Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Bu mikroskobik diseksiyon prosedürünün genel amacı, doku mühendisliği uygulamaları için sağlam böbrek mimarisine sahip canlı böbrek dokusunun ayrı segmentlerini izole etmektir. Bu yöntem, doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: İzole edilmiş birincil organ dokusunun tüm segmentleri steril olarak toplanabilir ve kültürde canlı tutulabilir mi? Bu tekniğin ana avantajı, 26'dan fazla farklı hücre tipine sahip karmaşık bir organı yeniden oluşturmak için hücre dizilerini kullanmak yerine, segmentlerin sağlam böbrek mimarisi içermesidir.

Bu tekniğin etkileri, son dönem böbrek hastalığının tedavisine kadar uzanır, çünkü bu yapılar filtrasyonu iyileştirir ve hastaların diyalizden uzak kalmasına yardımcı olabilir. Ameliyat sırasında, kontaminasyon riskini en aza indirmek için maske ve başlık da dahil olmak üzere uygun cerrahi ekipman giyin. Aynı şekilde, steriliteyi korumak için her türlü çabayı gösterin.

Ameliyat masasını örtüp hazırlıklara başlayın. Ardından, otoklavlanmış alet paketini steril örtülerin üzerine açın. Üç küçük kanama durdurucu, dişli ince forseps, dişsiz ince forseps ve düz iris makası içermelidirler.

Ameliyat masasının ortasını ikinci bir fenestre olmayan cerrahi örtü ile örtün. Ameliyathaneyi kurmadan önce, 50 mililitre antibiyotik takviyeli DBPS hazırlayın ve beş mililitreyi 15 mililitrelik bir tüpe alın. Şimdi sekiz ila 12 haftalık bir C57 siyah altı fareyi uyuşturun ve pedal refleksini sıkı bir ayak parmağı çimdiklemesiyle değerlendirerek anestezi seviyesini periyodik olarak izleyin.

Ardından, ventral gövde bölgesindeki tüm tüyleri almak için bir tüy dökücü krem kullanın ve kremi ve saçı damıtılmış suyla durulayın. Ardından fareyi ameliyat masasına aktarın ve fenestre olmayan örtünün altına sırtüstü yatırın. Şimdi farenin karnının üzerindeki örtüde iki santimetre karelik bir pencere açın.

Daha sonra cildi sterilize etmek ve ameliyat hazırlıklarını tamamlamak için açıkta kalan cildi povidon-iyot ve ardından %70 etanol ile üç kez ovalayın. Dişler ve iris makası ile ince forseps kullanarak ameliyata başlayın. Orta hatta paralel, orta hattın bir buçuk santimetre solunda üç ila dört santimetrelik bir cilt kesisi yapın.

Daha sonra, dişsiz ince forseps kullanarak peritonu kavrayın ve karın boşluğuna girmek için iris makasıyla kesin. Daha sonra, gerginliği yanal olarak yerleştirmek ve maruziyeti artırmak için cildin ve peritonun üst ve alt yan kenarlarına hemostatlar uygulayın. Şimdi sol böbreği açığa çıkarmak için bağırsak içeriğini hassas bir şekilde karnın sağına kaydırın.

Ardından, böbreği karın dışına çıkarmak için böbreğin üzerine nazikçe çekiş yerleştirin. Şimdi böbreğin hilusuna bir hemostat yerleştirin ve üreter ve böbrek damarlarını kesmek için iris makası kullanın. Daha sonra böbreği buz üzerinde% 1 pen-strep DBPS tüpüne aktarın.

Bu tüpü işlemek için steril bir kültür başlığına alın. Böbreği 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve kalsiyum ve magnezyum içeren taze beş mililitre DPBS ile iki kez durulayın. İkinci yıkamadan sonra, böbreği 60 milimetrelik yeni bir tabakta taze beş mililitre DBPS'de askıya alın.

Daha sonra kullanmak üzere sadece beş mililitre DBPS içeren ek bir Petri kabı hazırlayın. Kontaminasyon risklerini en aza indirmek için steril eldiven, cerrahi maske ve kabarık dahil olmak üzere steril tekniği kullanmaya devam edin. Ardından sahne alanını ve stereo mikroskobu çevreleyen alanı örtün.

