Name: Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Keşfedin tek molekül dijital ELISA yöntemiyle insan IFN-α alt tiplerini ultra hassas şekilde tespit etmeyi. Bu yöntem otoimmün hastalıklarda interferon yanıtlarını anlamak ve biyobelirteç keşfi için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DD ve YJC kabul ANR desteğinden (proje IFNX, yok. CE17001002) ve ImmunoQure AG monoklonal antikorlar sağlamak için. Biz Brigitte balta-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki ve Pierre Quartier klinik örnekler sağlamak için teşekkür ederiz. YJC kabul eder Avrupa Araştırma Konseyi (GA 309449: YJC için arkadaş grubu) ve başvuru ANR-10-IAHU-01 taşıyan "yatırımlar gelecek için" program kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı (Fransa) tarafından yönetilen bir devlet sübvansiyon.

<ol><li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13465720">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li>
<li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pillars+Article%3A+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+London.+Ser.+B%2C+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li>
<li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li>
<li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li>
<li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha%2Fbeta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li>
<li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li>
<li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation%3A+The+type+I+interferonopathies%2C+a+conceptual+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+biological+assay+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li>
<li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li>
<li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li>
<li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis%3A+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li>
<li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+HeLa+Mx2+%2F+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+surface+expression+of+Fc%CE%B3+receptor+RI+%28+CD64+%29%2C+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li>
<li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858(2011).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+array+%28Simoa%29+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22R.+Soc.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li>
<li>Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. <a target="_blank" href="http://www.healthtech.com/uploadedFiles/Conferences/White_Papers/MXA/Scientific-Principles-of-Simo-Technology.pdf">Whitepaper 1.0</a>. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li>
<li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+%2F+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+%CE%B1+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li>
<li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236(2015).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification%3A+prospective+placebo-controlled+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li>
<li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+%28Simoa%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Neurofilament+Light%3A+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+%CE%B2+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer%27s+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers.+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li>
<li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296(2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li>
<li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).</li>
<li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li>
<li>Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).</li>
<li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li>
<li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+%28EBC%29+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108(2015).</li>
<li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li>
<li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Simoa+HD-1+Analyzer%3A+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li>
<li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully-automated%2C+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Proteome.+History%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, geliştirme ve son derece tekrarlanabilir, vericiyi molekülünü dizi dijital ELISA IFN-α proteinin insan örnekleri ( Tablo 1' de özetlenen adımları) doğrudan miktar için doğrulama nitelendirdi. Tahlil gelişiminde en önemli adımlardan biri antikor çifti16, kinetik ve anahtar başarılı bir tahlil için olmak epitope bağlama açısından özelliklere sahip seçimdir. Aynı epitope hedef veya bu steric engel neden eşleştirilmiş monoklonal antikorların kullanımı önlemek önemlidir. Poliklonal antikorlar gibi sınırlamalar üstesinden gelmek için algılama antikor kullanılabilir. Eğer herhangi bir belirli adımdan istenen hassasiyet elde değil, daha fazla en iyi duruma getirme olanakları dikkate alınmalıdır. Bu alternatif antikor çiftleri, protein türü gibi parametreleri değişiklikleri kullanımı içerebilir (örneğin BSA < kazein), pH (6.0-8,5), iyonik gücü, arabelleğe alma kapasitesi (örneğin NaCl ve fosfat konsantrasyonları), taşıyıcı boncuk/veya yüzey aktif maddeleri varlığı. Parametrelerin geniş con bir tek molekül dizi tahlil geliştirilirken optimize. Ancak, genel olarak, yüksek sinyal: arka plan oranları ve en az LODs vermek koşullar tercih olanlardır (bkz: resim 1, resim 2ve Şekil 3).
Özgüllük ile ilgili, IFN-α tahlil gösterdi herhangi bir diğer IFNs için çapraz hiçbir reaktivite test (β, γ, λ1, λ2, ω) (Şekil 4a) ve tüm 13 IFN-α alt türlerinden (Şekil 4b) algılama yeteneğine sahip. Ancak, tahlil IFN-α2 alt türü, (Şekil 4b ve ek tablo 4) için daha düşük bir ilgi gösterdi. IFN-α2 alt türlerinden farklı ticari elde gibi ilginçtir, IFN-α2 (a, b, c) farklı sınıfları için farklı hassasiyetleri de, farklı üretim prosedürleri veya farklı amino asit dizileri, nedeniyle olabilen gözlendi tedarikçiler. Bu tek istisna ile IFN-α türler çok benzer yanıt verdi. Testin özgüllüğü daha fazla anti-IFN-α (Şekil 6 ve ek tablo 6) sinyal kaldırıldı bir klon ile örneklerinin ön arıtma tarafından sunuldu.
