Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Bu prosedürlerin genel amacı, doğal bir oral uygulama yöntemini göstermektir. Gene özgü dsRNA'lar için, in vivo ve böcek zararlılarında RNA girişimini indüklemek için. Bu yöntem, böceklerin içine biyomoleküllerin nasıl verileceği, RNAi bazlı Moleküler biyopestisitlerin etkisinin aydınlatılması ve çevredeki böceklerin kontrol edilmesi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, nükleik asit aracılı gen susturma yoluyla bu dağıtımın, çiğneme böceklerinin yanı sıra bitki özsuyu beslemesine de uygulanabilmesidir. Buradaki yöntemler, çift sarmallı RNA'nın kahverengi zırhlı kokuşmuş böcek, alacalı böcek ve asya turunçgil psillidi gibi hemipteran zararlılara verildiğini gösterse de. Diğer böceklere de uygulanabilirler.

Protokole başlamak için, yumurta kütlesinden yumurtadan çıkan erken 4. Instar kahverengi parçalanmış kokuşmuş böceği veya BMSB Nimflerini seçin ve dsRNA beslemesinden 24 saat önce onları aç bırakın. Daha sonra, ince, sertifikalı organik yeşil fasulyeleri seçin ve beş dakika boyunca% 0.2 Sodyum Hipoklorit çözeltisi ile yıkayın. Ardından üç adet çift damıtılmış H2O yıkama yapın ve çekirdeklerin kurumaya bırakın.

Kuruduktan sonra, yeşil fasulyeleri temiz bir tıraş bıçağı kullanarak kaliks ucundan toplam 7,5 santimetre uzunluğa kadar kesin. Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulyeleri 300 mikrolitre kontrol solüsyonu içeren kapaksız, iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne daldırın. 5 mikrogram veya 20 mikrogram ve 300 mikrolitre RNA, DNA içermeyen suyu seyrelterek in vitro sentezlenmiş lak Z, JHAMT veya VGDSRNA'ların seyreltilmesini yapın ve mikrolitre başına 0.017 mikrogram veya mikrolitre başına 0.067 mikrogram nihai konsantrasyonlar elde edin.

Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulyeleri 300 mikrolitre dsRNA çözeltisi içeren kapaksız, iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne daldırın. DsRNA çözeltisinin buharlaşmasını önlemek ve hayvanların mikro santrifüj tüpüne girmesini önlemek için daldırılmış çekirdekleri çevreleyerek mikro santrifüj tüplerinin kenarlarını sarın ve kapatın. DsRNA çözeltisinin kılcal hareket ile yeşil fasulye boyunca yüklenmesine izin vermek için tüpleri üç saat boyunca oda sıcaklığında dik olarak konumlandırın.

Tüpleri temiz, polipropilen kültür kaplarına yerleştirin ve 3 aç 4. Instar BMSB nimfini kültür kaplarına yerleştirin. Kültür kabı başına üç böceği tedavi edin. Her biri yeşil gıda boyası veya dsRNA çözeltisi içeren üç yeşil fasulye içerir.

Böcekleri 25 santigrat derece ve% 72 bağıl nemde, 16L, 8D'nin altında tutun bir inkübatörde fotoperiyot. Böceklerin beş gün boyunca dsRNA'ya batırılmış ve emilmiş yeşil fasulyelerle beslenmesine izin verin ve üç gün sonra onları dsRNA ile muamele edilmiş yeşil fasulyelerin taze diyetleriyle doldurun. Bitkileri veya fideleri seçin ve toprağın nemlenmesine izin vermek, ancak tamamen kurumasını önlemek için kullanmadan önce iki ila üç gün boyunca sulamayın.

Elle pompalanan bir sprey şişesi kullanarak, alt kanopiye 200 mililitre dsRNA çözeltisi uygulayın. Dört dalın uçlarından yaklaşık 10 yaprak toplayarak, 25 ila 40 gün sonra, daha önce tepelenmiş ağaçlardan yeni büyümeyi örnekleyin. Toplam RNA'yı çıkarın ve uygulanan dsRNA tetikleyicisinin varlığı için RT-PCR ve qPCR ile analiz edin.

Benzer şekilde, bir fidanın veya küçük saksılı ağaç yapraklarının alt bölgesine topikal olarak 10 mililitre dsRNA püskürtün. Bitkileri veya fideleri seçin ve toprağın kurumasına, nemlenmesine izin vermek, ancak tamamen kurumaması için kullanmadan önce iki ila üç gün boyunca sulamayın. Daha sonra, büyük saksılı bitkilerin toprağına bir litre dsRNA çözeltisi ekleyin.

