Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile
16 Mayıs 2018
İki yöntem kullanarak chytridiomycosis ile kurbağa epidermal hücre ölümü ölçmek. Öncelikle, terminal dUTP transferaz-aracılı nick son etiketleme (tünel) situ Histoloji klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanlar arasındaki farkları belirlemek için kullanabilirsiniz. İkinci olarak, biz bir caspase 3/7 protein analizi ile enfeksiyon üzerinde apoptosis bir zaman serisi analizi kuralları.
Bu deneyin genel amacı, amfibi mantar patojeni batrachochytrium dendrobatidis'in kurbağaların epidermal dokusunda apoptoz ve hücre ölümü üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, enfeksiyonun hücre ölümüne neden olup olmadığı veya tersine enfeksiyona karşı bağışıklık mekanizmaları olup olmadığı gibi vahşi yaşam hastalıklarını anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük doku biyopsi örnekleri üzerinde gerçekleştirilebilmesidir, böylece küçük bireyler enfeksiyon seyri boyunca tekrar tekrar örneklenebilir.
Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi örnek doku ile hidrofilik cam slaytlar hazırlayın. Doku bölümlerini deparafinize etmek için, slaytları bir coplin kavanozunda her biri beş dakika boyunca ksilen ile üç kez yıkayın. Ardından, slaytları her biri beş dakika boyunca iki kez% 100 etanol ile yıkayın.
Bundan sonra, slaytları her biri% 95 etanol ve% 70 etanol ile üç dakika yıkayın. Ardından, slaytları PBS ile beş dakika boyunca bir kez yıkayın. Deneysel ve negatif kontrol slaytları hazırlamak için, slaytlara doğrudan taze seyreltilmiş proteinaz K ekleyerek dokuya ön işlem uygulayın.
Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları PBS'de her biri iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Pozitif kontrol slaytları hazırlamak için, dokuyu DN tamponu ile ön işleme tabi tutun ve ardından slaytları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Bundan sonra, DNaz birini DN tamponunda mililitre başına 0.1 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona çözün. Hazırlanan DNase çözeltisini slaytlara ekleyin. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
Ardından, slaytları damıtılmış suyla bir coplin kavanozunda her biri üç dakika boyunca beş kez yıkayın. Reaksiyonu PBS'de% 3 hidrojen peroksit içinde oda sıcaklığında beş dakika boyunca söndürün. Ardından, slaytları PBS'de her biri iki dakika boyunca iki kez yıkayın.
Ardından, slaytlar üzerindeki dokuya denge tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 10 saniye inkübe edin. Ardından, doku bölümünün etrafındaki fazla sıvıyı hafifçe vurun.
Reaksiyon tamponunda terminal deoksinükleotidil transferaz enzimini seyreltin. Daha sonra deneysel ve pozitif kontrol slaytları üzerindeki dokuya ekleyin. Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Bundan sonra, slaytları durdurma tamponunun çalışma konsantrasyonunu içeren bir coplin kavanozuna yerleştirin. 15 saniye çalkalayın ve ardından slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları PBS ile her biri bir dakika boyunca üç kez yıkayın ve fazla sıvıyı hafifçe vurun.
Daha sonra, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış anti-digoksigenin konjugatını doğrudan dokuya ekleyin. Slaytları nemlendirilmiş karanlık bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, slaytları PBS ile her biri iki dakika boyunca dört kez yıkayın.
Fazla sıvıyı boşaltın. Ardından, slaytlara montaj ortamı ekleyin. Slaytlardaki montaj ortamına 15 mikrolitre DAPI solüsyonu ekleyin.
Her slaytı bir kapak fişi ile örtün ve oje ile kapatın. Slaytların karanlıkta kurumasını bekleyin. Bir floresan mikroskobu kullanarak, ayakta durma işleminin tamamlanmasının hemen ardından slaytları gözlemleyin.
Her cilt bölümü boyunca rastgele aralıklarla 400 kez fotoğraf çekin. Hayvan başına deri bölümü başına en az 100 hücrenin görünür olduğundan emin olmak için DAPI lekeli mavi hücreleri sayın. Ardından, net hücre kenarları olan kırmızı tek hücreler olarak görünen TUNEL pozitif hücrelerin sayısını sayın.
Başlamak için, kurbağanın ayak parmaklarının her birinin fotoğrafını çekmek için 40 kez ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın. Ayak klipsinin kenarına çizgiler çizin ve şeklin içindeki alanı tahmin etmek için görüntüleme yazılımı kullanın. Üç boyutlu deri örneğinin yüzey alanını değerlendirmek için, tahmini alanı pi ile çarpın.