Bu teknoloji ana avantajlarından biri herhangi bir analit ilgi hedeflenen16potansiyel olabilir olduğunu. Ayrıca, farklı biyolojik örnekler, serum, plazma, beyin omurilik sıvısı, hücresel lysates, kültür supernatants31 ve hatta nefes32gibi test edilebilir. Genellikle, bir 1:3 seyreltme plazma potansiyel tek molekül dizi analyzer tıkanma önlemek için yapılır. Ancak, faiz analit ilgili biyolojik örnek çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olabilir ve örnek daha yüksek konsantrasyonlarda (bağlı olarak tahlil duyarlılık) gerekli33olabilir. Orada iyi duyarlılık34koruyarak çoğullama için potansiyel, aynı deneyleri içinde 6 protein var henüz için geliştirilen35daha büyük ölçme deneyleri ve daha zor bir işlem olsa da.
Algılamak ve sitokinler ve diğer biyolojik ilgili proteinler gibi düşük konsantrasyonlarda ölçmek yeteneği uygulamaları33,36yepyeni bir dizi kadar açılır. İyi çok sayıda protein etkileri, hatta en iyi ELISAs37tespiti sınırın altına olan şu ana kadar çok düşük konsantrasyonlarda sarfetmek bilinmektedir. Diğer immunoassay teknolojileri geleneksel ELISA19avantajları sunarken, biz burada tek molekül dizi dijital ELISA düşük konsantrasyon sitokinler NEMS tespiti için tekrarlanabilir ve sağlam bir platform olduğunu ispat insan örnekleri. Bu nedenle, bu teknoloji biyomarker bulma ve hastalıkların geniş bir dizi gelişmiş hasta yönetimi için büyük bir potansiyel sunmaktadır.

Ben IFNs olan bir ailenin antiviral bağışıklık yanıtı düzenlediğini merkezi bir rol oynamak sitokinler türü. Onlar ilk Isaacs ve Lindenmann 60 yıl önce1,2 ve o şimdi polipeptitler türdeş olmayan bu ailenin 14 farklı alt sınıfları (13 IFN-α alt türlerini ve 1 IFN-β) oluşmaktadır bilinen keşfedildi. Ben IFNs viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olan, ama aynı zamanda insan hastalık durumlarında, otoimmün hastalıklar sistemik lupus eritematozus (SLE), juvenil Dermatomiyozit (JDM), dahil olmak üzere çeşitli patolojisi karıştığı türü ve türü Ben interferonopathies kurucu hangi yazıyla ben IFN kaynaklı sinyal patoloji3,4,5,6,7' sonuçları.
Eğitim tip ı IFN protein düzeyleri biyolojik örneklerde olmuştur zorlu beri onun ilk kimlik bir "madde engel"1,2. Şu anda, sandviç Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) IFN-α protein algılanması için en çok kullanılan yöntemdir. Belirli, basit ve hızlı olmasına rağmen ' tip ı sınırlı hassasiyet gibi IFN ELISAs mevcut önemli sınırlamalar. Buna ek olarak, tüm IFN-α türlerinden ölçüm kendi algılama kapasitesi ve duyarlılık ile birden fazla deneyleri kullanımını gerektirir. Farklı alt türlerinden IFN-α algılamak ticari ELISAs olmakla birlikte, onların hassasiyeti sınırlıdır (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL ve 12.5 pg/mL, sırasıyla) kez IFN-α protein biyolojik örnekleri algılamak yetersiz olduğu. Bu sınırlamayı aşmak için çeşitli biyolojik proxy deneyleri ölçmek için geliştirilmiştir tip ı IFN indüklenen gen ekspresyonu ya da fonksiyonel etkinlik8,9,10,11, ölçerek 12 , 13 , 14. yine de, bu deneyleri IFN-α protein doğrudan bir ölçüm sağlamak değil.
