Name: Adjuvanın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, aşı geliştirmede adjuvanların sitotoksik T lenfosit üretme kapasitesini hızlıca değerlendirmek için CFSE boyalı OT-I T hücre proliferasyonunu izleme yöntemini. Bu teknik dört günde yerel ve sistemik yanıtları belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz bizim teknik görevlileri için borçlu bulunmaktadır: U. Bröder ve H. Shkarlet, deneysel işlemler sırasında bize yardım etti. Bu eser kısmen EU hibe (sözleşme UniVax, Sözleşme No 601738 ve TRANSVAC2, No. 730964) ve bir Helmholtz Derneği hibe (HAI-IDR) tarafından finanse edildi. Finansman kaynakları araştırma etkilemek değil tasarım, makale veya yayın için göndermek için karar nesil.

Bu çalışmada kullanılan tüm fareler C57BL/6 kökenli idi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik koşullar altında tutuldu. Tüm deneyler Alman hayvanları koruma kanunu (TierSchG BGBl. normatif göre gerçekleştirilen BEN S 1105; 25.05.1998) ve izni numarası altında 33.4-42502-04-13/1281 ve 162280 hayvan deneyleri etik ve devlet ofis (tüketicinin korunması, alt Saksonya eyalet Office ve gıda güvenliği), alt Saksonya Komitesi tarafından kabul edildi.
1. CFSE OT boyama-ı T hücreleri ve evlat edinen Transfer
Not: OT-ben fareler T hücre reseptör (TCR) sabit α ve β zincirleri birlikte OVA, IMMUNO-baskın peptid tanımak express transgenically oluşturulan hayvanlar vardır SIINFEKL10,11. Sonuç olarak, bu fareler SIINFEKL özgü CD8 oldukça yüksek bir dizi var+ T hücreleri normal ya da OVA aşı fareler (≤ % 1)13ile karşılaştırıldığında (%97)12 .
<ol><li>İzlenebilir CD8 yalıtım+ T hücreleri OT-ben fareler T lenfosit özgü Thy1bir (Thy1.1) gen ifade:<ol>
<li>6-9 haftalık OT ötenazi-ben fare CO2 Solunduğunda servikal çıkığı14tarafından takip. Cerrahi makas, cerrahi pense ve forseps yardımıyla vücut cilt ayırma ile deri kesim tarafından dalak ve büyük lenf düğümleri (sadece kasık, aksiler ve servikal çiftleri) teşrih ve yer onları Petri yemekler (60 x 15 mm) içeren her bir 100 µm gözenek kafes Kupası doku bileme ve hücre serbest bırakılması için.</li>
		<li>Buzda muhafaza tam RPMI Orta (RPMI 1640, % 10 v/v FCS, 100 U/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin) 3-5 ml Petri yemekler (her bir kafes Kupası) korumak.</li>
		<li>Organları bir şırınga dalgıç veya benzer bir steril aleti yardımıyla püre (önceki kesme gerekli değildir) ve 15 mL santrifüj tüpleri elde edilen tek hücre süspansiyon toplamak.</li>
		<li>Hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. 10 mL soğuk PBS hücrelerde Santrifüjü tarafından yıkama ve dalak üzerinden eritrositler pelet 1 mL/dalak amonyum klorür arabelleği (ACK arabellek, piyasada bulunan) yeniden askıya tarafından parçalayıcı. Buz üzerinde 1,5 dk için hücreleri kuluçkaya ve daha sonra (daha önce yapılan gibi) Santrifüjü tarafından 10 mL soğuk PBS hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>Pelet PBS (pH 7.2) içeren % 5 fetal Sığır serum Manyetik izolasyon için 1 mL aynı tüpte yeniden askıya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manyetik izolasyon gerçekleştirmek için CD8 negatif seçime devam etmek+ T hücreleri üretici yönergelerine uygun bir manyetik izolasyon kit kullanarak veya iletişim kuralları15yayınlandı.</li>
	<li>CFSE boyama gerçekleştirmek için önce CD8 saymak+ T hücreleri elde OT-ben fare bir otomatik hücre sayaç (parçacık counter) kullanarak. 1-5 x 107 hücre/mL 5 mikron PBS CFSE 15 ml şahin tüp ışıkta korunuyorsunuz 37 ° C'de 7 dakika ile 1-5 mL hacminde leke.</li>
	<li>Hücrelere fetal Sığır serum aynı cilt (1:1) ekleyerek CFSE boyama gidermek ve onları ışıktan korunan 37 ° C'de ek 7 min için kuluçkaya. PBS 10 mL hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 3-5 x 106 hücreler/fare 100 µL intravenöz enjekte için 3-5 x 107 hücre/mL PBS için cep numarasını ayarla (IV) kuyruk damar yolu ile.</li>
	<li>Kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmek için uygun restrainers farelerde hareketsiz. Sıcak arka alan ve kuyruk farelerin 20-25 cm uzakta fare kuyruğu ven vazodilatasyon izin vermek 1-3 dakika arasında bir kırmızı ışık lamba kullanarak enjekte edilir. Not: Bu kolaylığı ven algılama ve hücre süspansiyon yönetimi için yardımcı olur.</li>
	<li>(Eliyle fareler ve lamba arasında yer) sağlamak değil de fareler için sıcak ve kuyruk damarları açıkça izlenebiliyor, enjeksiyon için devam olduğunu. Hücreleri bir 1 mL şırınga ile 25'lik iğne16kullanarak yan veya dorsal kuyruk damar içine enjekte.</li>
</ol>2. aşılama (+/-adjuvan OVA Endo-ücretsiz)
<ol><li>OT ile nakledilen fareler koyun-hücreleri (adım 1.7, Şekil 1) bir anestezi odasında ve bir anestezi makinesi14tarafından isoflurane oksijen yönetmek.</li>
	<li>Ne zaman fare anestezi altında tamamen uyuyor, odasından çıkar ve temiz enjeksiyon gerçekleştirmek için bir elektrikli saç kesme makinesi kullanarak gluteus superficialis (yanal alt sırt) alan üzerinde fare kürk tıraş uygulama alanını iyi bir görünüm ile.</li>
	<li>Aşının, SC 25'lik iğne kullanarak traş alanında 50 µL enjekte.</li>
</ol>3. yalıtım lenfositleri ve Akış Sitometresi Analizi için boyama
<ol><li>Yalıtım lenfositleri ve splenocytes<ol>
<li>Aşı fareler tarafından servikal yerinden çıkması takip CO2 Solunduğunda ötenazi.</li>
		<li>Boşaltma ve uzak lenf düğümleri ve dalak ayıklamak ve ayrı Petri yemeklerinde 100 µm gözenek örgü bardak doku bileme ve hücre serbest bırakılması için içeren koyun. 1.1.2 1.1.3 aracılığıyla adımları.</li>
		<li>Süpernatant Santrifüjü sonra dikkatle boşaltmak ve hücre granül (yaklaşık 100 µL) kalan PBS aynı birimdeki yeniden askıya alma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış Sitometresi Analizi için boyama<ol>
<li>Tablo 1' de tasvir konsantrasyonlarda boyama antikorlar içeren bir ana karışımı bir 15 mL santrifüj tüpü hazırlayın, böylece 2 x verimli boyama mix yoğunlaşmıştır. Yeterli hacim örnek başına 100 µL için ana karışımı hazırlayın. Mix hücreleri ve ana mix 1:1 ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Son boyama hacim örnek başına 200 µL (hücre Pelet + 100 µL antikor ana Mix 100 µL) olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri tarafından iki kez aralıklarla iki kez PBS, 10 mL ekleme 1.1.3 içinde açıklandığı gibi yıkayın.</li>
		<li>0.5-1 lekeli hücreleri yeniden askıya PBS mL toplama ve transferi akış sitometresi tüpler süspansiyon. Her zaman buz üzerinde örnekleri tutmak ve ışıktan korunan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. akış sitometresi
<ol><li>Her zaman 70-100 µm filtreleri kullanarak hücre örnekleri ön filtre.</li>
	<li>Tek boyama tazminat denetimleri tablo 1 (boncuk veya hücreleri) ayrıntılı fluorophores için hazır olun. Not: Tazminat sitometresi veya analiz yazılımı17,18,19 yılında gerçekleştirilen ve tüm örnekler için uygulanan gerekir.</li>
	<li>Şekil 2' de tasvir gating strateji izleyin. Kısaca, kapı nüfus ileri dağılım yüksekliği ileri dağılım alanı (Şekil 2A) ve tekrar yan yan dağılım alanı (SSA, Şekil 2B) birini dışlamak için geniş dağılım vs.</li>
	<li>Kapı BV 650 (auto-floresan) vs FITC (CFSE) doğru CFSE ayırımcılık için komplo tarafından Şekil 2B popülasyondan yüksek otomatik floresan hücreleri hücrelerden lekeli. Boncuk veya BV 650 için tazminat denetimlere Birleşik antikor ile lekeli hücreler içerir. Bu arsa (Şekil 2C) BV 650 vs FITC OT kapı için kullanılır-ben CFSE hücreleri lekeli.</li>
	<li>Şekil 2 c nüfus için Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) APC (CD8) vs vs alıcı fareler donörden türetilmiş hücre ayırmak için kapı. Not: Hücreleri OT türetilmiş-ben donör fareler WT (C57BL/6, alıcı) hücrelerin farelerde elde edilen Thy1.2+ (CD90.2) (Şekil 2B) ise Thy1.1+ (CD90.1), değildir. Bazı laboratuvarlar OT var-ben bir Thy1.2 arka plan ve WT (C57BL/6) bir Thy1.1 içinde fareler. Bu durumda Thy1.2 karşı antikor OT için kullanmak zorunda-geçişi hücre.</li>
	<li>CD8 yeniden kapı+ hücreleri Thy1.1+ popülasyondan APC (CD8) BV 450 (CD4) oluşan bir kapıya komplo tarafından (Şekil 2E).</li>
	<li>CD8 çubuk grafik görünümünü kullanarak Şekil 2E içinde geçişli nüfus görüntülemek+ CFSE (FITC, 530/15 Kanal - mavi lazer-), gösterilen hücre kapısı proliferated nüfus yoğunluklarını 10 dahil ederek2 düzeyine kadar nerede bölünmemiş denetim nüfus (yoğunluklarda ~ 105, CFSE boyama ve akış sitometresi voltaj ayarı etkinliğini bağlı olarak) vardır (Şekil 2F).</li>
	<li>Ölü hücreleri paralel yayılması değerlendirme olarak değerlendirmek amacıyla bir ek Kapısı (Şekil 2 değil görüntülenen) çizim FITC vs L/D işaretleyici (450/20 kanal, UV Lazer) olun.</li>
	<li>Tazminat denetimleri için en az 5000 olaylar ve 10.000 olayları (gate E, Şekil 2) bir akış sitometresi adlı örneklerinden elde etmek. Düşük veya orta akış sitometresi çalıştırmak (20.000 olaylar/s akış hızı fazla olamaz).</li>
</ol>