Bir saat sonra bir litre su ekleyin. Kısmen kuru topraklarda bir metre uzunluğundaki saksı ağaçlarının toprağına 100 mililitre dsRNA çözeltisi uygulayın. Bitkilerin dsRNA çözeltisini toprakla ıslatma olarak almasına ve 30 dakika ıslanmasına izin verin.

Daha sonra kökler tarafından emilmesine yardımcı olmak için sadece sade su tedavisi uygulayın. Gövde enjeksiyonları yöntemi olarak da bilinen gövde musluğunu kullanarak dsRNA enjekte etmek için narenciye fidelerini, yeni veya yaklaşık 3,5 yıllık bitkileri seçin. Ucun yakınında sızıntıyı önlemek için her enjektörün bakır ucunu 0,6 santimetre genişliğinde bir tavan filmi şeridi ile dört ila altı kez sarın.

Daha sonra, ağaç gövdesi enjektörlerini DNA'lar, RNA içermeyen su ile seyreltilmiş altı mililitre dsRNA çözeltisi ile doldurun. Narenciye bitkilerinde 10 mililitrelik bir matkap ucu kullanarak delikler açın ve iki santimetreyi veya sap çapının yaklaşık yarısını geçmemeye dikkat edin. Ardından, çözeltiyi ağaç gövdesine enjekte edin ve dsRNA çözeltisinin emilmesine izin vermek için enjektörü altı ila 10 saat boyunca gövdede bırakın.

Böceklerin, tedaviden 3, 10 ve 30 gün sonra işlenmiş ağaçlardan elde edilen kesimlerle beslenmesine izin verin. 30 gram kil emiciyi 50 mililitrelik konik bir tüpe 35 mililitre işaretine kadar dökün. DNA'larda seyreltilmiş 20 mililitre dsRNA çözeltisini, RNA'sız suyu tüm emici maddeyi ıslatmak için tüpe dökün.

Konik tüpü kapatın, havayı çıkarmaya yardımcı olmak için tüpü eğin ve tüpü dik olarak yerleştirin ve kil parçacıkları çözeltiyi emerken bir ila iki dakika bekletin. Bir galonluk bir tencereyi doldurmak için toprak karışımına yeterince dsRNA ile ıslatılmış kil ekleyin. DsRNA ile ıslatılmış kili toprağa iyice karıştırmak için toprağı elle karıştırın ve çevirin.

dsRNA tedavisi için seçilen fideleri yeniden saksılamak için toprağı kullanın. Toprağı 30 dakika ila bir saat sonra dsRNA olmadan 200 mililitre sade su ile sulayın. Ardından 100 mililitre sade su ile takip edin.

24 saat sonra bitkiyi normal bir sulama programına alın. Yeni bitki büyümesinin en apikal yapraklarını toplayarak, dsRNA için tedaviden sonra, her ay işlenmiş saksı bitkilerinin dört ila altı yaprağını kil emiciler ve dsRNA ile test edin. Kahverengi marmorated kokuşmuş böceğe veya BMSB mRNA'ya özgü in vitro sentezlenmiş dsRNA'ya daldırılmış yeşil fasulye segmentlerinin QPCR'si, JHAMT ve Vg hedeflerinin ekspresyonu in vivo olarak RNAi'nin başarılı bir şekilde indüksiyonunu gösterdi.

Bu dağıtım yöntemi, başka bir hemipteran zararlısı olan alacalı böcek üzerinde de etkilidir. Yeşil renkli dışkıları ile belirtildiği gibi. Bu görsel gösterileri izledikten sonra, RNAi böceklerini in vivo olarak indüklemek için oral yutma yoluyla böceklere çift sarmallı RNA'nın nasıl verileceğini iyi anlamış olmalısınız.

RNAi nükleotid teknolojisinde kaydedilen ilerlemeler, araştırmacıların çok çeşitli canlı organizmalarda RNA, gen ekspresyonu ve protein seviyelerini modüle etme yeteneklerini genişletmeye devam ediyor. Bu bitkilerden böceklere ve en zor mikroorganizmalara kadar gider. Bu nedenle, çift sarmallı RNA'nın üretim maliyeti düşmeye devam ederken ve dağıtım ve stabilite yöntemleri gelişmeye devam ederken, RNAi teknolojilerinin geleceği ortaya çıkan, karmaşık sorunları çözmek için kullanılmaya devam edecektir.