Name: Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin, TUNEL ve Caspase 3/7 analizi kullanarak kurbağalarda kitridiyomikoz enfeksiyonuna bağlı epidermal hücre ölümünü nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, küçük doku örneklerinde apoptotik süreçleri değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz hayvancılık ve veri toplama ile destekli aşağıdaki insanlar teşekkür: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, i. Harney ve T. Knavel; ve M. Merces diseksiyonlarının hakkında yardım almak için. Ayrıca M. McFadden, P. Harlow ve L. v. alpinayetiştirmek için Taronga Zoo ve G. Marantelli P. corroboreeyetiştirmek için teşekkür etmek istiyorum. F. Pasmans, A. Martel apoptosis deneyleri, C. ı. Konstantin, A. Kladnik ve R. Webb tünel tahlil, hakkında yardım almak için tavsiye için teşekkür ederiz ve T. Emeto ve W. Weßels için protokol ve caspase 3/7 tahlil için kiti ile yardımcı olur. Bu el yazması ve protokol Brannelly ve ark 2017 Eş J22. adapte

James Cook Üniversitesi L. v. alpinauygulamalarda A1875 P. corroboree ve A1897 ve A2171 için hayvan etik onayladı.
1. hayvancılık ve izleme
<ol><li>Hayvan besleme ve zamanlama temizlik uygun bir su ile türler için uygun bir ortamda tek tek, ev. Hayvanlar her gün kontrol edin.<ol>
<li>Kritik tehlike altında Pseudophryne corroboree yetişkin bireylerin (tünel tahlil için Bölüm 4) kullanın ve tehdit Magno16 verreauxii alpina (Caspase 3/7 tahlil için Bölüm 5), bağışlanan esir İmkanları ıslahı. 15-18 ° C'de hayvanlar üzerinde bir yosun korumak ve substrat çakıl, onları günlük ters osmoz su ile sis ve 3 kez haftalık yüklü gut cırcır ile beslemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Veri üzerinde tek tek her bir kez haftalık toplamak. Bireyler için Bd adım 2.1 içinde açıklandığı gibi temizle. Her hayvan için bir ölçek kullanarak neared 0.1 g tartmak ve arama destekleri kullanarak en yakın 0,01 mm uzunluğa (SVL) havalandırma için onların burun ölçün.</li>
	<li>(Bölüm 3 açıklandığı gibi) aşı sonra hayvanlar hayvan etik kuralları ile uyumlu (düzensiz cilt slough, inappetence, bacak kızarıklık, uyuşukluk veya gecikmeli iyileştiren refleks) enfeksiyonunun klinik belirtiler için her gün kontrol edin. Klinik belirtiler ve morbidite varsa hayvanlara ötenazi.<ol>
<li>Tricaine methanesulfonate (MS222) aşırı dozda ötenazi (% 0,1 w/v-MS222 pH 6-7 yaşında musluk suyu sodyum bikarbonat ile). Hayvanlar MS222 içinde 10 dk sonra hareket durur ve uyaranlara yanıt görüntülemek için tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. test Bd enfeksiyon için
<ol><li>Bd için ev temizliği
	<ol>
<li>Her hayvan yeni bir steril Rayonu bez (hayvan başına bir çubukla) ile temizle. Aşağıdaki swabbing yöntemini kullanın: beş kez venter, beş kez her uyluk, yan ve bacak. Toplam 45 vuruşları bu.</li>
		<li>Yavaşça çubukla sırasında ve DNA'ın etkili yakalama sağlamak için vuruş arasında döndürün. 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine çubukla ucunu kesiyorum ve ayıklama kadar-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA ekstraksiyon ve qPCR tahlil<ol>
<li>Genomik DNA bezlerden piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon reaktif 50 µL 30-40 mg 0,5 mm silis boncuk ile ekleyerek ayıklayın. Boncuk boncuk çırpıcı hücre bölücü 2 min için maksimum hızda örnekleri yendi. Boncuk çırpıcı adım 2.000 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Örnekleri 10 dk 100 ° C'de kuluçkaya ve soğumasını bekleyin. 5000 x g 3 dk de örnekler santrifüj kapasitesi ve sonra süpernatant bireysel 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri için aktarın ve qPCR kadar-20 ° C'de depolayın.</li>
		<li>Kantitatif PCR (qPCR) Boyle vd. aşağıdaki kullanın 200418 enfeksiyon yük çözümlenecek. Aşağıdaki değişiklikler kullanın:<ol>
<li>DNA ekstraksiyon örnekleri 6:100 Çift Kişilik deiyonize suyla seyreltik. Sığır serum albumin (BSA) 0.7 µL PCR inhibisyon önlemeye yardımcı olmak için her şey için ekleyin. Her örnek içinde singlicate çalıştırın. Her plaka üzerinde bir negatif (şablon yok) ve olumlu bir denetimi seyreltme standartlar bir dizi zoospore (enfeksiyon) yük tahmin etmek için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. aşı
<ol><li>Kültür Bd
	<ol>
<li>Kültür tryptone 16 g, 2 g jelatin hidrolizat ve laktoz (TGHL) 4 g 1 litre deiyonize su ekleyerek suyu hazırlayın. Otoklav (121 ° C 40 dk) ve suyu soğutmak izin verir.</li>
		<li>Bu durumda (New South Wales ayrı tut, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, geçiş--dan 11 numaralı izole,) BD izole aşılamak bir TGHL et suyu içinde ve 23 ° c 7 d için büyümek, sonra et suyu kültür TGHL Ağar kaplamalar için transfer.</li>
		<li>Levha yapmak için 1 litre deiyonize su ve basınçlı kap (121 ° C 40 dk) tryptone 16 g, 2 g jelatin hidrolizat, laktoz (TGHL), 4 g ve bakteriyolojik agar 10 g ekleyin. Öylesine onlar are karışımı dokunmak serin olduğunda, ancak önce bu katılaşır, TGHL agar 92 mm çap kültür plakaları dökmek bir sınıf II biyolojik güvenlik kabin 1/4-1/3 tam.</li>
		<li>Ne zaman agar katılaşmış ve tamamen soğutmalı, Bd sıvı suyu üzerinden 0.5 mL ile her plaka aşılamak ve eşit yayılmış. Yaklaşık 1 h için plaka üzerinde kuru ve ardından plastik parafin film ile plakalarının Bd suyu karışım izin verin. 23 ° c 5-7 d için aşağı plakaları agar yan kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaplamalar, zoospore aşı çözüm için sel<ol>
<li>Zoospore motilite her gün önce aşı canlılığı sağlamak için bir ters ışık mikroskobu altında kontrol edin. Zoospore yayın birçok zoospores dışında sporangia yüzme ile yüksek, kültür aşı için hazır olduğunda.</li>
		<li>Yaşlı musluk suyu veya yapay göl suyu, 3 mL ile her tabak tabak su dökme ve suya serbest bırakmak zoospores izin vermek 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka tarafından sel. Kuluçka dönemi sonra zoospore süspansiyon yeni bir steril konteyner içine dikkatle boşaltmak.</li>