<ol><li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li>
<li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD8%2B+T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8%28%2B%29-T-cell+responses+to+DNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li>
<li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+CD8%28%2B%29+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li>
<li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective%2C+immunopathogenic%2C+and+immunoregulatory+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li>
<li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines%3B+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li>
<li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+vaccine-enhanced+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li>
<li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFN+and+not+TNF%2C+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li>
<li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-%283%27%2C5%27%29-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate%3A+strong+Th1%2FTh2%2FTh17+promoting+mucosal+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I%3A+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li>
<li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive%2C+acutely+activated%2C+and+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+of+CD8%2B+T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li>
<li>Otto, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtto%2C+K+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li>
<li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).</li>
<li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li>
<li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li>
<li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li>
<li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+immunology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+CD8%28%2B%29+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion%3A+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li>
<li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li>
<li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li>
<li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8%2B+T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li>
<li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li>
<li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity%3A+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Modern aşılar ideal Avusturyalıanti arıtılmış antijen ve adjuvan lipozomlar, virüs gibi parçacıklar, nano tanecikleri veya canlı vektörel çizimler gibi bir iletim sistemi mümkün ilavesi ile vardır. Bir aşı tasarlarken önemli bir yönü klinik gereksinimlerinize uygun bir doğru adjuvan seçmektir. Kapsamı parçası humoral ve hücresel immün yanıt (veya her ikisi), sistemik bir immün yanıt (veya her ikisi) vs yerel seçim ve aşı hedef popülasyon oluşturmak için gereken bellek tür lehine içerebilir. Bir önemli yönü adjuvan değerl...

