Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Bu hücre izolasyon protokolünün genel amacı, hem tümörden hem de karşılık gelen normal kolondan kolorektal karsinomdan muzdarip hastalardan saf ve canlı endotel hücreleri elde etmektir. Bu yöntem, kan damarı sisteminin kolorektal tümör oluşumu üzerindeki etkisini tahmin etmek ve analiz etmek gibi tümör biyolojisi ve anjiyogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kolorektal karsinomlu hastalardan saf ve canlı insan endotel hücrelerinin elde edilmesinde nispeten yüksek bir başarı oranına sahip olabilmesidir.

Kolorektal karsinom hastalarından doku örneği almak için, yaklaşık bir gram ağırlığında doku parçaları elde etmek için yeni bir neşter kullanın. Daha sonra, taze doku parçalarını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde antibiyotikli 40 mililitre buz gibi HBSS tamponuna aktarmak için steril forseps kullanın. Daha sonra, karsinomu ve normal dokuyu sırayla bir santrifüj tüpünden diğerine aktarmak için ayrı steril forseps kullanın ve 40 mililitre buz gibi HBSS tamponunda dört kez antibiyotiklerle yıkayın.

Tüm yağı, tümörlü olmayan dokuyu veya potansiyel olarak nekrotik doku parçalarını çıkarmak için steril forseps kullanın ve doku parçalarını steril bir hücre kültürü Petri kabına aktarın. Ardından, doku parçalarını nemli bırakmak için üç ila beş mililitre antibiyotik takviyeli HBSS tamponu ekleyin. Ardından, doku parçalarını kesmek için yeni bir neşter kullanın.

Ardından, kalan dokuyu küçük parçalara ayırmak için kavisli bıçaklı bir neşter kullanın. Kıyılmış doku parçalarını önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş doku ayrışma tüpüne aktarın. Kıyılmış doku parçalarını, üreticinin talimatlarını izleyerek insan dokusu için bir tümör ayrışma kiti ile birlikte bir doku ayrıştırıcı kullanarak ayırın.

İlk kritik adım, doğru boyut ve doku tipine sahip doku parçaları elde etmek için ameliyat örneğini doğru bir şekilde işlemek ve mikrodiseksiyon yapmaktır. Doku parçalarını ayırdıktan sonra, oda sıcaklığında 300 kez yerçekiminde bir dakika santrifüj edin. Ardından, MACS tüpüne 10 mililitre önceden ısıtılmış DMEM Low medium eklemek için serolojik bir pipet kullanın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu tüpten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilmiş 100 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir hücre süzgecine dökün. Ek hücreleri tüpten santrifüj tüpündeki süzgeçten geçirmek için MACS tüpüne 10 mililitre DMEM Low medium pipetleyin. Tüm hücre süspansiyonu filtrelendikten sonra, hücre süzgecini ilave 10 mililitre DMEM Low medium ile yıkayın.

Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında yerçekiminin 300 katı sıcaklıkta yedi dakika santrifüjleyin. Ardından, santrifüjleme bittiğinde süpernatanı atın. Daha sonra, hücre peletini aynı 50 mililitrelik santrifüj tüpünde beş mililitre antibiyotik takviyeli, önceden ısıtılmış EBM-2-MV ortamında çözün.

Kaplama çözeltisini kültür şişesinden çıkarın ve hücre süspansiyonunu doğrudan 37 santigrat derece ve% 5 karbon dioksitte tutulan bir T-25 kültür şişesine aktarın. Birleşme yaklaşık% 80 ila 90'a ulaştığında, şişedeki hücreleri ayırmak için bir mililitre Accutase ekleyin. Ardından, hücreleri Accutase ile 10 dakika bekletin.

Daha sonra, hücrelere 37 derecede tutulan dört mililitre EBM-2-MV ortamı ekleyin. Ardından, hücreleri saymak için 10 ila 25 mikrometre aralığına sahip otomatik bir hücre sayma cihazı kullanın. İkinci en kritik adım, hücrelerin bölünmesi gereken adımların tümüdür.

Doğru zaman noktasının tahmini deneyim gerektirir. Bölünme çok erken olursa, hücreler ölür. Bölünme çok geç olursa, endotel hücreleri yaşlanmaya ulaşır veya fibroblast aşırı büyümesi bir sorun olur.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 250 kez yerçekiminde dört dakika santrifüjleyin ve çalışmanın sonunda süpernatanı dışarı atın. Daha sonra, hücre peletini önceden ısıtılmış FACS tamponunda çözün. Ardından, hücrelere FACS boyama antikorlarını ekleyin.

