdır ve hücre yaşlanma1,2,3oluşabilir kronik biyofilmler enterik safra kaynaklı biyofilm doğada daha geçici öneriyorum. Bu geçici öldürücü biyofilm tarafından hızlı sökme (dağılım assay olarak görüldüğü gibi) hallmarked ve biyofilm nüfus4,6' gözlenen virülans gen ekspresyonu gelişmiş. 
Başlatan bir faktör sadece son zamanlarda en enterik patojenler açıklandığı olduğu gibi çok yönlü, dinamik bir süreç ve safra tuzları kullanımı biyofilm oluşumu olduğu gibi araçları ve teknikleri kullanılan eşsiz ve yaratıcı uygulamalar geleneksel yöntemler vardır. Böylece, burada sunulan üç ücretsiz stratejileri safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu, bakteriyel bağlılık, EPS matris üretimini ve canlı bakteri dağılımı biyofilm üzerinden de dahil olmak üzere birçok önemli özelliklerini ölçmek için vardır. Bu teknikler öncelikle Shigellaile araştırma için kullanılmıştır; ve bu nedenle, en iyi duruma getirme diğer enterik patojenler değerlendirilmesi gerekebilir. Yine de, tüm üç deneyleri olumlu veri tanımlaması biyofilmler destek ve safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için tekrarlanabilir iletişim kuralları kurmak.

<table><tbody><tr><td>Triptik Soya Suyu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Menekşe</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Safra Tuzları</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL kültür tüpleri, 17 x 100 mm, plastik, steril</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield DAPI Vector Laboratories ile sert sertleşen antifade</td><td></td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı 96 oyuklu plakalar (şeffaf)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı 96 oyuklu plakalar (siyah)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı 24 oyuklu plakalar (şeffaf)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller 12 mm, yuvarlak</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu plaka okuyucu</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan plaka okuyucu</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal veya Floresan Mikroskop</td><td>Nikon A1 konfokal mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 derece; C Sallama İnkübatörü</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C Plakalı İnkübatör</td><td>Thermolyne Serisi 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biyofilm oluşumu bakteri sert çevre koşulları veya stresli zamanlarda altında oluşan dinamik, çok aşamalı bir süreçtir. Enterik patojenler için önemli stres tepkisi gastrointestinal transit sırasında ve safra maruz, insan sindirim normal bir bileşeni üzerine indüklenen. Safra bakteri yok edici etkilerini aşmak için birçok enterik patojenler ince bağırsak transit zaman hayatta kalma izni olan bir biyofilm oluştururlar. Burada metodolojileri biyofilm oluşumu katı fazlı bağlılık deneyleri gibi hücre dışı polimer madde (EPS) matris algılama ve görselleştirme ile tanımlamak için mevcut. Ayrıca, biyofilm dağılım değerlendirme serbest bırakmak-in bakteri enfeksiyonu işlemi sırasında tetikleme olayları analiz taklit etmek için sunulmaktadır. Kristal violet boyama bir yüksek-den geçerek 96-şey plaka bağlılık tahlil yapisan bakteri tespit etmek için kullanılır. EPS üretim değerlendirme iki deneyleri tarafından belirlenir Yani mikroskobu EPS matris ve yarı kantitatif analiz fluorescently Birleşik polisakkarit bağlayıcı lektin ile boyama. Son olarak, biyofilm dağılım koloni sayıları ve kaplama ile ölçülür. Birden çok testleri pozitif verilerden biyofilmler karakterizasyonu destek ve diğer bakteri suşları safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu tanımlamak için kullanılabilir.

Şekil 1' de, altı enterik patojenler sınanan aşağıdaki büyüme medyada safra tuzları içeren çoğunda biyofilm oluşumu indüklenen. Safra tuzları pozlama neredeyse tüm suşların görülmektedir sonra yapisan bakteri önemli bir artış test. İstisnadır enteroaggregative E. coli (olursa); ancak, Δaaf mutant4indüklenen gözlenmesi unutmayın. Ek bağlılık mekanizmaları olursa safra tuzları pozlama aggregative bağlılık akta...

Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Bu biyofilm oluşumu ve değerlendirme protokolünün genel amacı, enterik bakteriyel patojenlerin, özellikle gastrointestinal geçişi ve safra tuzlarına maruz kalmayı taklit eden koşullarda bir biyofilm oluşturma yeteneğini belirlemektir. Yöntemler, enterik patojenlerin gastrointestinal sistemin sert safra tuzu koşullarında hayatta kalma yeteneği gibi bakteriyel patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniklerin temel avantajı, üç tahlilden elde edilen birleşik sonuçların, her bir patojen için safra tuzu maruziyetine yanıt olarak biyofilm oluşumunun derinlemesine karakterizasyonunu desteklemesidir.İlk olarak, Shigella flexneri'de safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumunu tam olarak ölçme ihtiyacı göz önüne alındığında, kombine yöntemler fikrine sahiptik. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü testin bazı yönleri tekrarlanabilirliği sınırlayabilir. Bu nedenle, tekrarlanabilirliği sağlamak için lütfen kritik adımlara dikkat edin.Prosedürleri göstermek laboratuvarımdan, doktora sonrası araştırmacı Kourtney Nicherson ve klinik araştırma görevlisi Alejandro Llanos'tan üyeler olacak. İlk olarak, iki adet 1.5 mililitrelik tüpü T

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol...

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları...

Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Video, biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz yapışma testini göstermektedir. Çok kuyucuklu bir plakada, safra tuzu takviyeli ortamdaki bakteriler katı yüzeylere yapışarak biyofilmler oluşturur, bu da kristal viyole boyama ve etanol muamelesi yoluyla kolorimetri ile doğrulanır.

Biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz uyum testi

Bu video, safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumunu ölçmek için floresan tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Patojenik bir enterik bakterinin kültürüne safra tuzlarının eklenmesi üzerine, biyofilmin hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisindeki polisakkaritlere bağlanan bir floresan lektin kullanılarak biyofilm üretimi tespit edilir.

EPS Matris Tespiti ile Safra Tuzu ile İndüklenen Biyofilm Oluşumunu İncelemek İçin Bir Test

Video, çok kuyulu bir plaka kullanan bir biyofilm dispersiyon testini göstermektedir. Tampon ve glikoz tedavisi biyofilmi parçalarına ayırarak bakterileri serbest bırakırken, safra tuzları strese neden olur ve bakterileri koruyucu hücre dışı polimerik maddede tutar. Tampon ve glikoz ile daha yüksek dispersiyon, koloni oluşturan birimler ölçümü ile tahmin edilen başarılı biyofilm sökme işlemini doğrular.

Bir Dispersiyon Testi ile Biyofilm Demontajının Tespiti

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bu protokol, süt endüstrisinde biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için statik ve dinamik yöntemleri birleştiren bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Keşfedin safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumunu enterik patojenlerde; yapışma, ekstraselüler matris oluşumu ve dağılma analizleriyle bakteri patogenezinde hayatta kalma mekanizmalarını inceleyin.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Daha fazla video keşfet