Dondurulmuş bir kurbağa parmağı örneğinden proteinleri çıkarmak için, örneği 100 mikrolitre örnek tamponu ve iki paslanmaz çelik boncuk içeren 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hücreleri parçalamak için maksimum hızda bir boncuk çırpıcı kullanın. Bundan sonra, tüpü üç dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Ardından, süpernatanı toplamak için tüpü santrifüjleyin. Kaspaz 3/7 testini 384 oyuklu bir plakada gerçekleştirmek için, boş olarak 10 mikrolitre numune tamponu ve üçlü olarak 10 mikrolitre protein özütü ekleyin. Ardından, piyasada bulunan 10 mikrolitre kaspaz 3/7 reaktifini protein ekstraktına ve boş kuyucuklara pipetleyin.
Ardından, iki reaktifi karıştırmak için plakayı 15 saniye boyunca hafifçe çalkalayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Son olarak, numunenin lüminesansını ölçmek için ışıldayan bir plaka okuyucu kullanın.
Bu çalışmada, enfekte hayvanlar, kırmızı veya pembe lekeli hücrelerle gösterildiği gibi kontrol hayvanlarına kıyasla önemli ölçüde daha fazla TUNEL pozitif hücre göstermektedir. Kontrol hayvanlarında, az sayıda TUNEL-pozitif hücre vardır ve bunlar epidermiste konsantre değildir. Enfekte hayvanlarda, TUNEL pozitif hücreler epidermiste daha sık görülür.
TUNEL-pozitif hücreler, enfekte olmuş hücrelerin manzaralarında daha konsantre ve doğrudan bitişiktir. Ayrıca, epidermis üzerinde ve mantar patojeninin bulunduğu yerden daha derin olan epidermal tabakalarda daha yaygın TUNEL pozitif hücreler vardır. Enfekte hayvanlarda, her üç deri tipinde de daha fazla TUNEL pozitif hücre bulunur ve özellikle uyluk ve venter derisinde yüksek bir seviye vardır.
Kaspaz testinde, enfeksiyon yoğunluğu kaspaz 3/7 aktivitesi ile pozitif korelasyon gösterir. Ek olarak, enfekte ve enfekte olmayan hayvanlarda kaspaz 3/7 aktivitesi zamanla farklılık göstermiştir. Kaspaz 3/7 aktivitesi, aşılamadan sonraki ilk birkaç hafta içinde azaldı ve daha sonra enfekte hayvanlarda yedinci haftanın sonuna doğru arttı.
Kaspaz 3/7 aktivitesi enfekte olmayan kişilerde sabit kalmıştır. TUNEL testi için prosedürü denerken, hassasiyet kaybını önlemek ve boyaları korumak için slaytları serin ve karanlık bir yerde tutmak için slaytları testle aynı gün okumak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, amfibi derisi gibi küçük doku örneklerinde iki farklı tespit yöntemi kullanarak apoptoz ve hücre ölümünün nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, amfibiyan fungal patojen Batrachochytrium dendrobatidis'in kurbağa epidermal dokusundaki apoptoz ve hücre ölümü üzerindeki etkisini incelemektedir. TUNEL in situ histolojisi ve kaspaz 3/7 protein analizi kullanılarak, enfeksiyon ile hücre ölümü arasındaki ilişkinin aydınlatılması amaçlanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Yaban Hayatı Hastalıkları
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Kitriidiyomikoz, amfibi popülasyonları için önemli bir tehdittir.
- Hücre ölümü mekanizmalarının anlaşılması, koruma çalışmalarına bilgi sağlayabilir.
- Apoptoz, fungal enfeksiyonlara verilen yanıtta rol oynayabilir.
- Küçük doku örnekleri, enfeksiyon boyunca tekrarlanan analizlere olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Kitridiomikoz ile enfekte olmuş kurbağalarda epidermal hücre ölümünü nicelleştirmek.
- Enfekte ve enfekte olmamış kurbağalar arasındaki apoptoz farklarını belirlemek.
- Enfeksiyon sırasındaki apoptozun zaman içindekileşimini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Histolojik analiz için terminal transferaz aracılı dUTP nick uç etiketleme (TUNEL).
- Zaman serisi değerlendirmesi için Kaspaz 3/7 protein analizi.
- Doku örnekleri içeren hidrofilik cam lamların hazırlanması.
- Ksilen ve etanol yıkamaları kullanılarak doku kesitlerinin deparafinizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Enfekte ve enfekte olmamış kurbağalar arasında apoptoz oranlarında farklılıklar gözlemlenmiştir.
- Zaman serisi analizi, enfeksiyon süreci boyunca hücre ölümü trendlerini ortaya koymuştur.
- Yöntemlerin küçük doku örneklerini analiz etmede etkili olduğu gösterilmiştir.
- Elde edilen bulgular, enfeksiyona karşı bağışıklık yanıtlarının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sonuçlar
- Çalışma, kitridiomikozun kurbağa epidermal hücreleri üzerindeki etkilerine dair değerli veriler sağlamaktadır.