		<li>Zoospore toplama bir haemocytometer kullanarak üreticisinin yönergeleri izleyerek tahmin ediyoruz. Zoospore süspansiyon konsantrasyon bilinen sonra 1 x 106 zoospores yaşında musluk suyu ile 3 mL başına bir konsantrasyon için süspansiyon oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvanlar aşılamak<ol>
<li>Her hayvan inoculum karışımı dökerek 3 mL tarafından bireysel 50 mL kaplarda onun venter19 üzerinde aşılamak. Aşı konteyner üsse doğru toplamak fazla inoculum izin verir. Her hayvan enfeksiyon sağlamak 24 h için bireysel aşılama kapsayıcısında ayrılıp 24 h aşı sonra her birey için dezenfekte terrarium dönmek.<ol>
<li>Terraria % 13 birim/birim (v/v) ticari çamaşır suyu çözüm20kullanarak dezenfekte, en az iki kez su ile durulayın, sonra en az 24 saat kurumasını sağlar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bdiçin-negatif denetimleri, sahte olduğu gibi 3.2-3.3, aynı yöntemlerle hayvanları aşılamak ama Bdsel-ücretsiz Ağar kaplamalar 5 mL de yaşlı musluk suyu ile bunun yerine Bd Ağar kaplamalar aşılandı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. tünel tahlil
<ol><li>Adım 1.3.1 ve Bdeşit sayıda bölümünde açıklandığı gibi chytridiomycosis, klinik belirtileri gösteren hayvanlar ötenazi-negatif kontrol hayvanlar.</li>
	<li>Cilt teşrih (dorsal, ventral ve uyluk) her hayvan örnekleri. Deri örnekleri için 2 h % 4 v/v tamponlanmış fosfat formaldehit düzeltmek. Kısa ve tutarlı zaman sabitleme tam olarak düzeltilmesi, doku sağlar ama aynı zamanda etkili ve doğru immünhistokimya boyama için sağlar. O zaman % 80 etanol için kesit için gömme kadar transferi.</li>
	<li>Cilt parafin standart yöntemleri21histolojik hazırlık için göm. Kısaca, iletişim kuralı aşağıdaki gibidir:<ol>
<li>Etanol kademeli bir dizi dokularda kurutmak ve etanol Ksilen ile temizleyin. Doku parafin balmumu katıştırmak ve her bireyin bir parafin blok için tüm üç deri örnekleri yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standart histolojik hazırlık21takip bir microtome kullanarak bölümü cilt. Doku seri olarak 5 mikron, bölüm ve hidrofilik cam slaytlara yapıştırmayın. Dört seri histosections slayt başına cilt tipine yerleştirin. Seri deri bölümleri ile birey başına üç slayt yapmak, her slayt yapıştırılmış her doku dört bölümü vardır unutmayın.</li>
	<li>Aşağıdaki sırada slaytlar leke:<ol>
<li>İlk slayt Hematoksilen Eozin (H & E) counterstaining tarafından takip ile leke. Bu slayt Bd sporangia cilt içinde konumunu görselleştirmek etmektir.</li>
		<li>Piyasada bulunan bir tünel tahlil histolojik hazırlık için aşağıdaki ikinci slayt leke ve aşağıda açıklanan üreticisinin yönergelerini izleyin.<ol>
<li>İlk olarak, Ksilen yıkama başına 5 min için üç değişikliklerle slaytlar yıkayarak coplin kavanoz doku bölümlerde deparaffinize ve 5 min için % 100 etanol iki değişiklik ile her yıkama izleyin. PBS bir yıkama 5 min için ile % 95 etanol 3 dakika ve sonra % 70 etanol 3 dk. bitirmek için bir yıkama ile izleyin.</li>
			<li>Taze seyreltilmiş protein sindiren enzimi (İndinavir K 20 μg/mL PBS içinde seyreltilmiş bir konsantrasyon,) ile doku pretreat ve doğrudan slayda ekleyin. PBS için 2 dk coplin kavanozda iki değişiklik ile 15 dk. yıkama için kuluçkaya olanak sağlar.</li>
			<li>Aşırı sıvı dokunun ve %3.0 hidrojen peroksit PBS için oda sıcaklığında 2 dk coplin kavanozda gidermek. İki kez PBS ile beş dakikalığına her yıkama durulama.</li>
			<li>Aşırı sıvı ve ardından slayt üzerinde 75 µL/5 cm2 doğrudan doku üzerine denge tamponunun geçerli. Bölümün çevresinde aşırı sıvı dışında 10 s. dokunun için kuluçkaya ve terminal deoksinükleotidil tranferase (TdT) enzim çalışma 55 µL/5 cm2 uygulayın. 37 ° C'de 1 h için oksijen odasında kuluçkaya</li>
			<li>Slayt çalışma gücü stop/yıkama arabellek, bir coplin kavanoza koyup TdT kuluçka sonra 15 için kışkırtmak s ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. Slayt yıkama başına 1 dk. için PBS üç değişiklikler ile yıkayın. Aşırı sıvı dokunun.</li>
			<li>Doku, 65 µL/5 cm2oda sıcaklığına için sıcak anti-digoxigenin eşlenik (rodamine) uygulanır. Oda sıcaklığında 30 dakika oksijen odasında kuluçkaya ve ışığa maruz kalma önlemek. PBS dört değişiklikleri yıkama başına 2 dakika yıkayın. Aşırı sıvı dokunun.</li>
			<li>Bitiş tarafından ekleyerek 15 µL 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) bir sayaç leke davranan slayt, slayt montaj orta. Bir kapak notu ile kapak ve tırnak cilası veya kauçuk çimento ile mühür. Slaytlar tahlil ışığa duyarlı olduğu gibi karanlıkta kurumasını sağlar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Leke üçüncü slayt kullanarak tünel tahlil ve DAPI counterstain lekeli bir pozitif ve negatif kontrol her örnek için kullanır Not: Denetim slaytlara 4 histosections ilk 2 pozitif kontrol çoğaltır ve son 2 negatif kontrol çoğaltır.<ol>
<li>Adım 4.5.2.2, yerine olumlu denetimler için doku DN arabelleği (30 mM trizma temel, pH 7.2, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DDT) ile önceden tedavi ve oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya izin. O zaman ı DN 0.1ug son bir konsantrasyon için arabellek Dnaz dağıtılması / mL ve slayta doğrudan uygulayın. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya.  Sonra slayt dH2O 5 yıkama ile her yıkama için 3 dakika yıkayın. Aşırı sıvı leke. Sonra tünel tahlil 4.5.2.3 bölümünde belirtilen şekilde devam.</li>
			<li>Negatif kontrol için terminal deoksinükleotidil tranferase (TdT) enzim örnekleri için (4.5.2.4 bölümünde anlatıldığı gibi) ekleme.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tünel slaytlar tahlil tamamlanmasından hemen sonra gözlemlemek.<ol>
<li>Almak fotoğraf rasgele aralıklarla apoptotik hücreler ortaya çıkarır ve kırmızı ve tüm çekirdek ortaya çıkarır ve mavi DAPI, her iki rodamine leke için filtreleri kullanarak bir floresan mikroskop kullanarak X 200 her cilt bölüm boyunca böylece ilişkin bir bindirme hücre-ebilmek var olmak oluşturmak. En az 100 hücreleri cilt bölüm örnek başına başına fotoğraflandı emin olun. -20 ° C'de karanlık mikroskop kutusunda slaytları depolama</li>
