Name: Sentetik fajının inşaatı Fab Kütüphane özel çeşitliliği ile görüntülenir. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Öğrenin, sentetik faj kütüphanesi inşası ile yüksek afiniteli antikor geliştirme yöntemini. Bu teknik, geleneksel hibridoma yöntemlerine alternatif sunarak terapötik uygulamalar için önemli avantajlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar için kritik yorum Kunkel'ın yöntemi göre sentetik Fab fajının Kütüphane inşaat üstünde Sidhu Laboratuarı'ndan Dr. Frederic Fellouse için teşekkür ederiz. Bayan Alevtina Pavlenco ve diğer üyeler için yüksek verimli elektro-yetkili hazırlama değerli yardım etmek Sidhu laboratuarından yazarlar takdir E. coli hücreleri ve yüksek kaliteli dU-ssDNA. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından desteklenmiştir (Grant No: 81572698, 31771006) için DW ve ShanghaiTech Üniversitesi tarafından (Grant No: F-0301-13-005) laboratuvar antikor mühendislik için.

<ol><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28799485">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+watch+in+2017%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Antibodies to watch in 2017.</a> MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).</li>
<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybridoma+revolution%3A+an+offshoot+of+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The hybridoma revolution: an offshoot of basic research.</a> Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).</li>
<li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-Friendly+Affinity+Reagents%3A+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li>
<li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSidhu%2C+SS+%22Phage+Display+in+Biotechnology+and+Drug+Discovery%22">Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery</a>. , CRC Press. (2005).</li>
<li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li>
<li>Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+human+antibodies+in+clinical+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy.</a> MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).</li>
<li>Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic antibodies.</a> Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).</li>
<li>Adams, J. J., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibody+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibody technologies.</a> Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+for+selection+of+novel+binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phage display for selection of novel binding peptides.</a> Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).</li>
<li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT+unique+numbering+for+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+variable+domains+and+Ig+superfamily+V-like+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.</a> Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+between+Peptostreptococcus+magnus+protein+L+and+a+human+antibody+reveals+structural+convergence+in+the+interaction+modes+of+Fab+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins.</a> Structure. 9 (8), 679-687 (2001).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody%3A+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li>
<li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li>
<li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li>
<li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+antibody+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).</li>
<li>Fantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody+library+diversity+through+next+generation+sequencing+and+technical+error+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation.</a> PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+in+library+selection+projects%3A+what+insight+does+it+bring%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?</a> Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).</li>
<li>Perelson, A. S., Oster, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+studies+of+clonal+selection%3A+minimal+antibody+repertoire+size+and+reliability+of+self-non-self+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination.</a> J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).</li>
<li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492(2015).</li>
<li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity%2C+developability+and+functional+size%3A+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li>
<li>Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics+-+the+evolving+patent+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22N+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics - the evolving patent landscape.</a> N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yüksek çeşitlilik, Fab kitaplıkları fajının görüntülenen, kalite kontrol oluşturmak için onay noktaları yeterliliğinin elektro-yetkili hücreleri, dU-ssDNA şablon, verimliliğini kalitesini de dahil olmak üzere inşaat süreci çeşitli aşamalarında izlemek için gereklidir CCC-dsDNA sentezi, titresi çoğalmasıyla, Fab katlama ve CDRs amino asit çeşitliliği Fab-fajının klon dizi analizi tarafından sonra.
Yüksek verim ve dU-ssDNA saflığı yüksek mutagenesis oranı için gerekli. Deneyim, gecede fajının in...