- Bu bağlamda apoptozun anlaşılması, yaban hayatı koruma stratejilerine yardımcı olabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, fungal enfeksiyonlara karşı bağışıklık mekanizmalarını inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Bu çalışma, apoptoz analizlerinin yaban hayatı hastalık modellerinde patojen kaynaklı doku hasarını değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstererek, erken evre hedef doğrulamada mekanistik risk azaltma için bir çerçeve sunmaktadır. Batrachochytrium dendrobatidis ile enfekte olan kurbağalarda epidermal hücre ölümünün miktarının belirlenmesi yoluyla bu yaklaşım, konak-patojen etkileşimlerinin değerlendirilmesinde öngörüsel güveni destekler ve translasyonel biyobelirteç keşfine ışık tutar. Küçük doku biyopsilerinin kullanımı, preklinik sistemlerde hastalık ilerlemesini ve terapötik müdahaleleri takip etmek için kritik olan boylamsal örneklemeye olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Epidermal dokudaki patojen kaynaklı apoptozu konak savunma mekanizmalarından ayırt ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Enfeksiyöz hastalık modellerinde doku bozulma mekanizmalarını netleştirmek için TUNEL boyama yoluyla uzamsal olarak çözümlenmiş hücre ölümü verileri sağlar.
- Öngörücü Değer: Caspase 3/7 aktivitesini zaman içindeki enfeksiyon yüküyle ilişkilendirerek doz-yanıt ve zamansal profillemeye olanak tanır ve böylece hedef güvenilirliğini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Küçük doku örneklerinde apoptoz saptama için standart protokoller oluşturarak, sınırlı materyale sahip ortamlarda tekrarlanabilir bileşik taramasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Caspase 3/7 analizi, zaman serisi deneyleri için yüksek kapasiteli uyumluluk sunarken, TUNEL mekansal apoptoz modellerinin doğrulanmasını sağlar.
- Analiz Hazırlığı: Floresan mikroskopi ve lüminesans okumaları, analiz optimizasyonu ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik için uygun kantitatif çıktılar üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Epidermal apoptozu hastalık şiddetiyle ilişkilendirerek, moleküler okumalar ile klinik enfeksiyon seyri arasındaki biyobelirteç uyumunu destekler.
- Operasyonel Değer: Boylamsal çalışmalarda enfeksiyon aşamaları boyunca caspase 3/7 dinamiklerini izleyerek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararları alınmasını sağlar.
- Translasyonel Süreklilik: Histolojik ve biyokimyasal apoptoz analizlerinin, enfeksiyöz hastalık modellerinde preklinik geçerliliği güçlendirmek için nasıl birleştirilebileceğini gösterir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle doku erişilebilirliğinin geleneksel histolojiyi kısıtladığı çalışmalarda, hedef doğrulaması ve öncü bileşik tanımlaması için bilgi sağlayan apoptoz okumaları sunarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Patojen maruziyetinin konak dokuda apoptozu tetikleyip tetiklemediği veya baskılayıp baskılamadığına dair hipotezlerin test edilmesini sağlayarak doku hasarı mekanizmalarını aydınlatır.
- Tarama: Caspase 3/7 analizi, küçük biyopsi örneklerinde apoptozu etkileyen modülatörlerin ölçeklenebilir ve kantitatif olarak taranmasına olanak tanır.
- Analitikler: Lüminesans ve floresan çıktılar, farklı koşullar ve zaman noktaları arasında apoptozu karşılaştırmak için ölçülebilir, normalize edilmiş veriler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Moleküler apoptoz aktivitesini histopatolojik değişikliklerle ilişkilendirerek preklinik modellerde biyobelirteç kalifikasyonunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kombine TUNEL ve caspase 3/7 yaklaşımı, enfeksiyöz hastalıklar ve toksikoloji çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir apoptoz profilleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Enfekte ve kontrol dokulardaki apoptoz lokalizasyonu ve kinetiğini ayırt ederek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş lam hazırlama ve görüntüleme protokolleri, laboratuvarlar ve örnek serileri arasında tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Doku stresi ve patojen etkisine dair erken biyobelirteçler sunarak, daha erken aşamada karar verme süreçlerini (go/no-go) kolaylaştırır.
- Portföy Etkisi: Apoptozu, hastalık mekanizmasının fonksiyonel bir çıktısı olarak nicelleştirerek hedeflerin risk tabanlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Histoloji, floresan mikroskopi ve sınırlı doku örneklerinden protein ekstraksiyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- TUNEL ve kaspaz 3/7 analizleri için kriyostat, floresan mikroskop ve lüminesans plak okuyucuya erişime bağımlıdır.
- Analiz hassasiyetini korumak için doku kesimi, boyama süresi ve görüntüleme ayarları konusunda kullanıcılar arasında standardizasyon gereklidir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, farklı doku tiplerinde antikor penetrasyonunun ve enzim erişilebilirliğinin doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik kısıtlama: Küçük ayak parmak ucu biyopsileri protein verimini kısıtlar; bu durum, ekstrakt tüketimini önlemek için görüntüleme yoluyla cilt yüzey alanı kestirimi gibi alternatif normalizasyon yöntemlerini zorunlu kılar.