Bu çalışmada, tek molekül dizi dijital ELISA teknoloji tek IFN-α protein molekülleri tespiti için bir tahlil geliştirmek için kullanıldı. Dijital ELISA aynı temel kimya geleneksel ELISA olarak kullanır, ancak, reaksiyon 50.000 bireysel 46 femtoliter boy kuyu15,16oluşan diziler yer alır. Tek protein molekülleri antikor kaplı paramagnetic boncuk tarafından yakalanır ve bir enzim eşlenik, streptavidin-β-galaktozidaz (SBG) bağlama tarafından takip biotinylated algılama antikor taşır. Daha sonra boncuk fluorogenic enzim substratı resorufin-β-D-galactopyranoside (alp), içine tek molekül dizileri ile askıya alınır. Birimin azalan tarafından tepki 2 milyar kez17, floresan sinyal yerel yüksek yoğunlukta elde edilir ve tek molekül sayıları her molekül şimdi güvenilir olabilir bir sinyali üretir olarak mümkün hale18ölçülür. Esas olarak tek molekül dizileri tek immunocomplexes sayma ve enzimler boncuk (AEB) başına ortalama sayısını belirleme yeteneğine sahiptirler. Protein konsantrasyonu ve immunocomplexed-boncuk ve boncuk mevcut toplam sayısı arasındaki oran arasında doğrudan bir ilişki olduğu bir sinyal tespit microwells Sayma miktar/dijitalleştirme protein moleküllerinin izin verir femtoliter-büyüklük odası.
Yeung ve ark. dokuz farklı teknolojiler ve dört sitokin uzun tahlil duyarlılık, hassasiyet ve veri korelasyon arasında farklı platformlarda19karşılaştırma amacı ile kullanarak bir kapsamlı çapraz platform değerlendirme çalışması yapılır. Çalışmanın temel bulgular tek molekül diziler ve tek molekül immunoassay sayma sitokinler algılanması için en yüksek duyarlılık alt-pg/mL konsantrasyon aralığı içinde insan serumda sunulan biriydi. Crohn hastalığı20, IFN-α interferonopathy ve oto-immün hastalar 7, IL-6 ve TNF-α rolde çalışma için kullanılan tek molekül dizi dijital ELISA sitokin deneyleri ve farklı değiştirilme tarihi post-translationally C-X-C formları Motif kemokin 10 (CXCL10) Kronik hepatit ve sağlıklı bağış sitagliptin21,22alma. Diyabetik retinopati23olan hastalarda rhodopsin ölçümü diğer uygulamalar dahil; beyin patolojileri neurofilament serum/plazma ölçümleri aracılığıyla çalışma ışık24 ve amiloid-β 1-42 peptid25, multipl skleroz ve Alzheimer hastalığı, bağlamında anılan sıraya göre. Tek molekül dizi deneyleri için geliştirilmiş patojen algılama gibi HIV viral rezervuar26karakterizasyonu ve DNA27 ve mikro RNA'lar28algılanması için de kullanılabilir. Tek molekül dizi teknoloji önemli bir avantajı bu yüksek çok yönlülük, spesifik antikor çifti varsa bir tahlil karşı ilgi herhangi bir analit geliştirilebilir gibidir. Buna ek olarak, homebrew tahlil kitleri hangi protokolü değiştirilen form aşağıda ayrıntılı yeni deneyleri, gelişimi sağlayan ticari olarak kullanılabilir.
Burada, bir tek molekül dizi tahlil için geliştirme ve doğrulama adımları ayrıntılı bir açıklama bu sonuçları IFN-α protein algılama için geliştirilmiş hassasiyet gösterilir. Antikor molekülünü dizi deneyleri için son derece kesin, (varsa kabul türler özgüllük ile) ilişkili proteinler ile çapraz reaktivite kaçınmak gerekir. İdeal olarak, bir KD daha küçük 10-9 M antikorlar seçilmelidir; yüksek benzeşimi güçlü bağlama ile daha yüksek bir sinyal üretimini sağlar. Antikor-antijen bağlayıcı kinetik are da önemli ve hızlı Küzerinde ve yavaş Kkapalı antijen-antikor kompleksi derleme lehine. Bir sınırı 1-100 pg/mL, tespiti (LOD olarak) olan klasik ELISA içinde iyi bir performans sunuyor bir antikor çifti ile başlayan son derece hassas tek molekül dizi tahlil elde etme şansını artırır. Chang ve meslektaşları her adım, meydana gelen biyomoleküler etkileşimleri ayrıntılı kinetik çalışmalar denklemler analitik duyarlılık18tahmin etmek için bir dizi teklif uygulandı. Dijital ELISA görünür çok çeşitli antikor benzeşim içinde etkili olabilmesi için bu tek molekül diziyi gösterdiler (KD ~ 10−11 - 10−9 M), hem de o sinyal üretimi daha üzerinde-oranı üzerinde böyle antikorların bağlıdır.
