Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Bu yöntem, kolon kanseri hastasında bulunan mikrometastazlar hakkında tümör biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farelerde GFP etiketli, hasta kaynaklı kolon kanseri organoidlerinin neden olduğu mikrometastazlarla oldukça hassas algılamaya izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü farelerde uzak organlarda kolon tümörü organoid türevli mikrometastazları tespit etmek zor olabilir.

Yu Okazawa ile prosedürü göstermek, grubumdan hem doktora öğrencileri hem de cerrahlar olan Kosuke Mizukoshi ve Yu Koyama olacak. İnsan kolorektal kanser hücresi organoidlerini oluşturmak için, önce buz üzerindeki 12 oyuklu bir plakaya oyuk başına 150 mikrolitre yapay hücre dışı matris ekleyin. Tüm kuyucuklar kaplandıktan sonra, jelleri katılaştırmak için plakayı 37 derece ve% 5 CO2 inkübatörde 30 ila 60 dakika inkübe edin.

Daha sonra, mililitre konsantrasyonda üç kez 10 ila beş hücre elde etmek için% 5 fetal buzağı serumu veya FCS ile desteklenmiş taze kolorektal kanser organoid kültür ortamında hastadan türetilmiş bir tümör ksenogreft hücre peletini yeniden süspanse edin ve her yapay hücre dışı matris üzerine bir mililitre hücre tohumlayın. Ardından, hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi sabah, yüzen hücreler de dahil olmak üzere kültür süpernatantlarını santrifüjlemeleri için 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve peletleri buz üzerinde 70 mikrolitre taze yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspanse edin.

Kolorektal kanser hücresi canlılığını artırmak için, yapay hücre dışı matris içeren yüzen tümör hücresini yapay hücre dışı matris kaplı kuyucuklara geri yerleştirin ve tümör hücre kültürü kültürlerini hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika inkübe edin. Yeni hücre dışı matris jeli katılaştığında, kültürleri% 1 FCS ile takviye edilmiş bir mililitre taze kolorektal kanser organoid hücre kültürü ortamı ile besleyin ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Yedi ila 10 günlük kültürden sonra, organoidleri steril bir hücre kazıyıcı ile mekanik olarak ayırın ve organoidleri santrifüjlemeleri için 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Ardından, başka bir santrifüjleme için hafifçe vurarak peletleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Kolorektal kanser organoidlerini ayırmak için, tüplere 500 mikrolitre proteolitik ve kollajenolitik enzim çözeltisi ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, hücrelere %1 FBS takviyeli 500 mikrolitre ortam ekleyin ve organoidleri parçalamak için hücre süspansiyonunu birkaç kez çok nazikçe pipetleyin.

İşleme sırasında insan CRC organoidlerinin hassas bir şekilde pipetlenmesi, kültürde bozulmamış bir sferoid oluşumunu korumak için kritik öneme sahiptir. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peletleri 100 mikrolitre 5X GFP lentivirüs stoğu ve 400 mikrolitre taze kolorektal kanser organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin. Özellikle yaklaşık %100'lük bir CRC enfeksiyonu elde etmek için insan CRC organoidlerini yüksek bir GFP lentivirus titresi ile enfekte etmek esastır.

500 mikrolitre orta konsantrasyon başına beş ayrışmış tümör hücresine beş kez 10 elde etmek için her tüpteki hacmi ayarlayın ve gösterildiği gibi yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre yerleştirin. Hücre kültürü inkübatöründe 18 saat sonra, yüzen, hücre içeren süpernatanları santrifüjleme için ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın, ardından peletlerin buz üzerinde tüp başına 70 mikrolitre yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspansiyonu yapın. Kolorektal kanser hücresi canlılığını arttırmak için, tümör hücresi içeren yapay hücre dışı matrisi 12 oyuklu plakadaki tümör organoidlerinin üzerine yerleştirin ve plakayı 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Yapay hücre dışı matris kaplama katılaştığında, kültürleri% 1 FCS ile takviye edilmiş bir mililitre taze CRC organoid kültür ortamı ile besleyin ve hücreleri üç gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ardından, yaklaşık% 100 GFP pozitifliğini doğrulamak için enfekte olmuş hücreleri floresan mikroskobu ile gözlemleyin ve hücreleri dört ila altı gün daha inkübatöre geri koyun. CRC hastadan türetilmiş tümör ksenogreftlerinin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için, GFP etiketli organoidleri gösterildiği gibi ayırın ve tek tümör hücresi süspansiyonlarını% 50 yapay hücre dışı matris konsantrasyonu ile desteklenmiş 50 mikrolitre PBS başına beş kez 10 ila beş tümör hücresinde seyreltin.

22 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngaya fare başına 50 mikrolitre hücre yükleyin ve tümör hücrelerini buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, ayak parmağınızın sıkışmasına yanıt verilmediğini onaylayın ve ilk anestezi uygulanmış NOG faresini laboratuvar tezgahında sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Steril cımbız kullanarak, rektal mukozayı anüsten nazikçe çekin ve tümör hücrelerini hemen rektal submukozaya enjekte edin.

CRC hastadan türetilmiş tümör ksenogreftlerinin deneysel bir metastaz modelini oluşturmak için, tek tümör hücresi süspansiyonlarını 50 mikrolitre konsantrasyon başına dört kez 10 ila dört hücrede seyreltin ve fare başına 50 mikrolitre hücreyi 22 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngaya yükleyin. İlk anestezi uygulanmış NOG faresini bankta yüzüstü pozisyonda yerleştirin ve sol kanadın alt bölgesinde küçük bir kesi yapın. Peritonu dikkatlice kesmek ve dalağı ortaya çıkarmak için steril makas ve cımbız kullanın ve dalağa bağlı yağı kavramak için cımbız kullanın.

Daha sonra 50 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonunu yavaşça dalağa enjekte edin ve sızıntı olmamasına dikkat edin. Tüm farelere gerektiği gibi enjekte edildikten ve dikildikten sonra, hayvanları ev kafeslerine geri koyun ve tümör hücresi doğumundan bir gün sonra sütür sızıntısı ve canlılığı olup olmadığını kontrol edin. Tümörleri haftalık olarak ölçmek için kaliperler kullanın, birincil tümörleri ve ilgili dokuları uygun deneysel uç noktalara kadar toplayın.

Diseke edilen tümörleri ve organları buz üzerinde 10 santimetrelik bir Petri kabında beş mililitre buz gibi soğuk PBS'ye aktarın ve GFP ekspresyonlarını değerlendirmek için disseke edilen dokuları bir stereo-floresan mikroskobu altında gözlemleyin. GFP lentivirüsü ile CRC organoid enfeksiyonu, gösterildiği gibi, hemen hemen tüm organoidlerin çok parlak GFP eksprese etmesine neden olur. GFP işaretli organoidlerin ikincil alıcı NOG farelerine ortotopik ve intrasplenik enjeksiyonu, ortotopik bölgede ve enjeksiyondan 2.5 ay sonra incelenen farelerin çoğunun akciğerlerinde GFP pozitif primer tümörlerin oluşumunu ortaya koymaktadır.

Ayrıca, intrasplenik enjeksiyondan bir ay sonra alıcı NOG hayvanlarında karaciğer metastazı gözlenir. Bu videoyu izledikten sonra, GFP etiketli insan kolorektal kanser hücresi organoidlerinin alıcı farelere girdikten sonra mikrometastazlarını nasıl tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, farelerde insan kolon kanseri hücresi organoidlerinin tümör ve metastaz hedef bulma etkinliğinin büyük ölçüde orijinal tümör hücrelerinin hastalar arası değişkenliğine bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir.