Name: Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Keşfedin bitki damar dokuları üzerinden çift iplikçikli RNA oral teslim yöntemlerini ve Hemipteran böceklerde RNA müdahalesi uygulamasını. Bu teknik, gen susturma ve zararlı kontrolü için sürdürülebilir biyopestisit çözümleri sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, minnetle BMSB HB deneme için düzenlemek ve kolonileri korumak için Donald Weber ve Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) kabul edersiniz; ve Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) ve Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) koloni bakım, numune hazırlama ve analiz için.

1. BMSB yetiştirme
<ol><li>Arka BMSB böcekler başı olarak standart laboratuar uygulama ve yukarıda açıklanan63.</li>
	<li>Narenciye macrophylla üzerinde ACP (D. citri) böcekler glasshouse (22 ° C) ve doğal ışık yükseltmek. Yetişkin ACP kullanın, eclosion yaklaşık 5-7 gün sonrası.</li>
</ol>2. çeşitli gen bölgeleri ve In Vitro dsRNA sentezi
<ol><li>Genler belirli BMSB için daha önce yayımlanmış transcriptome profilleri32seçin.</li>
	<li>Seçili vade farkı bölgelerinde 200 ila 500 baz çifti arasında değişir emin olun.</li>
	<li>Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) seçili gen genomik DNA dan ilgi ile ilişkili parçaları oluşturmak için aşağıda açıklanan koşullar kullanarak gerçekleştirin. Gene özel oligonucleotides için bkz: Tablo 1 .<ol>
<li>PCR reaksiyon: 0.25 mL PCR tüp 5 µL PCR tampon, 4 µL dNTP karışımı (2.5 mM her), DNA şablonunun (50 ng/µL), 2,5 µL her astar 1 ve 2 (10 µM), DNA polimeraz (5 U/µL) 0,25 µL 2 µL X 10 birleştirmek , ve Dnaz/RNase free su 50 µL.</li>
		<li>PCR koşulu: bölge 95 ° c 3 dk 30 98 ° C devredir 10 ardından ilgi yükseltmek için PCR reaksiyon döngüsü s, 30 55 ° C s, 1 dk. Incubate tepki bir ek 10 dk. PCR reaksiyon kullanarak arındırmak için 72 ° C'de 72° C bir Arıtma kiti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T7 RNA polimeraz organizatörü dizisi ile çevrili gen belirli astar ile elde edilen PCR parçaları daha da yükseltmek (5'-GAA TTA ATA CGA CTC Yasası ATA GGG AGA-3') olarak bahsedilen önceki62.</li>
	<li>LacZ gene bir negatif kontrol (sahte) RNAi için kullanın. Not: LacZ β-galaktozidaz Escherichiacoli genomik DNA (kullanılan astar Tablo 1' de listelenen) güçlendirilmiş kodlar bir gen olduğunu.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon dsRNA açıklanan önceki62olarak vermeye gerçekleştirir.</li>
	<li>Dağıtılması ve 150 µL Dnaz/RNase free su elde edilen dsRNA resuspend, konsantrasyonu ölçmek ve-80 ° c ileride kullanmak üzere saklamak.</li>
</ol>3. teslimat dsRNA kullanma yeşil fasulye
<ol><li>Seçme erken 4th INSTAR BMSB perileri aynı yumurtadan kitle yumurta ve onları dsRNA besleme önce 24 h için açlıktan.</li>
	<li>İnce sertifikalı organik yeşil fasulye (Phaseolus vulgaris L.) seçin ve 5 min için % 0,2 sodyum hipoklorit çözüm ile yıkayın. Not: ince yeşil fasulye fasulye 2 mL microcentrifuge tüplerde rahatça kalabileceği böylece seçildi.</li>
	<li>GKD2ile O 3 kez yıkama ve kuru hava için sağlar.</li>
	<li>Calyx sonundan itibaren yeşil fasulye 7,5 cm temiz bir jilet kullanarak toplam uzunluğu için trim.</li>
	<li>Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulye kontrol çözümü 300 µL içeren bir kap daha az 2 mL microcentrifuge tüp sokmak (1:10 yeşil gıda boyası seyreltme (malzemeler: su, propilen glikol, Fd & C sarı 5, Fd & C mavi 1 ve Propylparaben olarak koruyucu)).</li>
	<li>Yapmak dilutions in vitro LacZ, JHAMT veya Vg dsRNAs 5 µg sulandrarak veya 300 µL 0.017 µg/µL veya 0,067 µg/µL, son konsantrasyonları sırasıyla vermeye RNase/Dnaz ücretsiz su içinde 20 µg sentezledim.</li>
	<li>Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulye dsRNA çözüm (Kimden adım 3.6) 300 µL içeren bir kap daha az 2 mL microcentrifuge tüp sokmak.</li>
	<li>Sarın ve dsRNA çözüm buharlaşma önlemek için ve hayvanlar microcentrifuge tüp girmesini önlemek için dalmış Fasulye kapsayan microcentrifuge tüpler kenarlarını kapatın.</li>
	<li>Bu tüpler yeşil fasulye kılcal eylem tarafından yüklenebilmesi dsRNA çözüm sağlamak 3 h için oda sıcaklığında dik bir şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Bu tüpler temiz kültür gemiler (polipropilen) yerleştirin. Yerde üç 4th INSTAR BMSB perileri kültür damarlarının açlıktan.</li>
	<li>Üç hayvan kültür gemi her üç yeşil fasulye ile yeşil gıda renklendirme veya dsRNA çözüm içeren tedavi. 16 L: 8D photoperiod bir kuluçka altında 25 ° C ve %72 bağıl nem, böcekler korumak.</li>
	<li>Yeşil (dalmış ve dsRNA ile emilir) fasulye beslenirler böcekler için 5 gün izin ama 3 gün sonra dsRNA tedavi yeşil boncuk taze yiyecek ile doldurmak.</li>
</ol>4. gerçek zamanlı kantitatif (qPCR) analizi, gen ifade aşağıdaki RNAi aracılı susturmak BMSB içinde
<ol><li>QPCR tarafından transkript ifadesi düzeyi RNAi etkisini ölçmek.</li>
	<li>Toplam RNA tedavi dsRNA hayvanlardan yalıtmak ve cDNA62sentez.</li>
	<li>Bir gerçek zamanlı PCR sistemi ve Tablo 1' de listelenen primerler kullanılarak qPCR reaksiyonlar Kur. Aşağıdaki qPCR Bisiklete binme koşul kullanma: 95 ° C 10 dk ardından 40 devredir 15 95 ° c s, 60 ° C için 1 dakika, 15 95 ° C de dahil olmak üzere ayrışma adım ile birlikte s, 60 ° C için 1 dakika, 15 95 ° C s ve 60 ° C 15 s.</li>
	<li>QPCR standartlar belirlemek: Toplam RNA miktar için referans standart olarak normal bir hayvan izole hazırlanan cDNA seri seyreltme kullanın.</li>
	<li>BMSB 18s RNA bir iç standart olarak RNA kurtarma doku32farklılıkları için düzeltmek için kullanın.</li>
</ol>5. yaprak sprey uygulama büyük saksı narenciye ağaçları ve fidan
Not: Narenciye çeşidinde 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), bitkilerin cam evdeki huysuz gibi doğal ışık ve sıcaklık, 1,2 L kaplarda yetiştirilen altında muhafaza. Bitkiler sürekli 'floş' adı verilen yeni yaprak sürgünler büyümesini teşvik için silinen. ACP yem ve narenciye64yeni büyüme üzerine oviposition için tercih ediyor.
<ol><li>Bitki veya fidan seçin ve bunları 2-3 gün toprağı nemli ama tamamen kuru kurumasına izin kullanmak için önceden su değil.</li>
	<li>Bir el pompası sprey şişe kullanmak alt tepeye (şekil 4A) 200 mL dsRNA çözeltisi (0,5 mg/mL) uygulanır. Not: Yukarıdaki hazırlamak Dnaz/RNase free su çözümlerinde dsRNA bahsetti.</li>
	<li>Uygulama sonrası sprey, tamamen yaprakları tarafından absorbe edilebilir uygulanan dsRNA çözüm sağlar. Not: Narenciye ağaçları uygulanan dsRNA emilir ve sonra yaprakları ya da yeni büyüme veya uygulama öncesinde kaplıydı dalları ayıklanır; dsRNA qPCR kullanarak tespit ve sistemik hareket ağaç üst kubbe yaprakları içine 3-4 h44,45,46de gösterdi.</li>
	<li>25-40 toplayarak gün yaklaşık 10 dört şubeler keyif--dan ayrıldıktan sonra daha önce tepesinde ağaçlarından yeni büyüme örnek. Toplam RNA ayıklamak ve ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) tarafından analiz ve qPCR primerler kullanılarak uygulanan dsRNA tetikleyici varlığı için tablo 1'de listelenen ve daha önce açıklanan yöntemleri46. Not: Örnek toplanması, toplam RNA izolasyon, RT-PCR ve qPCR yukarıda açıklanan46yapıldı.</li>
	<li>Benzer şekilde, topikal 10 mL dsRNA bir fide veya küçük saksı ağaç yapraklar alt bölgesine sprey. Not: Hemipteran böcekler (ACP ve GWSS) normalde 24 h beslenme erişim verildi, hangi değil doğrudan püskürtülür veya hangi hafta sonra büyüdü yeni büyüme (yaprak), ya da tüm bitki tedavisi sonrası. Bu böcekler dsRNA doğumdan 3, 6 ve 10 gün için hangi test pozitif sonrası beslenme üretti.</li>