		<li>Hücreleri (mavi DAPI lekeli) başına görüntü saymak. En az 100 hücreleri cilt bölüm başına sayılır emin olun. 100 hücreleri ulaşmak için resmin içinde tüm hücreleri saymak. Daha az sonra 100 hücreleri bir görüntü varsa, en az 100 hücreleri cilt bölüm hayvan başına başına ulaşana kadar başka bir görüntü saymak.</li>
		<li>Daha sonra tünel pozitif hücrelerinin aynı görüntüleri (kırmızı rodamine lekeli) saymak. Apoptozis ve değil nekroz veya arka plan gösterir, tünel pozitif hücrelerinin (membran yok lysis ile olduğu gibi) Açik Hücre kenarları ile tek hücrelerdir. Bazen hücreleri formu apoptotik organları için küçültmek.</li>
		<li>Tünel assay olarak sayılan alanlarda bulun ve H & E histosections lekeli karşılık gelen bölgeler analiz. H & E bölümleri lekeli Bdsağlar Bd enfeksiyon sitelere karşılık geldiğini onaylayın-virüslü siteler tünel tahlil apoptotik hücrelerde sayım sırasında kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caspase 3/7 tahlil
<ol><li>Her hayvandan ( Bdmaruz - ve Bd- negatif) ayak parmağı ipuçları toplamak bir kez hafta 3 sonrası aşılama yoluyla haftalık ve iki haftada sonuna kadar bağımsız başına 8 ayak parmakları kadar deneme.<ol>
<li>Ayak ucunu ikinci parmağını alev steril makasla kesip bir 1.5 mL microtube yerleştirin ve hemen-80 ° C'de dondurmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteinler donmuş ayak örnekten ayıklayın.<ol>
<li>Örnekleri örnek arabelleği (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) iki paslanmaz çelik boncuklar (3.2 mm) 1,5 mL vidalı kapak microtube ile 100 µL yerleştirin. 1dk boncuk buza 3 min tarafından takip maksimum hızda (içinde aynı boncuk çırpıcı kullanılan adım 1.2.1 olarak) yenerek 4 döngüleri tarafından örnekleri parçalayıcı. Lizis sonra santrifüj kapasitesi 12.000 g x ve 4 ° C 5 dk. toplamak süpernatant assay olarak kullanmak için örnekleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bradford tahlil kullanarak örnek başına protein konsantrasyonu ölçmek.<ol>
<li>384 iyi plaka 10 µL protein özü Bradford reaktifi 10 µL ile karıştırın ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Her örnek içinde yinelenen gerçekleştirmek, 5 serisi ile birlikte BSA seyreltme standartları katlayın. 595 Absorbans okumak nm bir Absorbans plaka okuyucu üzerinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayak ucu örnekleri (protein konsantrasyonu en düşük fiyat kimden adım 4.3.1 Bradford tahlil belirlenen veya örnek kurbağalar 3 g toplam ağırlığı ise standarttır) çok küçük ise, alternatif olarak, örnekleri cilt yüzeyi hesaplanıyor tarafından standardize alan fotoğrafları, Bradford tahlil yerine kullanıyor.<ol>
<li>Proteinler caspase tahlil için örnek önce ayıklarken, her ayak bir ters ışık mikroskop kullanarak 40 X büyütme, fotoğraf.</li>
		<li>Disk görüntüsü oluşturma yazılımı, ayak parmak alan hesaplanıyor tarafından bir bilgisayar kullanarak ayak örneğini analiz. Bunu ayak küçük kenarı etrafında bir çizgi çizerek ve görüntüleme yazılımı tahmini alanını şeklin içinde var. O bölgede hangi 3-dimentional deri örneği yüzey alanı yaklaşık pi (3.14), çarpma (uzunluk x kesit alanı olarak (pi x çapı) bir tüp dış yüzey alanı verir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caspase 3/7 tahlil gerçekleştirin.<ol>
<li>384 iyi ışıldama tabak içinde 10 µL piyasada bulunan caspase 3/7 reaktif ve protein ekstresinin 10 µL ekleyin. Her örnek nüsha çalıştırın.</li>
		<li>Reaktifleri plaka yavaş yavaş için 15 s. Incubate sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında ışıktan uzak plaka karıştırın. Işıksaçan plaka okuyucu kullanarak ışıldama ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li>
<li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10393-007-0093-5">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li>
<li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chytridiomycosis%2C+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li>
<li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li>
<li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li>
<li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-1795.2007.00150.x/full">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li>
<li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li>
<li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127(2015).</li>
<li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li>
<li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen%2C+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069(2016).</li>
<li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li>
<li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li>
<li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="https://biblio.ugent.be/publication/1077693/file/1077694.pdf">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li>
<li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+skin+deep%3A+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li>
<li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li>
<li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+%28Batrachochytrium+dendrobatidis%29+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li>
<li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort%3A+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li>
<li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li>
<li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+A+%22Laboratory+Histopathology%3A+A+Complete+Reference%22">Laboratory Histopathology: A Complete Reference</a>. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).</li>
<li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925(2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Epidermal Apoptozis ve hücre ölümü ölümcül hastalık chytridiomycosis patoloji veya bir mekanizma hastalık direnci Bd duyarlı türlerin potansiyel bir mekanizma olarak araştırılmalıdır. Biz hücre ölümü epidermis, in situ epidermal hücre ölüm analizi için tünel tahlil ve epidermal hücre ölümü boyunca enfeksiyon ilerlemesini izlemek için caspase 3/7 tahlil değerlendirilmesi için iki yöntem kullanılır. Hücre ölümü ve Apoptozis enfeksiyon yük ile correlated ve hücre ölümü enfeksiyon sitesinde anlamlı olarak d...