mAbs geniş uygulamaların temel araştırma hastalığı teşhis ve tedavi için arasında değişen vardır. 2016 yılı itibariyle, 60'tan fazla mAbs Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve ilaç Yönetimi (USFDA) tarafından otoimmün hastalıklar, kanser ve enfeksiyon hastalıkları1,2klinik tedavisi için onaylanmıştır.
1975 yılında, Kohler ve Milstein bildirilen bir teknik 'hybridomas' ve bu teknik anılacaktır hücresel bir kaynaktan gelen tek bir klonal özgüllüğü sıra sürekli nesil için daha sonra tıp ve sanayi3 temel taşı haline geldi ,4. Bu yöntem tarafından mAbs nesil antijen üretim, fare bağışıklama, B lenfositler çıkarımı, fusion B hücreleri ile ölümsüz Hibridoma hücreleri, klon seçimi, kurmaya miyelom hücreleri ve tedavi uygulamaları için de dahil olmak üzere çeşitli adımlar gerektirir, insanlaştırma insan anti-fare antikor (HAMA)4,5önlemek için gereklidir. Ancak, bu teknoloji için toksinler, patojenler ve son derece korunmuş proteinler gibi antijenleri vivo içinde bağışıklık yanıtının mAb üretim5için tetikleyen görece etkisiz.
1978 yılında, Hutchison ve ark. bir kalıntı tek iplikçikli bakteriyofaj virüs6doğrudan mutagenesis bir Oligonükleotid kullanımı rapor. 1985 yılında, Smith yabancı gen parçaları çerçevede fajının kat protein III kodlama gen ile erimiş ve böylece fajının yüzeyinde onun infektivite7ödün vermeden görüntülenebilir bildirdi. Bunlar işleri öncü bağışıklık, saf kitaplıklarda antikor fajının görüntülenen sonraki inşası için bir temeli atıldı ve sentetik için tek-zinciri değişken parçası (scFv) ve antijen bağlayıcı parçası (Fab) biçimleriyle formları tedavi mAb development8,9. Görüş teknik açıdan fajının antikor ekran tabanlı geliştirme bazı antijenleri-ebilmek poz vermek sınırlamaları aşmak için yardımcı olabilir mAb Hibridoma tabanlı geliştirme için tamamlayıcı bir yaklaşım sunuyor ve insanlaştırma işlemek Hibridoma kaynaklı antikorlar genellikle5gerektirir. 2016, tarihi itibariyle 6 fajının görüntü elde edilen mAbs piyasada Humira, romatoid artrit, tedavisinde kullanılan en başarılı mAbs biri de dahil olmak üzere onaylanmış olan ve çok fajının görüntü elde edilen antikor aday çeşitli aşamalarında klinik şu anda soruşturma10.
Bağışıklık ve saf fajının antikor kitaplıkları tamamlayıcılık belirleme çeşitliliği için hafif ve ağır zincir (CDRs) bölgelerde doğal bağışıklık repertuar (Yani, B hücreleri) türetilir. Buna ek olarak, sentetik fajının antikor kütüphanelerde CDRs çeşitliliği tamamen yapay. Kütüphane inşaat sentetik yaklaşımlar sıra çeşitlilik tasarım üzerinde tam denetim sağlamak ve antikor yapısı mekanik çalışmaları için fırsatlar sunuyoruz ve11,12işlev. Ayrıca, sentetik kitaplıkları için bir çerçeve, büyük ölçekli endüstriyel gelişme11,12kolaylaştırmak için kütüphane inşaat önce optimize edilebilir.
1985 yılında Kunkel site yönettiği mutasyonlar M13 bakteriyofaj içine verimli bir şekilde tanıtmak için bir tek iplikçikli DNA (ssDNA) mutagenesis şablon tabanlı yaklaşım bildirdi13. Bu yaklaşım daha sonra yaygın olarak FAJ görüntülenen kitaplıkları yapımı için kullanıldı. Kimyasal sentez DNA oligonucleotides çeşitlilik Fab CDRs tanıtmak için tasarlanmış bir phagemid bir antikor omurga şablonuyla içine dahil edilmiştir. Bu süreçte phagemid bir urasil içeren ssDNA (dU-ssDNA) ifade edilir ve oligonucleotides CDRs komplementer ve çift iplikçikli DNA (dsDNA) T7 DNA polimeraz ve T4 DNA ligaz sentezlemek için genişletilmiş. Son olarak, oluşturulan ds-DNA tarafından elektroporasyon Escherichia coli tanıttı olabilir.
Yüksek çeşitlilik, Kütüphane fajının görüntülenen inşaat, yüksek voltajlı elektroporasyon elektro-yetkili hücre ve kovalent bir iki bileşenli karışımı için kapalı dairesel dsDNA (CCC-dsDNA) dikkatli bir şekilde hazırlanmalıdır. Sidhu vd. elektro-yetkili hücreleri ve DNA hazırlanması geleneksel yöntemleri ve büyük ölçüde gelişmiş kitaplık çeşitlilik14değiştiren.
Bu protokol için farklılıkların 109-1010 tek bir adım ile elde edilebilecek olan kütüphanelerin sentetik fajının görüntülenen Fab inşaat için bir yöntem açıklanmaktadır. Şekil 1 gösterir inşaat Kütüphanesi dahil olmak üzere genel bir bakış: 1) yüksek verimli elektro-yetkili cep hazırlık; 2) dU-ssDNA çıkarılması; 3) Kunkel'ın yöntemi Oligonükleotid yönetmen mutagenesis dayalı; 4) elektroporasyon ve Kütüphane boyutu hesaplanması; 5) katlanır için protein A/L tabanlı ELISA ve işlevsel çeşitlilik değerlendirme; ve 6) DNA dizi analizi çeşitlilik. Tüm reaktifler, soy ve donanımları malzemenin tablolistelenir. Tablo 1 reaktif kurulumu gösterir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H 3PO 4</td> <td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ditiyotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP </td><td>her</td> biri <td>25 mM dATP, dCTP, dGTP ve dTTP içeren GE Healthcare 28-4065-60 solüsyonunu karıştırın.</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td>, <td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Karbenikilin, karbonhidrat</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg / mL suda, &nbsp; 0.22 & mu; m filtre sterilize, iş konsantrasyonu: 100 &Mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Kloramfenikol, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>etanol içinde 100 mg / mL, 0.22 & mu; m filtre sterilize, çalışma konsantrasyonu: 10 &Mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Canlandırıcı</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>Granül agar</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 peroksidaz substratı</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td> Kanamisin, kan Fisher AC61129 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>suda 50 mg / mL,&nbsp; 0.22 & mu; m filtre sterilize, çalışma konsantrasyonu: 50 &Mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! DİKKAT: NaOH yanıklara neden olur.</td></tr><tr><td>Yağsız Süt Tozu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-HRP konjuge</td><td>İnvitrojen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kiti</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Protein L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinükleotid kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>Su içinde 50 mg / mL, 0. 22 &mu; m filtre sterilize, çalışma konsantrasyonu: 10 &Mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasaf gliserol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>etanolde 25 mg / mL, iş konsantrasyonu: 0.25 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı</td><td>Company </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Genotip: dut-&nbsp; ung-&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' kamr). dU-ssDNA'nın hazırlanması için kullanılır.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Genotip: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta; M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 & Delta; (araABC-leu)7679 ve Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Yüksek verimli elektroporasyon ve filamentli bakteriyofaj üretimi için optimize edilmiştir.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2-cm boşluk elektroporasyon küveti</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu 2mL Derin kuyu plakaları</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Maxisorp immün plakaları</td><td>Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>Şaşkın şişeler</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj şişeleri</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 elektroporatör</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma çubukları</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher santrifüj</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı çalkalayıcı</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka çalkalayıcı</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>96 ve 384 kuyu için sıvı işleyici</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutil kanallı pipet</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon yoğunlaştırıcı</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

sentetik fajının inşaatı fab kütüphane özel çeşitliliği ile görüntülenir.

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Monoklonal antikor (mAbs) temel araştırma ve ilaç için talep her yıl artmaktadır. Hibridoma teknoloji mAb development 1975 yılında ilk raporunu beri için baskın yöntemi olmuştur. Humira, ilk fajının elde edilen antikor ve en çok satan mAbs biri 2002 romatoid artrit klinik tedavi için kabul edildi beri alternatif bir teknoloji olarak, fajının görüntüleme yöntemleri mAb gelişimi için giderek daha caziptir. MAb geliştirme teknolojisi olmayan bir hayvan dayalı olarak FAJ ekran antijen immünojenisite, insanlaştırma ve geleneksel Hibridoma teknolojisi tabanlı antikor geliştirme gerekli olan hayvan bakım atlar. Bu protokol için farklılıkların 109-1010 tek bir adım ile elde edilebilecek olan kütüphanelerin sentetik fajının görüntülenen Fab inşaat için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı oluşur: 1) yüksek verimli elektro-yetkili cep hazırlık; 2) çıkarma urasil içeren tek iplikçikli DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel'ın yöntemi Oligonükleotid yönetmen mutagenesis dayalı; 4) elektroporasyon ve Kütüphane boyutu hesaplanması; 5) katlama için protein A/L-esaslı enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve işlevsel çeşitlilik değerlendirme; ve 6) DNA dizi analizi çeşitlilik.