</ol>6. toprak/Root Drench uygulamada büyük ya da küçük narenciye ağaçları ve fidan saksı
<ol><li>Bitki veya fidan seçin ve bunları 2-3 gün toprağı nemli değil kurumasına izin kullanmak için önceden su değil tamamen kuru (bu sıvı çözüm uygulanması için tutmak için hava alanı oluşturur).</li>
	<li>DsRNA çözüm (0.2 mg/mL) 1 L büyük Saksı bitkileri (yaklaşık 2,5 m) toprağa ekleyin ve 1 saat sonra 1 litre su (cila) ekleyin.</li>
	<li>100 mL dsRNA çözeltisi (1.33 mg/mL) 1 m boyunda toprak saksı ağaçları kısmen kuru topraklarda uygula.</li>
	<li>Küçük Fideler için 10 mL dsRNA çözeltisi (1 mg/mL) koniler toprakta veya çıplak kökleri (şekil 4B, C) uygulanır.</li>
	<li>İzin almak için 30 dk emmesi için bir toprak drench olarak uygulanan dsRNA çözüm bitkiler. O zaman daha büyük bitki kapları > 1 galon Eğer absorpsiyonu kökleri (20 mL sarı kaplarda bitkiler için) veya 100 mL ile yardım etmek için düz su tek tedavi uygulanır. Not: Yeşillik için topikal uygulanan dsRNA şube 3-6 h mesaj tedaviler, ağaçlar sistemik hareketi gösterilen içinde en distal ipuçları algılama ile sonuçlandı. Yeni büyüme dalları dsRNA 60-90 gün sonrası tedaviler, pozitif. Kupürleri böcekler (ACP ve GWSS) bir dsRNA bioassay44besleme sağlanır.</li>
</ol>7. kök dokunun (ağaç gövde enjeksiyon) uygulamada büyük saksı narenciye ağaçları ve fidan
<ol><li>Narenciye Fidan, yeni veya yaklaşık 3,5 yıl kök kullanarak dsRNA enjekte için eski bitkiler dokunun (gövde enjeksiyonları) yöntemi seçin.</li>
	<li>Bir matkap ve 2 cm veya kök yaklaşık yarım çap aşmayacak şekilde dikkat çekici bir 10 mm matkap biraz kullanarak narenciye bitki delik.</li>
	<li>Her enjektör bakır ucu ucuna yakın kaçağı önlemek için film sızdırmazlık 4 - 6 kez bir 0.6 cm (¼ inç) geniş şerit ile sarın.</li>
	<li>Ağaç gövde enjektörleri Dnaz/RNase free suda seyreltilmiş dsRNA çözüm 6 mL (1.7 mg/mL) ile doldurulması (ile belirtilen burada renkli çözüm olarak).</li>
	<li>Çözüm ağaç gövde içine enjekte ve enjektör dsRNA çözüm emilimini izin vermek 6-10 h için bagajda bırak. Böcekler 3, 10 ve 30 gün sonrası tedavi tedavi ağaçlarından kesimler üzerinde beslemek izin. Not: gövde enjeksiyon yöntemi kullanarak enjekte dsRNA ağaçların arasında 30-60 gün41,42,44bir süre için kalıcı. Doğrulama RNAi için Tablo 1' de listelenen primerler kullanılarak qPCR tarafından gerçekleştirildi.</li>
</ol>8. dsRNA tedavi kil granül teslim edilmek üzere böcekler aracılığıyla toprak
<ol><li>Kil emici tüp 35 mL işaretine (yaklaşık 30 g kil emici) 50 mL konik tüp içine dökmek.</li>
	<li>20 mL dsRNA çözeltisi (100 µg/mL) Dnaz/RNase free suda seyreltilmiş tüm emici ıslak için tüp dökün. Cap konik tüp, tüp hava kaldırmak için ipucu ve tüp kap.</li>
	<li>Tüp dik koyun ve 1-2 min için çözüm emmek kil parçacıkları için stand izin verin.</li>
	<li>Yeterli dsRNA batırılmış kil 1 galon potu doldurmak için toprak karışımı içine ekleyin.</li>
	<li>Mix ve el ile iyice dsRNA batırılmış kil toprak karıştırmak için toprağı.</li>
	<li>Bu toprak dsRNA tedavisi için seçili fidan repot için kullanın.</li>
	<li>Su 200 mL dsRNA olmadan sade su ile toprak. 1 h 30 dk sonra sade su ile 100 mL izleyin. 24 saat sonra normal sulama zamanlamaya göre bitki koymak.</li>
	<li>Tedavi Saksı bitkileri kil emiciler ve dsRNA ile 4-6 yaprakları dsRNA için her ay sonrası tedavi yeni bitki büyüme en apikal yaprakları toplayarak sınayın. Not: Bitki veya kesimler bu tedavi bitkilerden böcekler için herhangi bir süre sonra 24 saat tedavi sonrası ve böcekler (yayınlanmamış veri) teslim RNAi için bir yıl kadar mümkün olmuştur beslenir.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

RNAi gen biyolojik işlev ve düzenleme, böcek zararlıları19,68,69,70, yönetimi için kullanılmak üzere büyük potansiyeli keşfetmek için önemli bir araç olarak kanıtlamıştır 71. tasarım ve belirli bir böcek türü ve karşılık gelen dsRNA(s) böcek için teslim yöntemi susturulması için uygun bir gene(s) seçim ikisi son derece önemlidir. Bazı yöntemleri avantajları ve...

Hemipteran böcekler bazı yüksek nüfus artışı elde ettiği ve bitki hastalık yaymak için agriculturebecause yeteneklerini en ekonomik olarak önemli zararlıları oluşturmaktadır. BMSB, H. halys Stål, yanlışlıkla Allentown, Pennsylvania (Çin, Tayvan, Kore ve Japonya) Asya'dan Batı yarımkürede 19961' de rapor ilk nişan ile kullanılmaya başlanan bir invaziv zararlı olduğunu. Yana, BMSB 43 Devletler'de, Orta Atlantik (DE, MD, PA, NJ, VA ve WV) yanı sıra Kanada ve Avrupa'da, en yüksek nüfus ile tespit etti ve tarım2için potansiyel bir tehdit temsil eder. Polyphagous baş belası BMSB elma, üzüm, süs bitkileri, tohum bitkileri, soya ve Mısır gibi yüksek değerli bitkileri de dahil olmak üzere yaklaşık 300 tanımlanan bitki ana bilgisayarlara zarar isteyip başlatabilir. Hasar nedeniyle öncelikle hayvan ana ürün erişmek için besin damar doku2,3, iğne gibi stylet ile delip geçiyor nerede lacerate ve floş olarak bilinen besleme modu neden olur. BMSB okullar gibi yaşam alanları içinde ikamet bulabilirsiniz ayrıca kapalı bir haşere ve sonbahar kış2sırasında evler. Kimyasallar ve BMSB tarafından yayımlanan aeroallergens meyve kırpma işçileri yasadışı Alerjik reaksiyon için rapor edilmiştir. BMSB de alerjik hastalık Kontakt Dermatit, konjonktivit ve duyarlı bireyler4,5rinit için katkıda bulunabilir. Başka bir hemipteran böcek, ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), narenciye ciddi bir zararlı olduğunu ve Huanglongbing (HLB), daha çok bilinen neden phloem sınırlı bakteri (olan Liberibacter asiaticus) iletir narenciye greening hastalığı6,7olarak. HLB ilk Güney Çin bildirildi ve 40 farklı Asya, Afrika, Okyanusya, Güney ve Kuzey Amerika ülkeleri7' ye yayıldı. Narenciye greening ekonomik ve mali kayıp narenciye meyve kaybı nedeniyle tehdit ile dünya çapında bir sorundur; Bu nedenle, ACP yönetimi önlemek ve HLB denetlemek için çok önemli olarak ele alınır.
Bu böcek zararlıları etkin denetimini önlemleri genellikle gerektirir nispeten kısa kimyasal böcek ilaçları uygulanması yaşadı. Kimyasal Böcek ilacı denetim stratejileri genellikle güvenli Çevre Yönetim Stratejileri eksikliği veya duyarlılık nedeniyle pestisit direnç haşere nüfus8,9düştü. Bu nedenle, moleküler biopesticides olan biyolojik mücadele potansiyel bir alternatif, ama kullanımı genel olarak mütevazı kalır, ve parasitoids (örneğin, Trisolcus japonicus) çeşitli türlerin de doğal biyolojik etkili olabilir denetimleri. RNAi teknolojisi moleküler biopesticides10ile invaziv böcek zararlıları yönetmek için ortaya çıkan bir potansiyeldir. RNAi, endojen sonunda mRNA, gen ifadesinin düzenlenmesinde yol açar fingerprinting şekilde, dsRNAs istila yanı sıra etkili posttranscriptional gen susturulması kolaylaştırır bir de açıklanan gen düzenleyici mekanizma olduğunu seviye11,12. Eksojen dsRNA bu bidentate nükleaz RNase III süper bir üyesi tarafından çift işlenir bir hücre içine içselleştirilmiş, kısaca, evrimsel solucanlar, sinekler, bitkiler, mantarlar ve memeliler13, korunmuş Dicer aradı 14 , 15. bu 21-25 nükleotit siRNA dubleks sonra sapmasına ve RNA-induced silencing kompleksi (RISC) RNA'ların rehber olarak entegre. Bu RISC-RNA kompleksi Watson-Crick baz eşleşmesi sağlar tamamlayıcı için hedef mRNA; Bu sonunda Argonaute protein, karşılık gelen mRNA düşürür ve protein çeviri, böylece posttranscriptional gene16 susturmak için önde gelen azaltır bir RNase H benzeri etki alanı içeren bir çoklu etki alanı protein tarafından bölünme için açar , 17 , 18.
RNAi haşere yönetimi için faiz, gen susturmak için dsRNA vivo içinde giriş böylece siRNA yolu etkinleştirme gerektirir. 10,1920,21, mikroenjeksiyon22, taşıyıcılar gibi lipozomlar iliklerine kadar besleme için dsRNA teslim böcekler ve böcek hücreleri sistemik RNAi ikna etmek için kullanılmış çeşitli yöntemleri içerir 23ve diğer teknikleri24. RNAi unc-22 gen ekspresyonu yangın tarafından susturmak için ilk Caenorhabditis elegans gösterdi ve Mello25nakavt Drosophila melanogaster26frizzled genlerin ifadesinde ardından, olmuştur. İlk fonksiyonel çalışmalar mikroenjeksiyon böceklerde, Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29gibi dsRNA teslim etmek için kullanılan, H. halys30ve Lepidoptera böcekler (Terenius ve ark. tarafından gözden 31). mikroenjeksiyon böcek ilgi sitenin doğru ve hassas bir doz sunmak için avantajlı. De olsa böyle septik delikler ifade onun pratiklik tarım biopesticides geliştirme dışarı iktidar bağışıklık ilgili genlerin travma32, dolayısıyla, nedeniyle çıkarmak.