Hem suda hem şu anda herhangi bir omurgalı takson1küresel çeşitliliğin en büyük kayıp birini yaşıyorsunuz demektir. Bu düşüşler bir büyük mantar patojen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2tarafından neden ölümcül cilt hastalığı chytridiomycosis nedeni. Patojen yüzeysel deri işlevi şiddetli elektrolit kaybı, kalp krizi ve ölüm3bozulmasına yol açabilir epidermis bozar. Bd karşı çeşitli olası ana bilgisayar bağışıklık mekanizmaları şu anda, antimikrobiyal peptidler4,5, Kutanöz bakteriyel flora6, bağışıklık hücre reseptörleri7,8gibi incelendiği, ve lenfosit aktivite9,10. Ancak, epidermal Apoptozis ve hücre ölümü bu ölümcül patojen karşı bir bağışıklık mekanizması olup birkaç çalışmalar keşfedin.
Hücre ölümü, Apoptozis (programlanmış hücre ölümü) veya nekroz (unprogrammed ölüm), epidermis ile bir patoloji Bd enfeksiyon olabilir. Önceki araştırma hücre içi kavşak çalışmasının ne zaman cilt explants zoospore supernatants vitro11' e. maruz kalır görülmektedir çünkü Bd enfeksiyon apoptosis neden olabilir gösteriyor Ayrıca, Bdepidermal dejeneratif değişiklikler-virüslü kurbağalar gözlenen elektron mikroskobu12,13kullanarak. Transcriptomic analizleri apoptosis yolları upregulated enfekte cilt14, ve onlar Bd supernatants vitro15' e maruz kaldığında apoptosis amfibi splenocytes tabi gösterir. Büyüyen birimin Bd tetikleyebilir öneriyor kanıt rağmen hücre Apoptozis ve ana bilgisayar ölüm vitro, keşfetmek veya mekanizmalar yoluyla enfeksiyon ilerleme eksik olan Apoptozis ölçmek in vivo çalışmalar. Ayrıca, ana Bd enfeksiyon mücadele için bir savunma bağışıklık strateji olarak apoptosis kullanıyorsa veya apoptosis bir patoloji hastalık ise bilinmemektedir.
Bu çalışmada, epidermal hücre ölümü ve Apoptozis iki yöntem kullanarak enfekte hayvan in vivo algılamaya yönelik: caspase 3/7 protein tahlil ve terminal dUTP transferaz-aracılı nick (tünel) in situ tahlil son etiketleme. Her tahlil hücre ölüm16farklı yönlerini algılarken, birlikte bu yöntemlerin hücre ölümüyle mekanizmaları tam bir anlayış sağlamak ve etkisi doğru bir ölçü olun. Caspase 3/7 tahlil miktar içsel ve dışsal apoptosis yollar sağlayan efektör caspases 3 ve 7, etkinlik quantifies. Buna ek olarak, tünel tahlil apoptosis, nekroz ve pyroptosis17de dahil olmak üzere hücre ölümü mekanizmaları tarafından neden olduğu DNA fragmantasyonu algılar. Tünel tahlil hücre ölümü üç farklı cilt bölümleri kullanarak hem klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanların epidermiste konumunu araştırmak için kullanıyoruz: patolojisi, venter ve Pseudophryne corroboreeuyluk. Bu yöntem anatomik site konumu belirli epidermal katmanlar içinde ayrım yanı sıra, hücre ölümü tanımlar. Daha sonra caspase 3/7 tahlil apoptosis Magno16 verreauxii alpinabir 8 haftalık enfeksiyonunda boyunca, bir saat serisi miktar yapmak için kullanın. Biz ayak ucu örnekleri iki haftada aynı hayvanlardan almak ve patojen bulaşma yük caspase 3/7 aktivite ile ilişkilendirmek edebiliyoruz.

