Toprak örnekleri Multi-omic analizleri için karmaşık iletişim kuralı

Bu yöntem, çevresel bozulmalar nedeniyle toprakla ilişkili mikrobiyal topluluklarda meydana gelen moleküler değişiklikler hakkında kapsamlı bilgi elde etmeye yardımcı olarak proteomik, metabolomik ve lipidomik alanlarda kullanılır. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir toprak numunesinden birden fazla analit elde edilmesinin, numune hazırlama süresini ve çabasını azaltırken hassasiyeti ve doğruluğu artırmasıdır. Başlamak için, her 20 gramlık toprak numunesi için, iki ayrı 50 mililitrelik metanol / kloroform uyumlu tüpe 10 gram tartın.

PTFE'den yapılmış plastik tüpler kullanın, çünkü kloroform çoğu plastiği süzerek numuneleri kirletecektir. Her tüpe yaklaşık 10 mililitre kloroformla yıkanmış paslanmaz çelik ve granat boncuk ekleyin. Ardından, buz üzerindeyken, her tüpe dört mililitre soğuk ultra saf su ekleyin ve numuneleri bir buz kovası içinde bir davlumbaz içine aktarın.

25 mililitrelik bir cam serolojik pipet kullanarak, tüplere metanol hacmine/hacmine hızlı bir şekilde 20 mililitre buz gibi iki ila bir kloroform ekleyin. Kapakları sıkın ve toprak karışımını çözeltiye girdaplayın. Kloroform-metanol, prokaryotların hücre duvarını parçalamaya yardımcı olur ve ayrıca enzimatik aktiviteleri etkisiz hale getirir.

Daha sonra, tüpleri 50 mililitrelik tüp girdap eklerine takın ve mümkünse bir buzdolabının içinde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yatay olarak girdap yapın. Ardından, numuneleri tamamen soğutmak için yaklaşık 15 dakika negatif 80 derecelik bir dondurucuya koyun. Ardından, bir çeker ocak içinde bir prob sonikatörü kullanarak, her bir numuneyi buz üzerinde 30 saniye boyunca% 60 genlikte altı milimetre, 1/4 inçlik bir prob ile sonikleştirin.

Sonikasyonun ardından, sonikasyon çok fazla ısı üretebileceğinden, numuneleri negatif 80 derece Santigrat dondurucuya yerleştirin. Yatay girdap, sonikasyon ve dondurma adımlarını tekrarladıktan sonra, numuneleri beş dakika boyunca 4.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Bu noktada, numune üst metabolit tabakasına, protein ara tabakasına ve alt lipit tabakasına ayrılacaktır.

Numuneleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, bir çeker ocak içinde, üst metabolit katmanlarını iki 50 mililitrelik tüpten tek bir büyük cam şişeye aktarmak için 10 mililitrelik bir cam serolojik pipet kullanın. Şimdi, protein ara katmanını serbest bırakmak için 50 mililitrelik tüpü hafifçe eğin, böylece alt lipit tabakası üzerinde serbest yüzer

Ardından, temiz bir paslanmaz çelik düz başlı laboratuvar spatulası kullanarak, her iki protein ara katmanını dikkatlice alın ve bunları 50 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin. 25 mililitrelik bir cam serolojik pipet kullanarak, alt lipit katmanlarını büyük bir cam şişeye aktarın. Enkaz içeren iki tüpe ve protein ara tabakası olan bir tüpe 20 mililitre buz gibi soğuk metanol ekleyin.

Tüpleri kısaca girdaplayın ve enkaz peletlerini ve protein ara katmanını beş dakika boyunca 4.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, metanolü çeker ocak içindeki tehlikeli bir atık kabına boşaltın. Protein ve döküntü peletlerini sıvı nitrojen içinde dondurun ve yaklaşık iki saat boyunca bir liyofilizatörde kurutun.

Enkaz peletlerinin her birine 50 milimolar tris tamponunda, pH 8.0'da 20 mililitre protein çözündürme tamponu ve protein ara katman tüpüne 10 mililitre ekleyin. Çeker ocakta, numuneleri çözelti haline getirmek için 30 saniye boyunca% 20 genlikte sonikasyon yapın. Örnekleri iki dakika boyunca girdaplayın.

Ardından, proteini çözündürmek için protein ara katman örneğini 30 dakika boyunca 50 santigrat derecede bir laboratuvar tüpü döndürücüsüne yerleştirin. Kalan sağlam hücreleri parçalamak için enkaz örneklerini 10 dakika daha yatay olarak girdaplayın. Ardından, kalan 20 dakika boyunca protein ara katman örnekleriyle döndürün.