Aşılar inducing sitotoksik T lenfositler (CTL) belirli türde kanser1mücadele için geliştirilmiş anahtar tedavi müdahaleler vardır. CTL de intrasellüler patojenlerin2karşı koruyucu aşıları için önemli. Ayrıca, CTL bir kaç bağışıklık savunma mekanizmaları da erken hayat enfeksiyonlar5mücadele için CTL üzerinde bağlıdır kime risk nüfus yenidoğan bebeklerin3,4 gibi işlevsel olarak etkin bulunmaktadır. Bu bağlamda, CTL yanıt (şap) temin etmez bir adjuvan ile geliştirilen aşılar karşı solunum sinsityal virüs (RSV) aşı bebeklerde6adet enfeksiyondan üzerine ciddi komplikasyonlara yol tam bir başarısızlık sonuçlandı. Aşı bu olumsuz etkileri bir CD8 tarafından ters+ T hücre yanıt7. Biz daha önce interferon genler (STING) agonistler bazı uyarıcı tarafından elde edildi (tip ı interferonlar) ana sitokinler bu adjuvan8tarafından kısmen yayılması ölçerek oluşturulan CTL yanıt için gerekli olduğunu göstermiştir OT-ı T hücreleri sonra aşı ve yetenekleri inducing CTL ölçüsü gözlenen bu sonuçları kullanarak aşılama programları9erişmek. OT yayılması ölçümü-ben CD8+ T hücreleri bir vahşi türü (WT) C57BL/6 alıcı fare carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) boya tarafından seyreltme bir aşı adjuvan yeteneği oluşturmak için sağlam bir tahmin olduğunu. SIINFEKL, (ovalbumin, OVA IMMUNO-baskın peptid), çapraz-astar. Bu tekniğin varyasyonları yaygın OT yayılması değerlendirilmesi için kullanılan-ben CD8+ ve OT-II CD4+ T hücreleri. Örneğin, seçili sitokinler (KO fareler) ya da antijen hatırlama WT hayvanlarda sonra aşı etkinliği ölçmek için yokluğunda kullanılmıştır. Hangi OT CFSE lekeli pasif transfer sonra kısa protokol (4 gün deneme) geliştirmiştir-ben CD8+ T hücreleri, 50 bir doz oluşan bir cilt altı (SC) bağışıklama endotoksin-Alerjik OVA test adjuvan ile desteklenmiş µg yönetilen (Şekil 1). 48 h sonrasi hipererjik sonuçları takip adjuvan kapasitesi CTL yanıt-e doğru oluşturmak için güvenilir bir kanıtı sağlar. Bu strateji, dalak (veya uzak lenf düğümleri) CTL etkinliğini ölçerek ölçüde yanıt yanı sıra bağışıklama sonra drenaj lenf nodu yerel Bağışıklık yanıtında potens değerlendirmek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Hücre Analiz Cihazı</td><td>BD</td><td>Özel Sipariş Akış</td><td>Sitometresi</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Moleküler Problar</td><td>C34554</td><td>Proliferasyon Boyası</td></tr><tr><td>MojoSort Fare CD8 T Hücre İzolasyon Kiti</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Manyetik İzolasyon Boncukları ve antikorlar Dokunulmamış CD8 T hücrelerinin negatif seçimi için.</td></tr><tr><td>CANLI / ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke Kiti, UV uyarma</td><td>için Moleküler Problar</td><td>L23105</td><td>Ölü Hücre İşaretleyici</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoklonal Antikor (HIS51), PE-Siyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>APC anti-fare CD8a Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>BV421 Sıçan Anti-Fare CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>Z2 coulter Partikül sayımı ve Boyut Analiz Cihazı</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Hücre sayacı. Z2 Otomatik partikül / hücre sayacı</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td> <td>Hyglos (Almanya)</td> <td>321000</td><td>Ovalbumin endotoksin içermez test edilmiştir.</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 100 & mikro; m naylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Hücre süzgeci (100 & mikro; m gözenekli örgü bardaklar).</td></tr><tr><td>Numune Şişeleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Z2 otomatik sayıcı</td></tr><tr><td>C57BL / 6 fareler için numune şişeleri (CD90.2)</td> <td>Harlan (Rossdorf, Almanya)</td><td></td> <td>Şirket artık Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL / 6 arka plan, CD90.1)</td> <td>Harlan (Rossdorf, Almanya)</td><td></td> <td>Hayvan tesisimizde akraba evliliği. Satın alınan şirket şimdi Envigo</td></tr><tr><td>FACS tüpleri</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tüpler</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Konik Santrifüj Tüpleri</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Fosfat Tamponlu Salin), pH 7.2</td></tr><tr><td>Kırmızı lamba (ısıtma lambası)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Almanya)</td><td>405096</td><td>Isıtma kızılötesi lamba (100 wats)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (ABD)</td><td>5260.04-05.</td><td>İzofluran anestezik (250 mL şişe).</td></tr><tr><td>< Güçlü > Masa Üstü Anestezi Makinesi / CO2 Emici ile Mobil Anestezi Makinesi< / güçlü ></td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>İzofluran anestezi makinesi.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>Gibco (ThermoFischer tarafından dağıtılır)</td><td>11-875-093</td><td>Glutamin içeren baz ortam (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiyotik çözeltisi (Gibco)</td><td>Gibco (ThermoFischer tarafından dağıtılır)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td></tr><tr><td>Fetal Bobin Serumu (Gibco)</td><td>Gibco (ThermoFischer tarafından dağıtılır)</td><td>10082147</td><td>Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı ile inaktive edilmiş, ABD menşeli</td></tr><tr><td>ACK Lizing Tamponu (100 ml)</td> <td>Gibco (ThermoFischer tarafından dağıtılır)</td> <td>A1049201</td><td>Amonyum Klorür Potasyum (ACK) Tam Kan Lizis Tamponu, dalak süspansiyonlarında eritrosit lizisi için uygundur, ayrıca</td></tr><tr><td>Plastik Petri</td><td>Kapları Nunc (ThermoFischer tarafından dağıtılır)</td> <td>150340</td><td>60 x 15mm Plastik Petri Kabı, İşlem Görmemiş</td></tr><tr><td>Hücre Topak Filtresi</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&reg; 50 ve mu; m, steril</td></tr></tbody></table>