Yüksek afinite yararlanmak için 1/otoimmün polyendocrinopathy kandidiyazis ektodermal distrofi (APS1/APECED)29biz izole Antikorlar otoimmün polyendocrinopathy sendromlu hastalarda yararlandı antikorlar yazın. Henüz anlaşılamamıştır nedeniyle, AIRE eksikliği bireylerin büyük çoğunluğu yüksek-hırs antikorlar karşı tüm IFN-α alt türlerinden29çekirdek kümesi geliştirmek ve biz tamamlayıcı bağlama benzeşim iki anti-IFN-α antikor klonları seçildi farklı IFN-α alt türleri için ŞA50 değerleri tarafından tahmini olarak. Bu benzersiz yüksek afinite antikor molekülünü dizi teknoloji ile kombinasyonu IFN-α doğrudan miktar attomolar (fg/mL) konsantrasyonlarda etkin. Böyle NEMS IFN-α protein algılama daha iyi doğa, yönetmelik ve IFN kaynaklı yanıt farklı hastalık ayarları olarak biyolojik etkisini anlamak için katkıda bulunacaktır.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-&alfa; antikor A (8H1 klonu)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Ticari olarak temin edilemez</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; antikor B (12H5 klonu)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Ticari olarak mevcut değil</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; antikor EBI-1 klonu</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; antikor BMS216BK klonu</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Bir ELISA kiti değil, toplu abs</td></tr><tr><td>IFN ve alfa; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>Tamam</td></tr><tr><td>IFN ve alfa; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; 2a</td><td>PeproTech</td><td>artık mevcut</td><td></td></tr><tr><td>değil IFN & alpha; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve alfa; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve lambda; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve lambda; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve omega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN ve gama;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alfa; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Azaltılmış Serum Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Çift Luciferase Raportör testi</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Yedek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Artık mevcut</td><td></td>değil</tr><tr><td>Amicon mikosantrifüj tüpleri - 0.5mL filtreler</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Konjugasyon Tamponu</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ayrı olarak sipariş edilemez</td></tr><tr><td>Kodlanmamış Paramanyetik</td><td>Boncuklar Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Yıkama Tamponu</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ayrı olarak sipariş edilemez</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Engelleme Tamponu</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ayrı olarak sipariş edilemez</td></tr><tr><td>Boncuk Seyreltici Tamponu</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Dedektörü ve Numune Seyreltici</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinilasyon Reaksiyon Tamponu</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ayrı olarak sipariş edilemez</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr> 1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri için <tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (Heraens Fresco 21 Santrifüj)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Standart laboratuvar vorteks karıştırıcısı (MS2 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleri (10, 20, 200 ve 1000 &mu; l)</td> <td>Termo Bilimsel İpuçları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 ve 1000 &mu; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri 1.7 mL mikrosantrifüj</td> tüplerini barındıran <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik ayırıcı (Life Technologies DynaMag-2)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini tezgah üstü santrifüj (Galaxy MinisStar)</td> <td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mikser / Çalkalayıcı (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tek molekül dizisi (Simoa) reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, Boncuk ve Dedektör Barkod Etiketleri</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Reaktif Şişeleri</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa örneği 96 kuyulu plakalar</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Diskler</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Simoa 2.0 iletken ipuçları</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Küvetleri</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG Reaktifi</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP Reaktifi</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Sistem Tamponu 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Sistem Tamponu 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Sızdırmazlık Yağı</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 Analizörü</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek molekül dizisi (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek molekül sayımı Erenna İmmünoassay Sistemleri</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı immunosorbent assay insan interferon-α için dizi

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Amacı bu iletişim kuralı, geliştirme ve doğrulama bir interferon (IFN) tarif etmektir-α tek molekül dizi dijital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) tahlil. Bu sistem insan IFN-α protein miktar IFN diğer türler için eşi görülmemiş hassasiyet ve yok olan sayesinde sağlar.
Protokolü'nün önemli bir ilk adım paramagnetic boncuk ve algılama antikor biotinylation yakalama antikor konjugasyon tarafından takip antikor çiftinin seçimdir. Optimum hassasiyet elde kadar bu adımı tahlil yapılandırma, dedektör antikor konsantrasyon ve arabellek oluşturma gibi farklı parametreler değiştirilebilir. Son olarak, özgüllük ve tekrarlanabilirlik yöntemin sonuçları güven sağlamak için değerlendirilir. Burada, geliştirdiğimiz bir IFN-α tek molekül dizi tahlil limiti 0.69 fg/mL biallelic mutasyonlar otoimmün polyendocrinopathy neden olan otoimmün regülatörü (AIRE) protein ile hastalardan izole yüksek afinite otoantikorlar kullanarak algılama sendromu tip 1/otoimmün polyendocrinopathy kandidiyazis ektodermal distrofi (APS1/APECED). Önemlisi, bu antikorlar tüm 13 IFN-α türlerinden algılama etkin.
Bu yeni yöntem algılama ve IFN-α protein miktar attomolar konsantrasyonlarda insan biyolojik örneklerde ilk kez sağlar. Acayip bir insan sağlığı ve hastalık durumlarında, bu sitokin düzeyleri izlemek son derece yararlı olacaktır çoğu özellikle enfeksiyon, otoimmünite ve autoinflammation.