Tüm numuneleri 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yerçekiminin 4.500 katı sıcaklıkta santrifüjleyin ve süpernatanı numune başına her tüpten iki adet 50 mililitrelik tüpe toplayın. Protein ara katman peletine 10 mililitre çözündürme tamponu ekleyin. Ardından, peleti tekrar çözeltiye sonikasyon yapın ve girdaplayın.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanları iki 50 mililitrelik tüpe enkaz pelet süpernatantları ile eşit şekilde birleştirin ve kalan kalıntıları peletlemek için tüpleri 8.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca sabit açılı bir kova rotorunda santrifüjleyin. Süpernatanları iki adet 50 mililitrelik tüpe bölün. Daha sonra, 10 mililitrelik bir cam serolojik pipet kullanarak, her tüpe 7,5 mililitre TCA ekleyin.

Numuneleri çözeltiye vorteksleyin. Ardından, numuneleri iki saat ila gece boyunca negatif 20 santigrat derece dondurucuya koyun. Çökeltilmiş proteini peletlemek için, numuneyi 10 dakika boyunca yerçekiminin 4.500 katı ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatanı atığa boşaltın.

Her protein peletine 10 mililitre %100 buz gibi soğuk aseton ekleyin. Tüpleri girdaplayın ve topaklar gibi tek bir tüpte birleştirin. Asetonu santrifüjleyin ve ardından boşaltın.

Daha küçük bir aseton hacmi kullanarak, peleti iki kez yıkayın ve son sıkma için süspansiyonu 1,5 veya iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Süpernatanı atığa boşaltın ve peletin bir kağıt üzerinde ters çevrilmiş olarak kurumasını bekleyin, çeker ocakta yaklaşık 20 dakika. Peletin boyutuna bağlı olarak, 100 ila 200 mikrolitre protein çözündürme tamponu ekleyin.

Petikleri sonikat ve çözelti içine girdap. Numunenin, daha sonraki bir santrifüjleme ile uzaklaştırılacak olan protein ile birlikte çökelen hümik maddeler nedeniyle viskoz olabileceğini unutmayın. Son olarak, protein sindirimine veya gelecekteki işlemler için ani dondurmaya devam etmeden önce proteini çözelti içinde çözündürmek için numuneyi bir inkübatörde veya çalkalayıcıda 30 rpm ve 40 santigrat derecede 30 dakika çalkalayın.

Bu videoda gösterilen MPLEx protokolü kullanılarak, Kansas doğal çayır toprağından 3.376 peptit, 105 lipid ve 102 polar metabolit ekstrakte edildi ve protokolün protein ekstraksiyonu, ters fazlı LC-MS / MS kullanılarak protein ekstraksiyon kitleri ve SDS ekstraksiyonları ile karşılaştırıldı. Başlangıçta ticari protein ekstraksiyon kiti ve SDS yöntemlerinin üç kopyası karşılaştırıldığında, peptitlerin sadece% 12'si iki teknik arasında örtüştü, bu da mikrobiyal topluluğun karmaşıklığını ve farklı ekstraksiyon etkilerini gösterdi. MPLEx'in ticari bir protein ekstraksiyon kiti ve SDS ekstraktları ile karşılaştırılması üzerine, MPLEx yöntemi kullanılarak gözlemlenen peptitlerin yaklaşık% 38'i, SDS ve / veya ticari kit ekstraksiyonları kullanılırken de tespit edildi.

Kansas toprak bakteri topluluğundaki türlerin sayısı ve metagenomu göz önüne alındığında, peptit tanımlamalarının örtüşmesi makuldür. Burada gösterildiği gibi, MPLEx yaklaşımının geniş uygulanabilirliği daha önce bir unisiyanobakteri konsorsiyumu olan archaeon S.acidocaldarius, fare beyin korteks dokusu, insan idrarı ve A.thaliana yaprakları kullanılarak değerlendirilmiştir. Tüm durumlarda, MPLEx yönteminden gözlemlenen protein sayısı, kontroller için olana benzerdi ve bu da birçok farklı numune türü için faydasını gösteriyordu.

Bu videoyu izledikten sonra, tek bir toprak örneğinden proteinlerin, metabolitlerin ve lipitlerin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, tüm toprak türleri farklı olduğu için esnek olmak önemlidir. Örneğin, protein ara tabakasının boyutu, toprakta bulunan toprak biyokütlesine ve hümik maddelere bağlı olarak değişecektir.

Kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü denerken çeker ocakta çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.