<table><tbody><tr><td>POLARstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Lüminesan plaka okuyucu</td></tr><tr><td>384 kuyu düz şeffaf alt plaka</td><td>Corning</td><td>3707</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyu düşük flanş beyaz düz alt plaka</td><td>Corning</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bakteriyolojik (Oksoit)</td> <td>Fisher</td><td>OXLP0011B</td><td></td></tr><tr><td>Formal-Fixx %10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Fisher</td><td>6764254</td><td></td></tr><tr><td>Laktoz Suyu (Oksoit)</td><td>Fisher</td><td>OXCM0137B</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricane-S (MS-222)</td><td>Fisher</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Invitrogen</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Steril suni ipek çubuğu</td><td>Tıbbi Tel & Ekipman</td><td>MW-113</td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Kırmızı Yerinde Apoptoz Tespit Kiti</td><td>Merck Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bradford reaktifi</td><td>Pierce</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Kaspaz Glo&nbsp; 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1374248-1G</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin hidrolizat Enzimatik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0262</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Sağ), pH 7.2 (1X)</td><td>Thermo/Life</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Prepman</td><td>Thermo/Life</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Clorox ağartıcı</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Geçirmez, Moleküler Sınıf</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Scan floresan miskroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Floresan mikroskop</td></tr><tr><td>3,2 mm paslanmaz çelik boncuklar</td><td>BioSpec</td><td>11079132SS</td><td></td></tr><tr><td>Primer ITSI-3 Chytr (5&prime;-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Primer</td></tr><tr><td>5.8S Chytr (5&prime;-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3&prime;)</td> için bireysel tasarım<td>Taqman</td><td></td><td>Astarlar ve prob için bireysel tasarım</td></tr><tr><td>Küçük oluk bağlayıcı prob Chytr MGB2 (5 & prime ; -CGAGTCGAAC-3 & prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Primerler ve prob için bireysel tasarım</td></tr><tr><td>Rotor-Gene qPCR Cihazları</td><td>Qiagen</td><td></td><td>qPCR makinesi</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 1.5ml</td><td>Fisher</td><td>02-681-372</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü petri plakaları</td><td>Nunc</td><td>263991</td><td></td></tr><tr><td>Mini-boncuk Çırpıcı Zircornia-Silikat Boncuklar, 0.5mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105Z</td><td></td></tr></tbody></table>