Özet olarak, bir pan-IFN-α tek molekül dizi tahlil limiti 0.69 fg/mL, 2-adım yapılandırma yakalama boncuk ile kullanarak algılama 0.3 mg/mL anti-IFN-α ile kaplı bir biotin: antikor oranı, bir antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor biotinylated 30 geliştirilmiştir. Biotinylated algılama antikor ve SBG için kullanılan konsantrasyonları 0,3 olduğunu µg/mL ve 150 pM, anılan sıraya göre. Bu çok özel tahlil tüm 13 IFN-α alt türlerini tespit yeteneğine sahiptir ve cross IFNs başka tür tepki vermez. Böylece, tanımlamak ve IFN-α tek tek her tür ölçmek mümkün değildir, ancak hepsini tespit edilebilir ve birlikte IFN-13 farklı alt sınıflarını oluşturan α için toplam konsantrasyonu değer veren ölçülür.
Yeni geliştirilen bu tahlil olası tanı değerini keşfetmek için IFN-α protein plazma ve serum sağlıklı bireylerin ölçülen ve SLE ve JDM muzdarip hastaların örnekleri ile karşılaştırıldığında. Şekil 7' de gösterildiği gibi sağlıklı kontrol ile karşılaştırıldığında her iki hastalık kohortlardan IFN-α protein yüksek seviyede algılandı. Noktalı çizgi nasıl bu yaklaşım IFN-α protein bu sitokin bilinen kurum ile bu fenotipleri rağmen hasta bu gruplarda bulmak istiyorsunuz değil gösteren bir geleneksel ticari olarak mevcut ELISA LOD gösterir. Ayrıca, IFN-α tespit düzeyleri arasında 1-10 fg/mL teyit tahlil son derece hassas doğası ile tahlil geniş dinamik aralığını gösteren büyüklüğü, 5 günlükleri sayısal.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Şekil 7: miktar plazma ve serum üzerinden hasta kohortlardan IFN-α proteinin. Bu rakam Rodero ve arkdeğiştirildi. 2017. plazma sağlıklı kontrol üzerinden (n = 20) ve SLE hastalarda (n = 72) ve JDM (n 43 =) pan-IFNα tek molekül dizi tahlil ile test edildi. Çözümlemenin tek yönlü ANOVA testi (Kruskal-Wallis) ve Dunn'ın birden fazla karşılaştırma grupları arasında test kullanarak. Medyan tasvir edilir. Noktalı çizgi gösterir bir başvuru insan anti-IFN-α ELISA LOD (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>Dikkat edilmesi gereken noktalar</td>
			<td>Başvuru</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. antikor çifti seçim</td>
			<td>Hedef farklı epitopları</td>
			<td rowspan="3">Tablo 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yüksek benzeşimi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Küzerinde hızlı / yavaş Kkapalı
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. antikor çift yönlendirme</td>
			<td rowspan="3">Algılama en düşük Limit ile koşulları seçin</td>
			<td rowspan="3">Resim 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. antikor konsantrasyon yakalama</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: Dedektör antikor oranı</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 3-adım yapılandırma vs</td>
			<td>Sinyal: arka plan oranı en yüksek olan koşul seçin</td>
			<td>Resim 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. Dedektör antikor konsantrasyonu</td>
			<td rowspan="2">Algılama en düşük Limit ile koşulları seçin</td>
			<td rowspan="2">Şekil 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. özgüllük</td>
			<td>Olan değerlendirmek</td>
			<td rowspan="2">Şekil 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. duyarlılık</td>
			<td>(Varsa) tanıma alt türlerinden değerlendirmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. tekrarlanabilirlik</td>
			<td>Tahlil değişkenliği değerlendirmek</td>
			<td>Şekil 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Özet adımlar geliştirme ve bir tek molekül dizi tahlil iyileştirmesi için. Bu tablo geliştirme ve tekrarlanabilirlik değerlendirilmesi kadar antikor çiftinin ilk seçim bir tek molekül dizi tahlil duruma getirilmesi için gereken farklı adımları özetlemektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antijen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10,7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2,01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93,29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Pan-Alfa antikoru seçim. IC50 (ng/mL) belirlenen interferon teşvik yanıt öğesini (ISRE) kullanarak-Luciferase nötralizasyon tahlil. Masa tek molekül dizi tahlil tüm IFN-α alt türleri için kullanılan mAbs IC50 değerlerini gösterir. 10.000 HEK 293 MSR hücreleri beyaz yarı-alan 96-şey levha tohumlari ve ters-50 ng premix ISRE ateş böceği luciferase muhabir ve üreticinin yönergelerine göre transfection reaktifler kullanarak Renilla luciferase yapıları ile transfected. Luciferase ifade etme yapı iç normalleştirme denetimi olarak görev yaptı. Hücreleri gecede İndirimli Serum 0,1 mM gerekli olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate, 37 ° C'de % 0.5 fetal Sığır serum, oksijen bir atmosferde % 5 CO2 ile desteklenmiş orta inkübe. Gecede kuluçka sonra hücreleri, 24 saat rekombinant insan IFN-α ile ya da ezelî anti-IFN-α mAbs ya da denetim 37 ° C'de 1 h için preincubated IgG karışımları içeren orta ile teşvik Stimülasyon 24 saat sonra üreticinin yönergelerine göre çift luciferase muhabir deneyleri gerçekleştirilmiştir. «-» Belirlenmemiştir. Sifalimumab bir tamamen insan immünoglobulin G1 κ monoklonal bağlar ve IFN-α alt türlerinden çoğunluğu nötralize antikor olduğunu; Rontalizumab karşı IFN-α insanlaşmış monoklonal antikor var. Meyer vd. 2016 ve Rodero vd. 2017.
Ek tablo 1: seçim antikor yönelimi, yakalama antikor konsantrasyon boncuk ve biotinylation oranı. İki olası farklı yapılandırma anti-IFN-α yakalama antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor (A) ve Yardımcısı kullanarak test edildi tersi (B). IFNα - 2c antijen kullanıldı. Biyotin: antikor (B:A) oranları yanı sıra farklı yakalama antikor konsantrasyonları da her iki yapılandırmaları için test edildi. Doyma (Doy). Turuncu: LOD hesaplaması için kullanılan AEB değerleri; Bu konsantrasyonları sabit kaldı AEB değerleri olarak boş kabul edildi. LOD olarak hesaplanır demek boş + 3SD. olarak <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 2: 2 vs 3-adım yapılandırma testi. 2 ve 3 - adım yapılandırmaları kullanarak IFNα - 2 c antijen değerlendirildi. AEB değerleri de sinyal/erzak (S/B) arka plan gibi koşulların her ikisi de görüntülenir. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 3: dedektörü ve SBG konsantrasyon optimizasyonu. Biotinylated dedektörü antikor (0.1, 0.3 ve 0.6 µg/mL) ile birlikte SBG üç farklı konsantrasyonlarda üç farklı konsantrasyonlarda (50, 150 ve 250 pM) değerlendirildi. AEB değerler için dokuz test edilmiş koşullar gösterilmiştir. Turuncu: LOD hesaplaması için kullanılan AEB değerleri; Bu konsantrasyonları sabit kaldı AEB değerleri olarak boş kabul edildi. LOD olarak hesaplanır demek boş + 3SD. olarak <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 4: özgüllük ve en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi tahlil duyarlılığını. Boncuk değeri ortalama enzim otelde IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω ve IFN γ rekombinant proteinler edildi (A), ile birlikte 16 alt türlerinden IFN-α (B) test gösterilir. «-» Belirlenmemiştir. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 5: en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi testin tekrarlanabilirlik. Tüm üç bağımsız çalışan için Ortalama AEB değerleri 10.000 fg/mL konsantrasyonu için gösterilir. «-» Belirlenmemiştir. Doyma (Doy). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 6: Protein rekabet tahlil. Boncuk değeri ortalama enzim test tüm koşulları için gösterilir. Ölçüler içinde yinelenen yapıldı. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Burada açıklamak için geliştirme ve insan örneklerinde tüm IFN-α türlerinden Ultra-duyarlı algılama sağlayan bir tek molekül dizi dijital ELISA yöntemi, doğrulama iletişim kuralı mevcut.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Bu yöntem, oto-bağışıklık ve enfeksiyon dahil olmak üzere farklı hastalık ortamlarında interferonun neden olduğu yanıtların doğası, düzenlenmesi ve biyolojik etkisi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kendi başkanlık hassasiyetidir. Bu teknik, sitokinleri benzeri görülmemiş bir hassasiyetle ölçebildiği için birçok hastalıkta hasta yönetimini iyileştirmek için biyobelirteç keşfi için büyük bir potansiyele sahiptir.Bu yaklaşımla ilgili önemli bir adım, otoimmün poliindokrin sistem tip bir olan hastalarla ilgili aktiviteleri nötralize etmekti. Başlamak için, 280 milyon paramanyetik boncuğu bir mikrofüj tüpüne yükleyin ve hacmi not edin. Daha sonra boncukları darbeyle döndürün ve tüpü bir dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya koyun.Seyreltici çözeltiyi çıkarın ve atın, böylece boncukları izole edin. Daha sonra, boncukları BWB ile iki kez ve BCB ile iki kez yıkayın. Her yıkama için 200 mikrolitre ekleyin ve tüpü beş saniye boyunca girdaplayın.Daha sonra manyetik ayırıcıyı kullanarak boncukları çözeltiden ayırın. Bir dakikalık ayırma işleminden sonra seyrelticiyi atın. Ardından, boncuk hacmi başına 190 mikrolitre BCB ekleyin.Daha sonra tüpü kısaca girdaplayın, tüpü darbeyle döndürün ve yıkanmış boncukları buzun üzerine koyun. Boncukları aktive etmek için, bir