DsRNA vivo içinde teslim başka bir ıslatarak, hangi yenmesi veya dsRNA genellikle ekstraselüler ortamda dsRNA içeren absorpsiyonu hayvanlar veya hücrelerin süspansiyon ile ilgili bir yöntemdir. İliklerine kadar verimli bir şekilde RNAi Drosophila S2 doku kültürü hücrelerin Downstream Raf1 (DSOR1) mitojenle-aktive protein kinaz kinaz (MAPKK)20etkisizleştirmek için hem de susturmak için C. elegans ikna etmek için kullanılmıştır POS-1 gen33. Ancak, iliklerine kadar kullanılarak teslim dsRNA mikroenjeksiyon20' ye göre RNAi ikna etmek için daha az etkilidir. Aracılı RNAi çiğneme bir böcek susturmak ilk bir yapay agar diyet10dsRNA beslerken tarafından Batı Mısır rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) gösterildi. Önceki raporları yöntemleri doğal diyetler eklembacaklılar34için belirli infüzyon dsRNA teslim özetledik. Bu teslim yöntemi daha fazla kıyaslanabilir teslim yapay araçlarının etkili olduğu belirlenmiştir; çeçe sineği (Glossina morsitans morsitans), nerede bir bağışıklık ile ilgili gen eşit nakavt kan yemek veya microinjected35ile dsRNA ne zaman teslim edildiği gözlenmiştir olgusu gibi. Benzer şekilde, dsRNA hafif kahverengi elma güve (Epiphyas postvittana)36, diamondback güve (Plutella xylostella) larvaları37yanı sıra bal arıları38,39 damlacıklar yoluyla teslim verimli RNAi indüklenen. Oral dsRNA hemipteran böceklerde teslimini ana bitkinin Vaskular dokuları teslim edilmelidir beri zorlu çünkü en etkili RNAi deneylerde hemipteran enjeksiyon dsRNA40 kullanılan. Etkili RNAi Ayrıca gözlenen ACP ve camsı kanatlı keskin nişancı leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA narenciye ve dsRNA kök drench, yaprak aracılığıyla damar doku içine absorbe asma aracılığıyla teslim edildi spreyler, gövde enjeksiyonları veya absorpsiyonu ile kesimler41,42,43,44,45,46. Bu da ACP (2016, bize 20170211082 A1) karşı dsRNA için ilk patent sonuçlandı. SiRNA ve dsRNA gemileri nano tanecikleri ve lipozomlar kullanarak istikrar kazandırır ve teslim edilen dsRNA etkinliği artışlar hızla23,47,48,49 ortaya çıkıyor ,50. Teslimat nanoparçacık tabanlı araçlar vitro ve in vivo uygun teslimat51vektörler gibi özellikle tedavi uygulamaları muazzam potansiyel vermek için bu özetlendiği nükleik asitler için yeni bir sınıf. Nano tanecikleri dsRNA için bir teslimat araç olarak çözünürlük, hydrophobicity veya sınırlı biyoakümülasyon52gibi dezavantajları olabilir, ama uygun polimer yardım teslim bu dezavantajları telafi. Geliştirme ve nükleotid kendi kendine teslim kullanım da 'tek iplikçikli RNA/DNA dubleks46olan denilen antianlamlı oligonucleotides', ortaya çıkıyor.
Vitellogenesis eklembacaklılar içinde bir anahtar olduğunu kontrol etmek üreme süreci ve Juvenil hormon (JH) veya ecdysone tarafından düzenlenir, vücut yağ tarafından; Vg sentezi anahtar indükleyicileri olduğu Vg sonunda Vg reseptör aracılı endositoz53ile gelişmekte olan oosit tarafından kaplıyor. VG polipeptitler bir grup büyük yumurta sarısı protein vitellin54,55, gelişimi için gerekli olan extraovarially, sentez ve bu nedenle, önemli üreme ve yaşlanma56olmasıdır. VG nematodlar57 de başarıyla susturuldu yanı sıra nerede RNAi Vg tükenmesi aracılı bal arı (Apis mellifera) Yetişkin ve yumurta22yılında gözlendi. Çünkü bu onun tükenmesi gözlemlenebilir fenotipik efekt gibi yol açacak düşünüldü aracılı posttranscriptional gen Vg susturmak test RNAi doğurganlık ve potansiyel olarak BMSB kontrol yardımcı olmak için verimlilik, azaltılmış. S-adenosyl-L-metiyonin (SAM) kodlar JHAMT gen-bağımlı JH asit O-Metiltransferaz, tromboksan JH biyosentezi yolu58son adım. Bu yolu farnesyl pirofosfat (FPP) ardışık olarak farnesol JH JHAMT tarafından metil farnesoate dönüşüm ardından farnesoic aside dönüşür. Bu yolu böcekler ve eklembacaklılar metamorfoz, developmentally hormonlar59,60,61tarafından denetlenmektedir bir işlem için özel olarak korunmuş. B. moriJHAMT gen ekspresyonu ve Corpora allata JH biyosentetik faaliyete JHAMT gen transkripsiyon bastırılması JH biyosentezi58sona erdirilmesi için çok önemli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, JHAMT ile Vg gen RNAi kullanarak hedeflenen tükenmesi için seçildi. RNAi Ayrıca narenciye ağaçları ACP ve GWSS kontrolü için test edildi. Narenciye ağaçları dsRNA kök drench aracılığıyla ile tedavi edildi, dsRNAs karşı böcek belirli arginin kinaz (AK) Tutanaklar42,44ile yaprak spreyleri yanı sıra dokunun (gövde enjeksiyon), kök. DsRNA topikal uygulama her yerinde bitkiler damar doku üzerinden verimli bir şekilde teslim gösteren ve ACP ve GWSS41,42, artmış mortalite sonuçlandı narenciye ağaçları, gölgelik algılandı 45.
Mevcut çalışmada, biz dsRNA gibi tedaviler için doğal diyet Teslimat yöntemi belirledik. Yeni geliştirilen bu teknik daha sonra JHAMT ve Vg susturmak için kullanılan gen belirli dsRNAs BMSB perileri kullanılarak mRNA önceki62gösterdi. Bu yeni teslim iletişim kuralları aşağıda gösterildiği topikal spreyler veya microinjections kullanmak geleneksel RNA dağıtım sistemlerinin yerini. Sebze ve meyve, kök dokunun, drenching toprak ve kil emiciler biopesticide zararlı ve hastalık yönetimi sürekli gelişimi için kritik olan dsRNA, teslimi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) böcekleri&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) böcekleri&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>organik yeşil fasulye</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narenciye bitkileri</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum hipoklorit çözeltisi</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeşil gıda boyası&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termo Forma odaları&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta kap (Kültür)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primerler&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Uygulamalı Biyosistemler&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprey şişesi</td><td>N / A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amerikan Can Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

