Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Bu biyofilm oluşumu ve değerlendirme protokolünün genel amacı, enterik bakteriyel patojenlerin, özellikle gastrointestinal geçişi ve safra tuzlarına maruz kalmayı taklit eden koşullarda bir biyofilm oluşturma yeteneğini belirlemektir. Yöntemler, enterik patojenlerin gastrointestinal sistemin sert safra tuzu koşullarında hayatta kalma yeteneği gibi bakteriyel patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tekniklerin temel avantajı, üç tahlilden elde edilen birleşik sonuçların, her bir patojen için safra tuzu maruziyetine yanıt olarak biyofilm oluşumunun derinlemesine karakterizasyonunu desteklemesidir.

İlk olarak, Shigella flexneri'de safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumunu tam olarak ölçme ihtiyacı göz önüne alındığında, kombine yöntemler fikrine sahiptik. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü testin bazı yönleri tekrarlanabilirliği sınırlayabilir. Bu nedenle, tekrarlanabilirliği sağlamak için lütfen kritik adımlara dikkat edin.

Prosedürleri göstermek laboratuvarımdan, doktora sonrası araştırmacı Kourtney Nicherson ve klinik araştırma görevlisi Alejandro Llanos'tan üyeler olacak. İlk olarak, iki adet 1.5 mililitrelik tüpü TSB ve TSB artı BS olarak etiketleyin. Daha sonra ilgili tüplere bir mililitre TSB veya TSB artı BS ekleyin. Daha sonra, tüpleri bir ila 50 seyreltmede 20 mikrolitre gece boyu kültür ile aşılayın.

Daha sonra, steril, berrak, düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş, 96 oyuklu bir plakadaki üç oyuğun her birine 130 mikrolitre aşılanmamış kontrol ortamı ekleyin. Bu boş kontrol olacaktır. Üç kuyucuğun her birine 130 mikrolitre aşılanmış kültür ekleyin.

Kontrolü ve aşılanmış kültürü ilgili kuyucuklara ekledikten sonra, 96 oyuklu plakayı statik olarak 37 santigrat derecede dört ila 24 saat inkübe edin. İnkübasyon bittiğinde, kontrolü plaka okuyucuda boş olarak ayarlayın. Ardından, kültür ortamını her bir kuyucuktan aspire edin.

Daha sonra kuyuları bir kez 200 mikrolitre steril PBS ile nazikçe yıkayın. Yıkadıktan sonra, PBS'yi aspire edin ve ardından plakayı yaklaşık 20 dakika kuruması için ters çevirin. EPS matrisinin bozulmamasını sağlamak için ortamın nazikçe çıkarılmasını ve nazikçe yıkanmasını sağlamak çok önemlidir.

Daha sonra, deney ve kontrol kuyularının her birine 150 mikrolitre% 0.5 kristal menekşe ekleyin. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, kuyuları bir kez 400 mikrolitre damıtılmış su ile yıkayın.

Kuyuları beş kez yıkamak için 200 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Beş yıkamanın hepsinden sonra, plakayı ters çevirin ve ışıktan koruyarak tamamen kurumasını bekleyin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için, devam etmeden önce numunelerin iyice kurutulması önemlidir.

Plaka tamamen kuruduktan sonra, kuyucukların lekesini çıkarmak için 200 mikrolitre% 95 etanol kullanın. Ardından, buharlaşmayı önlemek için plakayı çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede 30 dakika bekletin. 30 dakika sonra OD 540'ı plaka okuyucuya kaydedin.

EPS'nin yarı kantitatif tespiti için, kültür ortamını 96 oyuklu şeffaf bir plakaya aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından, siyah plakayı oda sıcaklığında 15 dakika sabitlemek için 200 mikrolitre sabitleme reaktifi kullanın. Şimdi standardizasyon için kontrolü ve boşluğu ayarlayarak OD 600 okumasını kaydedin.

Ardından, bağlı popülasyon sabitlenirken kültür ortamının okumasını kaydedin. Sabitleme tamamlandıktan sonra, reaktifi çıkarın ve tehlikeli atıkları atın. Daha sonra kuyuları iki kez nazikçe yıkamak için 200 mikrolitre steril PBS kullanın.

Yıkadıktan sonra PBS'yi aspire edin. Daha sonra mililitre ConA-FITC başına 150 mikrolitre 25 mikrogram ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Kuluçka sonrası, kuyuları 200 mikrolitre PBS ile nazikçe yıkayın. Daha sonra her oyuğa 150 mikrolitre PBS ekleyin ve floresansı 488 nanometrede kaydedin. Taze reaktifleri hazırladıktan sonra, PBS'yi, PBS'yi glikozla, PBS'yi safra tuzlarıyla ve PBS'yi glikoz ve safra tuzlarıyla 27 santigrat dereceye ısıtın.

Ardından, gece boyunca biyofilm plakasından gelen OD 600 değerlerini, kontrolü boş olarak ayarlayarak plaka okuyucuya kaydedin. Daha sonra, plastik yüzeydeki yapışkan popülasyonu rahatsız etmeden bir vakum hattı kullanarak kültür ortamını aspire edin. Kuyuları 200 mikrolitre steril PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.

PBS ile yıkadıktan sonra, üç oyuğun her birine önceden ısıtılmış PBS'den 130 mikrolitre, glikozlu PBS, safra tuzları ile PBS ve safra tuzları ve glikozlu PBS ekleyin, ardından plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, plakayı inkübatörden çıkarın. Süpernatanı taze, steril, 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin.

Son olarak, 96 oyuklu plakada veya bir seyreltme bloğunda PBS ile süpernatantın bir ila 10 seri seyreltmesini hazırlayın. Ardından, her seyreltmenin beş mikrolitresini LB agar plakalarına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, koloni sayısını sayın. Çubuk grafiği, enterik patojenlerde safra tuzuna bağımlı biyofilm oluşumunu ölçmek için elde edilir. Bu, ortamda safra tuzlarının varlığında ve yokluğunda tek tek suşların OD 540 değerlerinin çizilmesiyle yapılır.

Grafik, Enteroaggrative E.Coli hariç çoğu patojen suş için biyofilm oluşumunda önemli bir artış göstermektedir. Daha sonra, biyofilm oluşumu sırasında üretilen EPS, EPS tarafından tutulan ConA-FITC miktarı belirlenerek tespit edilir. Çubuk grafiği, safra tuzlarının varlığında önemli ölçüde artmış floresan okumasını gösterir.

Bu, patojen Shigella flexneri için EPS üretimini doğrular. Burada, EPS matrisinin ConA-FITC'ye bağlı boyanması, safra tuzlarına maruz kaldığında önemli ölçüde yüksektir. Bu, polisakkarit bakımından zengin EPS matrisi ile karakterize edilen bakteriyel biyofilm oluşumunu gösterir.

Bakteri DNA'sının FITC'ye bağlı özgüllüğünü ve varlığını göstermek için sırasıyla bir X PBS ve DAPI kullanılır. Son olarak, bakterilerin biyofilmden safra tuzuna bağlı dağılımını analiz etmek için koloni oluşturan birimlerin sayısı sayılır. Grafik, bakterilerin PBS ve PBS'deki biyofilmlerden glikoz ile kolayca dağıldığını göstermektedir.

Bununla birlikte, bakterilerin safra tuzlarına maruz kalması, biyofilmlerden dağılmasını büyük ölçüde engeller. Bu tahliller, kolondaki enfeksiyondan önce ince bağırsakta safra tuzu maruziyetine yanıt olarak enterik patojenler, özellikle Shigella flexneri tarafından oluşturulan geçici virülan biyofilmleri yakalamak ve ölçmek için geliştirilmiştir. Baz ortam tipleri, kullanılan safra tuzlarının bileşimi ve bakteri üreme koşulları gibi tahlillerde yapılan değişikliklerin, gastrointestinal sistem içindeki enfeksiyon bölgesine bağlı olarak farklı patojenler için ayarlanması gerekebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz bakteri veya mutant suşunuzdaki biyofilm oluşumunu kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için her bir tahlilin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Patojenlerle ve bazı solüsyonlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu testler yapılırken uygun kullanım ve bertaraf yöntemleri gibi önlemler her zaman göz önünde bulundurulmalıdır.

Ayrıca, taze safra tuzu ortamının hazırlanması, uygun kontroller ve deneysel tekrarlanabilirliğin sağlanması, safra tuzunun neden olduğu biyofilm fenotipinin veri analizi ve doğrulanması için hayati önem taşır. Geleneksel yöntemlerin benzersiz ve yaratıcı yüksek verimli uygulamaları olan teknikler, enterik patojenlerde safra tuzunun neden olduğu biyofilm oluşumunun çok yönlü ve dinamik sürecinin uygun şekilde ölçülmesini sağlayacaktır.