mililitre soğuk BCB'yi 10 miligram EDC ile birleştirin ve çözelti homojen olana kadar girdaplayın. Doğal kararsızlığı ve ekinus çözümü nedeniyle EDC kullanırken hızlı ve güvenli bir şekilde çalışın.Daha sonra boncuk süspansiyonuna boncuk hacmi başına 10 mikrolitre soğuk, seyreltilmiş EDC ekleyin ve boncukları kısaca girdaplayın. Daha sonra, boncukları 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya koyun. Boncuklara antikorları konjuge etmek için, önce girdap ve nabız aktive edilmiş boncukları döndürür.Ardından boncukları bir dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya koyun ve BCB süpernatantını atın. Daha sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın ve boncukları 200 mikrolitre BCB ile iki kez yıkayın. Daha sonra girdap, darbe dönüşü yapın ve tamponu çıkarmak için boncukları manyetik olarak ayırın.Ardından, aktive edilmiş boncuklara hızlı bir şekilde 200 mikrolitre soğuk, tampon değişimli antikor ekleyin. Boncukları çözeltiye girdapladıktan sonra, süspansiyonu 1.000 RPM'de iki saat boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcıya koyun. Antikor kaplı boncuk süspansiyonuna bir darbe dönüşü vererek başlayın ve ardından tamponu çıkarmak için manyetik sütunu kullanın.Ardından, tampondaki proteinin konsantrasyonunu kontrol edin. Düşük hacimli bir spektrafotometre kullanın. Bu noktada, antikorlar boncuklara bağlanır ve sıfırın üzerindeki herhangi bir değer, boncukların antikorlarla doyurulduğu anlamına gelir.Şimdi, önceki tüm yıkamalarda olduğu gibi boncukları 200 mikrolitre BWB ile yıkayın. Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve protein konsantrasyonunu kontrol edin. Boncuklardan salınan proteinlerin miktarının belirlenmesi, antikor eşleşmesinin ölçülmesine izin verir.Daha sonra boncukları tekrar 200 mikrolitre BWB ile yıkayın. Daha sonra, 200 mikrolitre boncuk engelleme tamponu ekleyin, tüpü beş saniye boyunca vorteksleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığındaki çalkalayıcıya aktarın. 30 dakika sonra boncuklar bloke olacaktır.Daha sonra, 200 mikrolitre BWB kullanarak bir kez yıkayın, ardından her yıkama için 200 mikrolitre boncuk seyreltici tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, kaplanmış ve bloke edilmiş boncukları dört santigrat derecede 200 mikrolitre boncuk seyreltici tamponunda saklayın. Videonun bu bölümü, ev yapımı bira konfigürasyonunda tek molekül dizi analizörü yazılımını kullanarak tahlil koşullarının nasıl ayarlanacağına ilişkin stratejiler önermektedir.Her iki antikor kombinasyonunda yakalama antikoru, konjuge boncuklar ve biyotinilasyon tespit antikorunun farklı kombinasyonlarını test ederek başlayın. Daha sonra, antikorları tespit etmek ve yakalamak için iki farklı biyotinilasyon oranına sahip üç farklı yakalama antikoru konsantrasyonunun kombinasyonlarını test edin ve bunun tersi de geçerlidir. Ardından, en düşük algılama düzeyini sunan kombinasyonu seçin ve sonraki adımlar için kullanın.Bu durumda, 30'a bir biyotin / antikor oranı en iyi tespit sınırını verir. Ardından, iki adımlı bir yapılandırmayı üç adımlı bir yapılandırmayla karşılaştırın. Üç adımlı konfigürasyonların üç farklı inkübasyon adımı vardır.Biri yakalama antikoru ile, biri tespit antikoru ile ve son, üçüncüsü SBG enzim etiketlemesi için. İki adımlı yapılandırmalar, yakalama ve algılama inkübasyonlarını birleştirir. Üreticinin talimatlarını izleyerek, analizörde önceden yapılandırılmış iki ve üç aşamalı konfigürasyonlarda seçilen yakalama ve dedektör antikor konsantrasyonlarını ve rasyonlarını kullanarak tek moleküllü dizi analizörünü çalıştırın.Ardından, en yüksek hassasiyete izin veren yapılandırmayı seçin ve sonraki adımlar için saklayın. Bu durumda, iki adımlı konfigürasyon her test noktasında biraz daha yüksek hassasiyet verir. Ardından, dedektör antikorunun ve SBG'nin konsantrasyonlarını optimize edin.