Akış şeması Fab Kütüphane inşaat takip (bakınız şekil 1), önceden bulaşmış fajının E. coli SS320 elektro-yetkili hücreleri M13KO7 yardımcı hazırladık. Fab phagemid omurga Kütüphane yapımı için kullanıldığında bu elektro-yetkili hücrelerin verimliliğini 2 X 109 cfu/µg tahmin edilmektedir (şekil 4).
Urasil birleşme verimliliği kıyasla titresi E. co...

Bu iletişim kuralı özel çeşitliliği ile sentetik antikor fajının görüntülenen Kütüphane inşaatı için detaylı bir yordam açıklanır. Sentetik antikorlar temel araştırma geniş uygulamalardan hastalığı teşhis ve tedavi için var.

Sentetik fajının inşaatı Fab Kütüphane özel çeşitliliği ile görüntülenir.

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Bu prosedürün genel amacı, okuyuculara özel çeşitliliğe sahip bir faj ekranlı sentetik insan antikoru kütüphanesi oluşturma konusunda ayrıntılı uygulamalı deneyim sağlamaktır. Sentetik faj tarafından görüntülenen antikor kütüphaneleri, hayvan bağışıklaması ve müteakip antikor insanlaştırılması ihtiyacını atlayarak, terapötik monoklonal antikor gelişimi için geleneksel olarak hibridoma bazlı tekniklerin yerini almak için büyük bir potansiyele sahiptir. Sentetik antikor kütüphanesinin avantajı, yüksek afinite etkileşimini ve arzu edilen protein özelliklerini destekleyen konumsal çeşitliliğe ilişkin içgörü kullanılarak bir antikor çerçevesine uyarlanmış çeşitliliğin tanıtılmasıdır.Pratik faydanın ötesinde, sentetik antikor kütüphaneleri, biyomoleküler etkileşimlerde spesifik amino asitlerin rolünü deneysel olarak araştırmak için de kullanılabilir, böylece kendi sürekli gelişimlerini destekler. Bu prosedür, laboratuvarımızdan Zhenwei Zhong ve Doktor Shin-chen Hou adlı yüksek lisans öğrencisi tarafından gösterilecektir. Olmak

construction-synthetic-phage-displayed-fab-library-with-tailored

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, hedef proteine yüksek afiniteye sahip proteinleri ifade eden önceden tasarlanmış fajları izole etmek için faj görüntüleme tekniğini gösteriyoruz.

Bir Hedef Proteine Yüksek Afiniteye Sahip Proteinleri Seçmek için Faj Ekranını Kullanma

Faj gösterimi, bir ilgi hareketsiz molekülü ile etkileşen proteinleri ya da protein parçaları yakalamak için güçlü bir tekniktir. Oluşturmak için faj cDNA kütüphanesi türüne ve ekranın bir karar yapıldıktan sonra, burada açıklanan protokol interactors tanımlanmasına yol açan verimli benzeşim seçimine izin verir.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Öncelikli bakteriyel patojenlerin tespiti için basit bir yöntem, genetiği muhabiri faj kullanmaktır. Kendi özel konak türe özgü Bu muhabir faj, konak hücreleri için bioluminescent sinyal yanıt hızla uyum sağlama yeteneğine sahiptir. Burada, biz tespiti için muhabir faj kullanımını...

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Biz çevre viral toplulukların tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA molekülleri ayırmak için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Nükleik asitler, fosfat içeren tamponlar artan konsantrasyonları ile hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak fraksiyone. Bu yöntem, tüm çevre örneklerinden viral nükleik asit türleri izolasyonu izin verir.

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Öğrenin, sentetik faj kütüphanesi inşası ile yüksek afiniteli antikor geliştirme yöntemini. Bu teknik, geleneksel hibridoma yöntemlerine alternatif sunarak terapötik uygulamalar için önemli avantajlar sağlar.

Sentetik fajının inşaatı Fab Kütüphane özel çeşitliliği ile görüntülenir.

Daha fazla video keşfet