terminal transferaz-aracılı dutp kullanarak nick uç-etiketleme (tünel) ve caspase 3/7 deneyleri için ölçü epidermal hücre ölümünde kurbağalar chytridiomycosis ile

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Hem suda hem genel olarak biyolojik çeşitlilik içinde büyük bir kayıp yaşandığı ve bulaşıcı hastalık chytridiomycosis en önemli nedenlerinden biridir. Bu hastalığı mantar patojen bozar ve kurbağa epidermis bozan Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), tarafından neden olur; Ancak, patolojik değişiklikler açık olarak nitelendirmiştir değil. Apoptozis (programlanmış hücre ölümü) patojenlerin ana bilgisayar dokusuna zarar için kullanılabilir ama aynı zamanda hastalık direnci patojen kaldırma için bir ana mekanizma olabilir. Bu çalışmada, biz iki farklı deneyleri kullanarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanların epidermal hücre ölümü ölçmek: terminal dUTP transferaz-aracılı nick uç-etiketleme (tünel) ve caspase 3/7. Ventral, sırt ve uyluk deri dokusu tünel assay olarak, biz gözlemlemek kullanarak klinik olarak enfekte hayvanların in situ epidermal hücre ölümünde hücre ve hücre ölümü floresan mikroskopisi kullanılarak bulaşmamış hayvanlarla karşılaştırın. Epidermis seviyelerinde apoptosis enfeksiyon boyunca nasıl değiştiğini belirlemek için iki haftada bir 8 haftalık süre içinde ayak ucu örnekleri kaldırmak ve caspase 3/7 tahlil etkinlik örnekleri içinde ölçmek için ayıklanan proteinler ile kullanın. Biz o zaman caspase 3/7 etkinlik enfeksiyon yük ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Tünel tahlil hücre ölüm situyerelleştirme için yararlıdır, ancak pahalı ve zaman örnek başına sahiptir. Caspase 3/7 tahlil örneklerin boyutu büyük ve zaman için verimli ders deneyler. Ancak, kurbağa ayak ucu biyopsisi küçüğüz çünkü mevcuttur sınırlı özü Bradford tahlil gibi protein miktar yöntemleri ile örnek standardizasyon. Bu nedenle, biz deri yüzey alanı örnek standardizasyon sırasında özleri tüketen önlemek için ayak biyopsi fotoğraf analizi ile tahmin öneririz.

Tünel tahlil
Vardı daha fazla tünel pozitif hücrelerinin virüslü hayvanlarda hastalık bulaşmamış tek denetim hayvanlarda. Tünel içinde hücreleri farklılık olumlu in situ konumunu enfekte ve hayvan kontrol. Denetim hayvanlarda vardı Tünel boyunca dermal ve epidermal hücre katmanları (bkz: şekil 1A) düşük seviyelerde cilt ama virüslü hayvanlarda tünel pozitif hücrelerinin epidermis (...

İki yöntem kullanarak chytridiomycosis ile kurbağa epidermal hücre ölümü ölçmek. Öncelikle, terminal dUTP transferaz-aracılı nick son etiketleme (tünel) situ Histoloji klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanlar arasındaki farkları belirlemek için kullanabilirsiniz. İkinci olarak, biz bir caspase 3/7 protein analizi ile enfeksiyon üzerinde apoptosis bir zaman serisi analizi kuralları.

Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Bu deneyin genel amacı, amfibi mantar patojeni batrachochytrium dendrobatidis'in kurbağaların epidermal dokusunda apoptoz ve hücre ölümü üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, enfeksiyonun hücre ölümüne neden olup olmadığı veya tersine enfeksiyona karşı bağışıklık mekanizmaları olup olmadığı gibi vahşi yaşam hastalıklarını anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük doku biyopsi örnekleri üzerinde gerçekleştirilebilmesidir, böylece küçük bireyler enfeksiyon seyri boyunca tekrar tekrar örneklenebilir.Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi örnek doku ile hidrofilik cam slaytlar hazırlayın. Doku bölümlerini deparafinize etmek için, slaytları bir coplin kavanozunda her biri beş dakika boyunca ksilen ile üç kez yıkayın. Ardından, slaytları her biri beş dakika boyunca iki kez% 100 etanol ile yıkayın.Bundan sonra, slaytları her biri% 95 etanol ve% 70 etanol ile üç dakika yıkayın. Ardından, slaytları PBS ile beş dakika boyunca bir kez yıkayın. Deneysel ve negatif kontrol slaytları hazırlamak için, slaytlara doğrudan taze seyreltilmiş proteinaz K ekleyerek dokuya ön işlem uygulayın.Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları PBS'de her biri iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Pozitif kontrol slaytları hazırlamak için, dokuyu DN tamponu ile ön işleme tabi tutun ve ardından slaytları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Bundan sonra, DNaz birini DN tamponunda mililitre başına 0.1 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona çözün. Hazırlanan DNase çözeltisini slaytlara ekleyin. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Ardından, slaytları damıtılmış suyla bir coplin kavanozunda her biri üç dakika boyunca beş kez yıkayın. Reaksiyonu PBS'de% 3 hidrojen peroksit içinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca söndürün. Ardından, slaytları PBS'de her biri iki dakika boyunca iki kez yıkayın.Ardından, slaytlar üzerindeki dokuya denge tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 10 saniye inkübe edin. Ardından, doku bölümünün etrafındaki fazla sıvıyı hafifçe vurun.Reaksiyon tamponunda terminal deoksinükleotidil transferaz enzimini seyreltin. Daha sonra deneysel ve pozitif kontrol slaytları üzerindeki dokuya ekleyin. Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.Bundan sonra, slaytları durdurma tamponunun çalışma konsantrasyonunu içeren bir coplin kavanozuna yerleştirin. 15 saniye çalkalayın ve ardından slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları PBS ile her biri bir dakika boyunca üç kez yıkayın ve fazla sıvıyı hafifçe vurun.Daha sonra, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış anti-digoksigenin konjugatını doğrudan dokuya ekleyin. Slaytları nemlendirilmiş karanlık bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, slaytları PBS ile her biri iki dakika boyunca dört kez yıkayın.Fazla sıvıyı boşaltın. Ardından, slaytlara montaj ortamı ekleyin. Slaytlardaki montaj ortamına 15 mikrolitre DAPI solüsyonu ekleyin.Her slaytı bir kapak fişi ile örtün ve oje ile kapatın. Slaytların karanlıkta kurumasını bekleyin. Bir floresan mikroskobu kullanarak, ayakta durma işleminin tamamlanmasının hemen ardından slaytları gözlemleyin.Her cilt bölümü boyunca rastgele aralıklarla 400 kez fotoğraf çekin. Hayvan başına deri bölümü başına en az 100 hücrenin görünür olduğundan emin olmak için DAPI lekeli mavi hücreleri sayın. Ardından, net hücre kenarları olan kırmızı tek hücreler olarak görünen TUNEL pozitif hücrelerin sayısını sayın.Başlamak için, kurbağanın ayak parmaklarının her birinin fotoğrafını çekmek için 40 kez ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın. Ayak klipsinin kenarına çizgiler çizin ve şeklin içindeki alanı tahmin etmek için görüntüleme yazılımı kullanın. Üç boyutlu deri örneğinin yüzey alanını değerlendirmek için, tahmini alanı pi ile çarpın.Dondurulmuş bir kurbağa parmağı örneğinden proteinleri çıkarmak için, örneği 100 mikrolitre örnek tamponu ve iki paslanmaz çelik boncuk içeren 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hücreleri parçalamak için maksimum hızda bir boncuk çırpıcı kullanın. Bundan sonra, tüpü üç dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.Ardından, süpernatanı toplamak için tüpü santrifüjleyin. Kaspaz 3/7 testini 384 oyuklu bir plakada gerçekleştirmek için, boş olarak 10 mikrolitre numune tamponu ve üçlü olarak 10 mikrolitre protein özütü ekleyin. Ardından, piyasada bulunan 10 mikrolitre kaspaz 3/7 reaktifini protein ekstraktına ve boş kuyucuklara pipetleyin.Ardından, iki reaktifi karıştırmak için plakayı 15 saniye boyunca hafifçe çalkalayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Son olarak, numunenin lüminesansını ölçmek için ışıldayan bir plaka okuyucu kullanın.Bu çalışmada, enfekte hayvanlar, kırmızı veya pembe lekeli hücrelerle gösterildiği gibi kontrol hayvanlarına kıyasla önemli ölçüde daha fazla TUNEL pozitif hücre göstermektedir. Kontrol hayvanlarında, az sayıda TUNEL-pozitif hücre vardır ve bunlar epidermiste konsantre değildir. Enfekte hayvanlarda, TUNEL pozitif hücreler epidermiste daha sık görülür.TUNEL-pozitif hücreler, enfekte olmuş hücrelerin manzaralarında daha konsantre ve doğrudan bitişiktir. Ayrıca, epidermis üzerinde ve mantar patojeninin bulunduğu yerden daha derin olan epidermal tabakalarda daha yaygın TUNEL pozitif hücreler vardır. Enfekte hayvanlarda, her üç deri tipinde de daha fazla TUNEL pozitif hücre bulunur ve özellikle uyluk ve venter derisinde yüksek bir seviye vardır.Kaspaz testinde, enfeksiyon yoğunluğu kaspaz 3/7 aktivitesi ile pozitif korelasyon gösterir. Ek olarak, enfekte ve enfekte olmayan hayvanlarda kaspaz 3/7 aktivitesi zamanla farklılık göstermiştir. Kaspaz 3/7 aktivitesi, aşılamadan sonraki ilk birkaç hafta içinde azaldı ve daha sonra enfekte hayvanlarda yedinci haftanın sonuna doğru arttı.Kaspaz 3/7 aktivitesi enfekte olmayan kişilerde sabit kalmıştır. TUNEL testi için prosedürü denerken, hassasiyet kaybını önlemek ve boyaları korumak için slaytları serin ve karanlık bir yerde tutmak için slaytları testle aynı gün okumak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, amfibi derisi gibi küçük doku örneklerinde iki farklı tespit yöntemi kullanarak apoptoz ve hücre ölümünün nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Bu videoda, bir numunedeki apoptotik hücrelerin varlığını tespit etmek için TUNEL testi gerçekleştirilmiştir. Çalışma, bir floresan mikroskobu altında gözlemlenebilen ve tanımlanabilen, parçalanmış DNA'nın 3' terminaline etiketli dUTP'lerin eklenmesini katalize eden özel bir DNA polimeraz - terminal deoksinükleotidil transferaz - kullanmayı içerir.

