Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Bu yöntem, oto-bağışıklık ve enfeksiyon dahil olmak üzere farklı hastalık ortamlarında interferonun neden olduğu yanıtların doğası, düzenlenmesi ve biyolojik etkisi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kendi başkanlık hassasiyetidir. Bu teknik, sitokinleri benzeri görülmemiş bir hassasiyetle ölçebildiği için birçok hastalıkta hasta yönetimini iyileştirmek için biyobelirteç keşfi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Bu yaklaşımla ilgili önemli bir adım, otoimmün poliindokrin sistem tip bir olan hastalarla ilgili aktiviteleri nötralize etmekti. Başlamak için, 280 milyon paramanyetik boncuğu bir mikrofüj tüpüne yükleyin ve hacmi not edin. Daha sonra boncukları darbeyle döndürün ve tüpü bir dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya koyun.

Seyreltici çözeltiyi çıkarın ve atın, böylece boncukları izole edin. Daha sonra, boncukları BWB ile iki kez ve BCB ile iki kez yıkayın. Her yıkama için 200 mikrolitre ekleyin ve tüpü beş saniye boyunca girdaplayın.

Daha sonra manyetik ayırıcıyı kullanarak boncukları çözeltiden ayırın. Bir dakikalık ayırma işleminden sonra seyrelticiyi atın. Ardından, boncuk hacmi başına 190 mikrolitre BCB ekleyin.

Daha sonra tüpü kısaca girdaplayın, tüpü darbeyle döndürün ve yıkanmış boncukları buzun üzerine koyun. Boncukları aktive etmek için, bir mililitre soğuk BCB'yi 10 miligram EDC ile birleştirin ve çözelti homojen olana kadar girdaplayın. Doğal kararsızlığı ve ekinus çözümü nedeniyle EDC kullanırken hızlı ve güvenli bir şekilde çalışın.

Daha sonra boncuk süspansiyonuna boncuk hacmi başına 10 mikrolitre soğuk, seyreltilmiş EDC ekleyin ve boncukları kısaca girdaplayın. Daha sonra, boncukları 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya koyun. Boncuklara antikorları konjuge etmek için, önce girdap ve nabız aktive edilmiş boncukları döndürür.

Ardından boncukları bir dakika boyunca manyetik bir ayırıcıya koyun ve BCB süpernatantını atın. Daha sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın ve boncukları 200 mikrolitre BCB ile iki kez yıkayın. Daha sonra girdap, darbe dönüşü yapın ve tamponu çıkarmak için boncukları manyetik olarak ayırın.

Ardından, aktive edilmiş boncuklara hızlı bir şekilde 200 mikrolitre soğuk, tampon değişimli antikor ekleyin. Boncukları çözeltiye girdapladıktan sonra, süspansiyonu 1.000 RPM'de iki saat boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcıya koyun. Antikor kaplı boncuk süspansiyonuna bir darbe dönüşü vererek başlayın ve ardından tamponu çıkarmak için manyetik sütunu kullanın.

Ardından, tampondaki proteinin konsantrasyonunu kontrol edin. Düşük hacimli bir spektrafotometre kullanın. Bu noktada, antikorlar boncuklara bağlanır ve sıfırın üzerindeki herhangi bir değer, boncukların antikorlarla doyurulduğu anlamına gelir.

Şimdi, önceki tüm yıkamalarda olduğu gibi boncukları 200 mikrolitre BWB ile yıkayın. Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve protein konsantrasyonunu kontrol edin. Boncuklardan salınan proteinlerin miktarının belirlenmesi, antikor eşleşmesinin ölçülmesine izin verir.

Daha sonra boncukları tekrar 200 mikrolitre BWB ile yıkayın. Daha sonra, 200 mikrolitre boncuk engelleme tamponu ekleyin, tüpü beş saniye boyunca vorteksleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığındaki çalkalayıcıya aktarın. 30 dakika sonra boncuklar bloke olacaktır.