adjuvan'ın sitotoksik t lenfositler nesil yeteneklerini hızlı vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Modern alt birim aşılar değerlendirilmesi antikorları nötralize üretimi önemli ancak adjuvan seçim için yeterli olduğunu ortaya koymaktadır. Bu nedenle, adjuvan sitotoksik T lenfositler (CTL) yanıt teşvik edebiliyoruz humoral ve hücresel immün uyarıcı yetenekleri ile acilen ihtiyaç vardır. Böylece, çapraz-astar ikna etmek ve daha sonra CTL üretimi geliştirmek adjuvan adayları sadık izleme aşı geliştirmede önemli bir adımı temsil eder. Burada biz SIINFEKL özgü kullanan bir yöntem için bir uygulama mevcut (OT-ben) T hücreleri farklı adjuvan adayların huzurunda modeli antijen ovalbumin (OVA) vivo içinde çapraz sunumunu izlemek için. Bu yöntem en iyi çapraz-astar yetenekleri ile adjuvan seçmek için hızlı bir test temsil eder. CD8 yayılması+ T hücreleri çapraz-astar en değerli belirtisi olduğunu ve aynı zamanda adjuvan kaynaklı çapraz-sunum ilişkili kabul edilir. Bu özellik, lenf düğümleri ve dalak gibi farklı bağışıklık organlarında değerlendirilebilir. CTL oluşturma kapsamını da izlenebilir, böylece bir yerel doğa üzerinde anlayışlar veren (lenf nodu esas olarak boşaltılmasına) ya da sistemik yanıtın (uzak lenf düğümleri ve/veya dalak). Bu tekniği daha da belirli çapraz-sunum yolları inhibe olabilir ve ayrıca geleneksel ve genetiği değiştirilmiş fare farklı suşları kullanılmak üzere imkanı sunuyor ilacını test için birden fazla değişiklik sağlar. Özetle, burada mevcut uygulama geliştirmek veya aşı araştırma ve geliştirme için kimyasal adjuvan değiştirme aşı laboratuarlar sanayi veya Akademi için faydalı olacaktır.