phloem ve hemipteran böcekler bitki su besleme rna müdahale ikna etmek için çift iplikçikli rna oral teslim yöntemleri

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem ve bitki su besleme böcekler bitkileri ve meyve gıda bitkileri zarar sürecinde besin almak için bütünlüğünü istila. Hemipteran böcekler bitkilerin bitkileri zarar phloem sap üzerinde besleyerek ekonomik açıdan önemli zararlıları bir dizi hesap. Kahverengi marmorated koku hata (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) ve Asya narenciye psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) çoğu Kuzey Amerika'da tanıttı hemipteran böcek zararlıları nerede onlar Ne zaman onlar kapalı toplam değeri yüksek özel, satır ve elyaf bitkileri ve narenciye invaziv bir tarımsal haşere yanı sıra bir baş belası zararlı vardır. Pek çok tür böcek ilacı direniş haşere Yönetim Stratejileri alternatif yöntem geliştirme için açmıştır. Çift iplikçikli RNA (dsRNA)-aracılı RNA müdahale (RNAi) fonksiyonel genomik çalışmalar için böcek zararlıları yönetimi için bir araç olarak potansiyel uygulamalar olan mekanizma susturmak bir gen olduğunu. Exogenously sentezlenen dsRNA veya küçük müdahale RNA (siRNA) sunulan bu homolog endojen RNA bozulması ile yüksek verimli gen susturmak tetikleyebilir. Etkili ve çevresel RNAi moleküler biopesticides olarak için kullanımı biyolojik hemipteran böceklerin besleme yoluyla dsRNAs vivo içinde teslim gerektirir. Burada dsRNA teslim edilmek üzere böcekler yöntemleri göstermektedir: dsRNA yeşil fasulye daldırma tarafından yükleme ve gene özgü dsRNA yenmesi ile oral teslimat ile emici. Biz de transgenik olmayan bitki teslim yaklaşımlar yaprak Spreyleri, kök drench, gövde enjeksiyonları yanı sıra kil granülleri, tüm bunların dsRNA sürekli serbest bırakılması için gerekli olabilir kullanarak belirttiğimiz. Verimli bir şekilde teslim sözlü olarak alınan dsRNA tarafından hedeflenen genler, Juvenil hormon asit O-Metiltransferaz gibi (JHAMT) ve vitellogenin (Vg) ifadesi önemli bir azalma ikna etmek için etkili bir doz olarak teyit edildi. Bu yenilikçi yöntemler stratejileri bitki koruma kullanın ve haşere yönetimi için çevresel zorlukların üstesinden gelmek için dsRNA teslim etmek için temsil eder.

Sebze aracılı dsRNA teslim BMSB 4th INSTAR perileri besleme yoluyla moleküler biopesticides RNAi invaziv böcek zararlıları için kullanarak gelişimi için test edildi. BMSBs yem olarak bilinen bir mekanizma tarafından onların iğne gibi stylets kullanarak lacerate ve floş, hangi bitkileri için önemli hasara neden olur. İnce organik yeşil fasulye, P. vulgaris L., besin veya dsRNA vivo içinde BMSB için beslenme3' ten teslim Eğer test etmek i...

Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Bu prosedürlerin genel amacı, doğal bir oral uygulama yöntemini göstermektir. Gene özgü dsRNA'lar için, in vivo ve böcek zararlılarında RNA girişimini indüklemek için. Bu yöntem, böceklerin içine biyomoleküllerin nasıl verileceği, RNAi bazlı Moleküler biyopestisitlerin etkisinin aydınlatılması ve çevredeki böceklerin kontrol edilmesi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, nükleik asit aracılı gen susturma yoluyla bu dağıtımın, çiğneme böceklerinin yanı sıra bitki özsuyu beslemesine de uygulanabilmesidir. Buradaki yöntemler, çift sarmallı RNA'nın kahverengi zırhlı kokuşmuş böcek, alacalı böcek ve asya turunçgil psillidi gibi hemipteran zararlılara verildiğini gösterse de. Diğer böceklere de uygulanabilirler.Protokole başlamak için, yumurta kütlesinden yumurtadan çıkan erken 4. Instar kahverengi parçalanmış kokuşmuş böceği veya BMSB Nimflerini seçin ve dsRNA beslemesinden 24 saat önce onları aç bırakın. Daha sonra, ince, sertifikalı organik yeşil fasulyeleri seçin ve beş dakika boyunca% 0.2 Sodyum Hipoklorit çözeltisi ile yıkayın. Ardından üç adet çift damıtılmış H2O yıkama yapın ve çekirdeklerin kurumaya bırakın.Kuruduktan sonra, yeşil fasulyeleri temiz bir tıraş bıçağı kullanarak kaliks ucundan toplam 7,5 santimetre uzunluğa kadar kesin. Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulyeleri 300 mikrolitre kontrol solüsyonu içeren kapaksız, iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne daldırın. 5 mikrogram veya 20 mikrogram ve 300 mikrolitre RNA, DNA içermeyen suyu seyrelterek in vitro sentezlenmiş lak Z, JHAMT veya VGDSRNA'ların seyreltilmesini yapın ve mikrolitre başına 0.017 mikrogram veya mikrolitre başına 0.067 mikrogram nihai konsantrasyonlar elde edin.Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulyeleri 300 mikrolitre dsRNA çözeltisi içeren kapaksız, iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne daldırın. DsRNA çözeltisinin buharlaşmasını önlemek ve hayvanların mikro santrifüj tüpüne girmesini önlemek için daldırılmış çekirdekleri çevreleyerek mikro santrifüj tüplerinin kenarlarını sarın ve kapatın. DsRNA çözeltisinin kılcal hareket ile yeşil fasulye boyunca yüklenmesine izin vermek için tüpleri üç saat boyunca oda sıcaklığında dik olarak konumlandırın.Tüpleri temiz, polipropilen kültür kaplarına yerleştirin ve 3 aç 4. Instar BMSB nimfini kültür kaplarına yerleştirin. Kültür kabı başına üç böceği tedavi edin. Her biri yeşil gıda boyası veya dsRNA çözeltisi içeren üç yeşil fasulye içerir.Böcekleri 25 santigrat derece ve% 72 bağıl nemde, 16L, 8D'nin altında tutun bir inkübatörde fotoperiyot. Böceklerin beş gün boyunca dsRNA'ya batırılmış ve emilmiş yeşil fasulyelerle beslenmesine izin verin ve üç gün sonra onları dsRNA ile muamele edilmiş yeşil fasulyelerin taze diyetleriyle doldurun. Bitkileri veya fideleri seçin ve toprağın nemlenmesine izin vermek, ancak tamamen kurumasını önlemek için kullanmadan önce iki ila üç gün boyunca sulamayın.Elle pompalanan bir sprey şişesi kullanarak, alt kanopiye 200 mililitre dsRNA çözeltisi uygulayın. Dört dalın uçlarından yaklaşık 10 yaprak toplayarak, 25 ila 40 gün sonra, daha önce tepelenmiş ağaçlardan yeni büyümeyi örnekleyin. Toplam RNA'yı çıkarın ve uygulanan dsRNA tetikleyicisinin varlığı için RT-PCR ve qPCR ile analiz edin.Benzer şekilde, bir fidanın veya küçük saksılı ağaç yapraklarının alt bölgesine topikal olarak 10 mililitre dsRNA püskürtün. Bitkileri veya fideleri seçin ve toprağın kurumasına, nemlenmesine izin vermek, ancak tamamen kurumaması için kullanmadan önce iki ila üç gün boyunca sulamayın. Daha sonra, büyük saksılı bitkilerin toprağına bir litre dsRNA çözeltisi ekleyin.Bir saat sonra bir litre su ekleyin. Kısmen kuru topraklarda bir metre uzunluğundaki saksı ağaçlarının toprağına 100 mililitre dsRNA çözeltisi uygulayın. Bitkilerin dsRNA çözeltisini toprakla ıslatma olarak almasına ve 30 dakika ıslanmasına izin verin.Daha sonra kökler tarafından emilmesine yardımcı olmak için sadece sade su tedavisi uygulayın. Gövde enjeksiyonları yöntemi olarak da bilinen gövde musluğunu kullanarak dsRNA enjekte etmek için narenciye fidelerini, yeni veya yaklaşık 3,5 yıllık bitkileri seçin. Ucun yakınında sızıntıyı önlemek için her enjektörün bakır ucunu 0,6 santimetre genişliğinde bir tavan filmi şeridi ile dört ila altı kez sarın.Daha sonra, ağaç gövdesi enjektörlerini DNA'lar, RNA içermeyen su ile seyreltilmiş altı mililitre dsRNA çözeltisi ile doldurun. Narenciye bitkilerinde 10 mililitrelik bir matkap ucu kullanarak delikler açın ve iki santimetreyi veya sap çapının yaklaşık yarısını geçmemeye dikkat edin. Ardından, çözeltiyi ağaç gövdesine enjekte edin ve dsRNA çözeltisinin emilmesine izin vermek için enjektörü altı ila 10 saat boyunca gövdede bırakın.Böceklerin, tedaviden 3, 10 ve 30 gün sonra işlenmiş ağaçlardan elde edilen kesimlerle beslenmesine izin verin. 30 gram kil emiciyi 50 mililitrelik konik bir tüpe 35 mililitre işaretine kadar dökün. DNA'larda seyreltilmiş 20 mililitre dsRNA çözeltisini, RNA'sız suyu tüm emici maddeyi ıslatmak için tüpe dökün.Konik tüpü kapatın, havayı çıkarmaya yardımcı olmak için tüpü eğin ve tüpü dik olarak yerleştirin ve kil parçacıkları çözeltiyi emerken bir ila iki dakika bekletin. Bir galonluk bir tencereyi doldurmak için toprak karışımına yeterince dsRNA ile ıslatılmış kil ekleyin. DsRNA ile ıslatılmış kili toprağa iyice karıştırmak için toprağı elle karıştırın ve çevirin.dsRNA tedavisi için seçilen fideleri yeniden saksılamak için toprağı kullanın. Toprağı 30 dakika ila bir saat sonra dsRNA olmadan 200 mililitre sade su ile sulayın. Ardından 100 mililitre sade su ile takip edin.24 saat sonra bitkiyi normal bir sulama programına alın. Yeni bitki büyümesinin en apikal yapraklarını toplayarak, dsRNA için tedaviden sonra, her ay işlenmiş saksı bitkilerinin dört ila altı yaprağını kil emiciler ve dsRNA ile test edin. Kahverengi marmorated kokuşmuş böceğe veya BMSB mRNA'ya özgü in vitro sentezlenmiş dsRNA'ya daldırılmış yeşil fasulye segmentlerinin QPCR'si, JHAMT ve Vg hedeflerinin ekspresyonu in vivo olarak RNAi'nin başarılı bir şekilde indüksiyonunu gösterdi.Bu dağıtım yöntemi, başka bir hemipteran zararlısı olan alacalı böcek üzerinde de etkilidir. Yeşil renkli dışkıları ile belirtildiği gibi. Bu görsel gösterileri izledikten sonra, RNAi böceklerini in vivo olarak indüklemek için oral yutma yoluyla böceklere çift sarmallı RNA'nın nasıl verileceğini iyi anlamış olmalısınız.RNAi nükleotid teknolojisinde kaydedilen ilerlemeler, araştırmacıların çok çeşitli canlı organizmalarda RNA, gen ekspresyonu ve protein seviyelerini modüle etme yeteneklerini genişletmeye devam ediyor. Bu bitkilerden böceklere ve en zor mikroorganizmalara kadar gider. Bu nedenle, çift sarmallı RNA'nın üretim maliyeti düşmeye devam ederken ve dağıtım ve stabilite yöntemleri gelişmeye devam ederken, RNAi teknolojilerinin geleceği ortaya çıkan, karmaşık sorunları çözmek için kullanılmaya devam edecektir.

double-stranded-rna-oral-delivery-methods-to-induce-rna-interference

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Bu el yazması Almanca hamamböceği lipozomlar içinde kapsüllü çift iplikçikli RNA'ın sözlü sindirim yoluyla gen ifadesinin içinde midgut tükenmesi gösterir.

RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Mevcut protokol, yapay bir ortam kullanarak delici emen böceklerden yeterli tükürük toplama yöntemini açıklar. Bu, böcek tükürüğü toplamak ve böcek besleme davranışı ve vektör kaynaklı virüs iletimi üzerinde tükürük fonksiyonunu incelemek için uygun bir yöntemdir.

Laodelphax striatellus Tükürük Koleksiyonu için İki Katmanlı Membran Sandviç Yöntemi

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus'ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

RNA girişiminin (RNAi) manipülasyonu, Trichogramma yaban arıları gibi küçücük boyuta sahip birçok parazitoid türünde zorlu bir zorluk teşkil eder. Bu çalışma, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemini tanımlamıştır. Mevcut metodoloji, Trichogramma yaban arılarında gen regülasyonunu araştırmak için sağlam bir model sunmaktadır.

Yumurta Parazitoidinde RNA Girişimi, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

Keşfedin bitki damar dokuları üzerinden çift iplikçikli RNA oral teslim yöntemlerini ve Hemipteran böceklerde RNA müdahalesi uygulamasını. Bu teknik, gen susturma ve zararlı kontrolü için sürdürülebilir biyopestisit çözümleri sunar.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Daha fazla video keşfet