Karıştırın ve ardından oda sıcaklığında toplam 15 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon süresinin yarısından sonra, tüpü bir kez hafifçe vurun. Etiketli hücre süspansiyonuna iki mililitre FACS tamponu eklemek için serolojik bir pipet kullanın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 250 kez yerçekiminde dört dakika santrifüjleyin ve santrifüjleme bittikten sonra süpernatanı boşaltın. Daha sonra, hücre peletini çözmek için iki mililitre FACS tamponu ekleyin ve hücresel süspansiyonu oda sıcaklığında 250 kez yerçekiminde dört dakika santrifüjleyin. Ardından, peleti 500 mikrolitre antibiyotik takviyeli EBM-2-MV ortamında yeniden süspanse edin.

Ardından, hücreleri FACS sıralama aracına aktarın. Üçlü pozitif hücreleri tanımlayın ve taze, önceden ısıtılmış EBM-2-MV ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu kültür kabına tohumlanmalarına izin verin. Hücreleri sonraki 48 saat boyunca kültürleyin ve ardından ortamı yenileyin.

Beş ila 10 gün içinde birleşme %90 ila 100'e ulaşana kadar ortamı iki günde bir değiştirmeye devam edin. Ardından, hücre popülasyonunu istenen kültür kabına göre genişletin. Ardından, birleşme noktasına ulaşıldığında hasat edin ve karakterizasyona doğru ilerleyin.

İlk olarak, elde edilen tümör örneği ayrıştırılır ve bir hücre kültürü kabına tohumlanır. Yapışmayan hücreler yıkanır ve yapışık hücreler, FACS sıralamasından önce% 80 ila 90 birleşme noktasına kadar kültürlenir. Daha sonra, immün olarak işaretlenmiş canlı tümör ve normal endotel hücrelerinin popülasyonunu tanımlamak için FACS analizi yapılır.

Bunu yapmak için, normal ve tümör endotel hücrelerinin florokrom bağlı antikora özgü üçlü etiketlemesi FACS aracılığıyla sıralanmak üzere yapılır. Sıralanan tüm hücre popülasyonunun ortalama %3.6 ve %5.6'sı sırasıyla tümör ve normal endotel hücreleridir. Daha sonra, endotel hücre belirteçlerinin ekspresyonunu tanımlamak için, elde edilen normal ve tümör endotel hücreleri immünositokimyaya tabi tutulur.

Buradaki görüntüler CD31 pozitif normal ve tümör endotel hücrelerini göstermektedir. Daha sonra, RNA, endotel hücrelerinin CD31 pozitif popülasyonundan izole edilir ve diğer endotel hücresine özgü belirteçleri tanımlamak için RT-qPCR'ye tabi tutulur. Grafikten, CD105, VE-cadherin ve von Willebrand faktörü gibi endotel hücre belirteçlerinin ekspresyonu da tespit edilir, ancak potansiyel olarak kontamine hücre popülasyonlarından gelen belirteçlerin ekspresyonu eksiktir, bu da izole edilmiş endotel hücre kültürlerinin saflığını gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık üç hafta içinde yapılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, hücrelerin ne zaman ve hangi oranlarda bölünebileceğini veya FACS sıralama analizi için daha fazla işlenebileceğini tahmin etmek için birincil endotel hücre kültürleri ile deneyim gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir. Bu tekniğin etkileri kolorektal karsinomun tedavisine kadar uzanır, çünkü hücre kültürleri kolorektal karsinomda tümörijenez tedavi yanıtı veya direnç mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, literatürde insan katı tümörlerinden gerçekten saf ve canlı endotel hücrelerinin kurulmasıyla ilgili sorunlara işaret eden çok sayıda rapor okuduğumuzda aklımıza geldi. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü FACS sıralama analizi veya endotel hücrelerinin daha fazla bölünmesi için doku mikrodiseksiyonu veya işleme adımları, doğru zaman noktasını tahmin etmek için deneyim gerektirir. Bu işlem denenirken öncelikle cerrahi, patoloji ve tümör kayıtçılığı ile fonksiyonel bir işbirliği ağı kurmak önemlidir.

Ayrıca, bu hücreler kırılgan olduğundan, birincil endotel hücre kültürleriyle çalışmak için egzersiz konusunda eğitilmelisiniz. Bu videoyu izledikten sonra, endotel hücrelerinin insan kolorektal karsinomundan ve karşılık gelen normal kolondan nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.