Adjuvan (ADJ1 ve ADJ2) farklı bir birleşimini kullanarak uygulamaları test etmek için biz CTL üretimi kapasitesi adoptively transfer edilen OT yayılması ölçerek değerlendirildi var-ben CD8+ T hücreleri tarafından akış sitometresi (Şekil 2). Bunun için biz daha önce drenaj lenf düğümleri ve dalak (Tablo 1) izole hücrelerden lekeli. CD8 yayılması ölçme tarafından+ T hücreler lenf düğümleri ve dalak, biz daha yüksek CTL üre...

Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Bu deneyin genel amacı, bağışıklanmış alıcı hayvanların drenaj lenf düğümlerinde ve dalaklarında evlat edinilmiş olarak transfer edilen CFSE ile boyanmış OT1 CD8 pozitif T hücresi proliferasyonunu izleyerek ilgili adjuvanların sitotoksik T lenfositleri üretme yeteneğini belirlemektir. Bu yöntem, bir sitotoksisite hücre yanıtı oluşturmak için bir adjuvanın gücü gibi aşılama alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece bir adjuvanın CTL kapasitesini değil, aynı zamanda bunun lokal mi yoksa sistemik mi olduğunu belirleyebilmeniz ve bunu sadece dört gün içinde yapabilmenizdir.Prosedürü göstermek laboratuvarımızda bir teknisyen olan Elena Reinhard olacak. OT1 farelerinden uyluk 1.1 pozitif CD8 pozitif T hücrelerini izole etmek için, önce dalak ve kasık, aksiller ve servikal lenf düğümlerini standart protokollere göre hasat edin ve tüm organları 100 mikrometrelik bir gözenek süzgecine yerleştirin 60 milimetrelik bir Petri kabında üç ila beş mililitre tam ortam içerir. Büyük OT1 dalaklarında veya lenf düğümlerinde hasat yapmayın, çünkü bu lenf dokularından gelen T hücreleri lösemik olabilir ve stimülasyon olmadan bile çoğalır, bu da test sonu

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Video, in vivo adjuvan kaynaklı sitotoksik T lenfosit veya CTL üretimini izlemek için immünolojik bir yöntemi göstermektedir. Bir fareye genetik olarak tasarlanmış, proliferatif boya lekeli donör CD8 + T lenfositleri önceden enjekte edilir. Ovalbüminin adjuvanlarla deri altı enjeksiyonu, hasat sonrası immün boyama ve akış sitometrisi yoluyla tanımlanan sitotoksik CD8 + T lenfositleri oluşturur.

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak&gt; 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Burada, bir gösteri emme blister kutanöz geri çekme modeli sağlamak. Model insan vivo içinde edinilmiş bağışıklık yanıtı, örneğin aşı geliştirme bağlamında incelemek basit bir erişim sağlar.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Lenfoid dendritik hücre aktivasyonu sınamak için lenfatik doku sonraki çıkarma deneysel yordamları bir immunostimulating nanomaterial tedaviden sonra açıklanmıştır.

Immunostimulatory Ajan değerlendirme: Lenfoid doku çıkarma ve Enjeksiyon rota bağımlı dendritik hücre aktivasyonu

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Burada, nazal kendiliğinden monte edilmiş nanoemülsiyon tümör aşısının in vitro ve in vivo olarak hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Nazal Kendi Kendine Toplanan Nanoemülsiyon Tümör Aşısının İn Vitro ve İn Vivo Hazırlanması, Özellikleri, Toksisitesi ve Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Öğrenin, aşı geliştirmede adjuvanların sitotoksik T lenfosit üretme kapasitesini hızlıca değerlendirmek için CFSE boyalı OT-I T hücre proliferasyonunu izleme yöntemini. Bu teknik dört günde yerel ve sistemik yanıtları belirlemenizi sağlar.

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

Daha fazla video keşfet