Daha sonra, 200 mikrolitre BWB kullanarak bir kez yıkayın, ardından her yıkama için 200 mikrolitre boncuk seyreltici tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, kaplanmış ve bloke edilmiş boncukları dört santigrat derecede 200 mikrolitre boncuk seyreltici tamponunda saklayın. Videonun bu bölümü, ev yapımı bira konfigürasyonunda tek molekül dizi analizörü yazılımını kullanarak tahlil koşullarının nasıl ayarlanacağına ilişkin stratejiler önermektedir.

Her iki antikor kombinasyonunda yakalama antikoru, konjuge boncuklar ve biyotinilasyon tespit antikorunun farklı kombinasyonlarını test ederek başlayın. Daha sonra, antikorları tespit etmek ve yakalamak için iki farklı biyotinilasyon oranına sahip üç farklı yakalama antikoru konsantrasyonunun kombinasyonlarını test edin ve bunun tersi de geçerlidir. Ardından, en düşük algılama düzeyini sunan kombinasyonu seçin ve sonraki adımlar için kullanın.

Bu durumda, 30'a bir biyotin / antikor oranı en iyi tespit sınırını verir. Ardından, iki adımlı bir yapılandırmayı üç adımlı bir yapılandırmayla karşılaştırın. Üç adımlı konfigürasyonların üç farklı inkübasyon adımı vardır.

Biri yakalama antikoru ile, biri tespit antikoru ile ve son, üçüncüsü SBG enzim etiketlemesi için. İki adımlı yapılandırmalar, yakalama ve algılama inkübasyonlarını birleştirir. Üreticinin talimatlarını izleyerek, analizörde önceden yapılandırılmış iki ve üç aşamalı konfigürasyonlarda seçilen yakalama ve dedektör antikor konsantrasyonlarını ve rasyonlarını kullanarak tek moleküllü dizi analizörünü çalıştırın.

Ardından, en yüksek hassasiyete izin veren yapılandırmayı seçin ve sonraki adımlar için saklayın. Bu durumda, iki adımlı konfigürasyon her test noktasında biraz daha yüksek hassasiyet verir. Ardından, dedektör antikorunun ve SBG'nin konsantrasyonlarını optimize edin.

Üç farklı konsantrasyonda SBG ile üç farklı konsantrasyonda dedektör antikoru test edin. En yüksek hassasiyeti veren konsantrasyonları seçin ve bunları sonraki adımlar için saklayın. Bu durumda, mililitre antikor başına 0.3 mikrogram ve 150 pika molar SBG, tesadüfi orta genliğe sahip düşük arka plan seviyeleri ile optimum tespit seviyesine sahiptir.

Ek optimizasyon adımları için metin protokolüne bakın. Burada, tahlil özgüllüğünü ve tekrarlanabilirliğini optimize etmek için prosedürler ve protein rekabeti için bir test vardır. İnterferon-alfa'nın 13 alt sınıfını tespit etmek için optimize edilmiş bir test kullanılarak, SLE hastalarında, JDM hastalarında ve sağlıklı kontrollerde plazma ve serum analiz edildi.

Her iki hastalık kohortunda da yüksek seviyelerde interferon-alfa proteini tespit edildi. Noktalı çizgi, bu sitokin'in bu hastalıklardaki bilinen rolüne rağmen, bu hasta gruplarında interferon-alfa proteinini tespit edemeyen geleneksel, ticari olarak temin edilebilen bir Eliza'nın tespit seviyesini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, tercih ettiğiniz analiz için tek bir molekül dizisi testinin nasıl geliştirileceği ve doğrulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, hücre seçimi sırasında antikorların olduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden bu yana, bu test, çeşitli oto-immün hastalıklar ve enfeksiyonlarda interferon-alfa'nın rolünün daha iyi karakterize edilmesine izin vermiştir. Bu test aynı zamanda yeni tedavilere verilen yanıtları izlemeye ve belirli oto-immün bozukluklardan sorumlu hücresel aktörleri tanımlamaya da hizmet etmiştir.