Üç farklı konsantrasyonda SBG ile üç farklı konsantrasyonda dedektör antikoru test edin. En yüksek hassasiyeti veren konsantrasyonları seçin ve bunları sonraki adımlar için saklayın. Bu durumda, mililitre antikor başına 0.3 mikrogram ve 150 pika molar SBG, tesadüfi orta genliğe sahip düşük arka plan seviyeleri ile optimum tespit seviyesine sahiptir.Ek optimizasyon adımları için metin protokolüne bakın. Burada, tahlil özgüllüğünü ve tekrarlanabilirliğini optimize etmek için prosedürler ve protein rekabeti için bir test vardır. İnterferon-alfa'nın 13 alt sınıfını tespit etmek için optimize edilmiş bir test kullanılarak, SLE hastalarında, JDM hastalarında ve sağlıklı kontrollerde plazma ve serum analiz edildi.Her iki hastalık kohortunda da yüksek seviyelerde interferon-alfa proteini tespit edildi. Noktalı çizgi, bu sitokin'in bu hastalıklardaki bilinen rolüne rağmen, bu hasta gruplarında interferon-alfa proteinini tespit edemeyen geleneksel, ticari olarak temin edilebilen bir Eliza'nın tespit seviyesini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, tercih ettiğiniz analiz için tek bir molekül dizisi testinin nasıl geliştirileceği ve doğrulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü denerken, hücre seçimi sırasında antikorların olduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden bu yana, bu test, çeşitli oto-immün hastalıklar ve enfeksiyonlarda interferon-alfa'nın rolünün daha iyi karakterize edilmesine izin vermiştir. Bu test aynı zamanda yeni tedavilere verilen yanıtları izlemeye ve belirli oto-immün bozukluklardan sorumlu hücresel aktörleri tanımlamaya da hizmet etmiştir.

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein,...

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

Luminex Corporation Xmap mikroküre teknolojisini kullanarak, çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinin serosurveillance için Multiplexed Florometrik immunoassay (MFIA) geliştirdik. MFIA antijeni, doku kontrolü veya immünglobulin kovalent renk kodlu polistiren mikroküreler bağlantılı bir süspansiyon mikroarray olduğunu. MFIA test yöntemi hem de çeşitli giderme konularını ele almaktadır.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Bu videoda, fare dalağında in situ interferon-gama (IFN-γ) sekresyonunu görselleştirmek için bir görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Bakteriyel enfeksiyon ve T hücreleri ve doğal öldürücü hücreler içinde IFN-γ birikiminin indüklenmesini takiben, dalak fareden alınır. Doku kesitleri elde edildikten sonra, hücrelerin içindeki IFN-γ'yi görselleştirmek için immün boyama yapılır.

Murin Lenfoid Organlarında İnterferon-Gama Sekresyonunun Tanımlanması için Test

Bu video, plazmositoid dendritik hücrelerin HIV-1 Enfekte CD4+ T hücreleri tarafından uyarılmasını takiben salınan tip-I interferonları (IFNler) ölçmek için HEK-Blue interferon-α/β raportör hücreleri kullanılarak salgılanan embriyonik alkalin fosfataz testini göstermektedir.

Salgılanan Embriyonik Alkalen Fosfataz Raportör Testi Kullanılarak Biyoaktif Tip-I İnterferonların Miktar Tayini

Bu protokol, tip I ve III IFN ekspresyon imzalarının analizi için yüksek verimli bir qRT-PCR testini tanımlar. Tahlil, bu genlerin oldukça benzer transkriptleri arasındaki tek baz çifti farklılıklarını ayırt eder. Toplu montaj ve robotik pipetleme sayesinde tahliller tutarlı ve tekrarlanabilirdir.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Keşfedin tek molekül dijital ELISA yöntemiyle insan IFN-α alt tiplerini ultra hassas şekilde tespit etmeyi. Bu yöntem otoimmün hastalıklarda interferon yanıtlarını anlamak ve biyobelirteç keşfi için güçlü bir araç sunar.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Daha fazla video keşfet