Terminal Transferaz Aracılı dUTP Nick Uç Etiketleme—TUNEL Testi: Apoptotik Hücrelerde DNA Parçalanmasını Tespit Etmek İçin Yerinde Bir Yöntem

Bu videoda, hücre ölümünü veya apoptozu ölçmek için in vitro Kaspaz-3/7 ışıldayan bir test açıklanmaktadır. Test, ışıldayan bir DEVD substratının kaspaz-3/7 bölünmesini takiben üretilen lüminesansı ölçer. Üretilen lüminesans, kaspaz-3/7 aktivitesi ile orantılıdır.

Kaspaz-3/7 Testi: Kurbağa Derisi Eksplantlarında Kaspaz-3/7 Aktivitelerini Ölçerek Apoptozu Ölçmek İçin Lüminesans Tabanlı Bir Test

Bazı genetik bozulmalar veya toksinlere maruz kalma, belirli hücre tiplerinin ölümüne yol açan normal gelişimsel süreçleri bozabilir. Zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresan ile aktive edilmiş Kaspaz 3'ün analizi, spesifik olarak apoptoz geçiren hücrelerin evre ve dokuya özgü lokalizasyonunu ortaya koymaktadır.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Amfibiler Batrachochytrium dendrobatidis enfeksiyon, azaltılmış konsantrasyonu (% 0.0025) ve genel olarak kullanılan daha itrakonazol daha kısa süre (altı gün boyunca beş dakika banyolar) kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Daha az mortalite ve daha az olumsuz yan etkileri bu modifiye tedavi protokolü kullanılarak gözlenmiştir.

İndirimli Itraconazole Konsantrasyon ve Süreleri Tedavisi Başarılı mısınız<em&gt; Batrachochytrium dendrobatidis</em&gt; Amfibi Enfeksiyon

Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Bu videoda, fare iskelet kasının diseksiyonu, doku işlemesi, kesit alması ve floresan tabanlı TUNEL etiketlemesi açıklanmaktadır. Ayrıca, TUNEL etiketlemesinin yarı otomatik analizi için bir yöntemi de açıklar.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi In Situ TÜNEL Yöntemiyle

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Öğrenin, TUNEL ve Caspase 3/7 analizi kullanarak kurbağalarda kitridiyomikoz enfeksiyonuna bağlı epidermal hücre ölümünü nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, küçük doku örneklerinde apoptotik süreçleri değerlendirmeyi sağlar.

Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile (Video) | JoVE Journal

Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile

Daha fazla video keşfet