Ardından, mikroskop odak düğmelerinin üzerine plastik yapışkan levhalar yerleştirin ve üzerlerine %70 etanol püskürtün. Ardından, sahneyi aydınlatmak için çift deveboynu aydınlatıcıyı açın. Şimdi steril örtülerin üzerine, dişsiz ince forseps, bir neşter sapı, bir 15 numara neşter bıçağı, iki düz kanama durdurucu ve iki adet 30.5 gauge içi boş iğne içeren sterilize edilmiş bir alet paketi açın.

15 numaralı bıçağı neşter sapına yerleştirin ve iğne diseksiyon aletleri oluşturmak için her iğne adaptör göbeğine bir hemostat takın. Şimdi biri DPBS'de böbreği olan ve diğeri sadece DPBS'de olan iki tabağı mikroskop alanına aktarın. Böbrek çanağının kapağını çıkarın ve mikroskobu 3,2 ila 4X büyütme ile böbreğin ön veya arka yüzeyine odaklayın.

Daha sonra, baskın olmayan el ile, böbreği böbreğin alt ve üst kutuplarındaki tabağa delmek ve sabitlemek için dişsiz ince forseps kullanın. Daha sonra baskın eliyle, yarı saydam fibröz kapsül tabakasını açıkta kalan yüzeyden çıkarmak için 15 numaralı bıçağı kullanın. Kapsülün geri kalanını çıkarmak için böbrek yüzeyinin açıkta kalan yüzeyinden en yüzeysel 0,5 milimetre

Yaklaşık iki milimetre kare olan kapsülsüz alandan ters çevrilmiş bir doku piramidini incelemek için 15 numaralı bıçağı kullanarak devam edin. Daha sonra dokuyu DBPS'nin temiz kabına aktarın ve böbreğin geri kalanını atın. Şimdi diseke edilen dokuya odaklanın ve büyütmeyi 1.5 ila 2.0X'e düşürün.

İki hemostat iğnesi aletini kesici alet olarak kullanarak, doku segmentleri iğne uçlarının boyutuna veya daha küçük olana kadar doku parçasını giderek daha küçük parçalara bölün. Yaklaşık 50 segment üretilmelidir. Bu, prosedürün kritik bir parçasıdır.

Difüzyonu engelleyebilecek büyük segmentlerden kaçınmak için her segmentin 30-1 / 2 gauge iğne ucunun çapına yakından yaklaşması gerekir. Dokuyu doku kültürü başlığına geri koyun ve bir P1000 mikropipet kullanarak DPBS'yi çıkarın. Ardından% 10 fetal sığır serumu ve% 1 pen-strep ile desteklenmiş beş milimetre DMEM'i geri ekleyin.

Daha sonra dokuyu kültürleyin veya hemen hücresel yapılara implante edin. Tarif edilen prosedür tarafından üretilen sağlam böbrek segmentlerinin canlılığı, bir canlılık testi kullanılarak kültürde üç gün boyunca incelendi. Yeşil floresan kalsiyum, canlı hücrelerin göstergesi olan hücre içi esteraz aktivitesi ile mevcuttur.

Kırmızı floresan etidyum homodimer-1, plazma zarının bütünlük kaybı ile görülür. Böbrek segmentleri iskele içermeyen endotelyal fibroblast yapılarına gömüldüğünde, üçüncü günde sağlam yapılar oluşturmak için hücresel yapılarla birleştirildiler. Yapılar, von Willebrand faktörü ile etiketlenerek gösterilen prevasküler endotel ağlarını korudular.

Renal epitel hücreleri, sitokerain-18 ile etiketlenmiş yeşil renkte görülebilir. İn vitro renal işlevselliği test etmek için, yapılar FITC etiketli albümin ile inkübe edildi. Gömülü böbrek dokusunun segmentlerinden uzakta rezidüel albümin bulunurken, renal tübüler epitel hücrelerinde de sıcak noktalar vardı.

Bu sıcak noktalar, renal segment hücresel yapısında albümin geri alımını temsil ettiği düşünülen intraluminal olarak geçen albümindir. Bu videoyu izledikten sonra, doku mühendisliği uygulamaları için fare böbreklerinden böbrek segmentlerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür bir ila 1-1 / 2 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, renal yapı üretimi ve karakterizasyonu ile ilgili diğer soruları yanıtlamak için hücreselleştirilmiş yapıların tohumlanması da dahil olmak üzere diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Cerrahi aletler ve basınçlı oksijen tüpleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Keskin nesnelerle çalışırken dikkatli olun ve oksijen tanklarını bir laboratuvar tezgahına sabitlemeyi unutmayın.