Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

Bu deneyin genel amacı, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler analizler için yüksek kaliteli zenginleştirilmiş stoma koruyucu hücreleri hazırlamaktır. Merhaba, benim adım Sheldon Lawrence. Florida Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nde Dr. Chen'in laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.

Bugün size, stomaların hem fizyolojisini hem de biyolojisini incelemek için yararlı bir materyal olan bitki yaprak dokusundan koruyucu hücrelerin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Bu yöntem, koruyucu hücreleri izole etmek için yeni bir yöntem olarak kabul edilir. Özellikle sağlam koruyucu hücrelerin zenginleştirilmesine izin verir ve stoma hücresi sinyalleme süreçlerinin incelenmesi için güvenilir numuneler sağlar.

Bu yöntemin uygulanması, protokolde sadece küçük bir değişiklikle Brassicaceae bitkilerine ve diğer bitki türlerine kadar uzanabilir. Gösteri önemlidir, çünkü koruma hücrelerini zenginleştirmek için ana adım zor olabilir. Başlamak için olgun, beş haftalık Arabidopsis bitkilerini seçin.

Bir yaprağı neşterle dikkatlice çıkarın, yaprağı tabanda kesin. İki parça bant alın ve eksize edilen yaprağı aralarına yerleştirin. Bant parçalarının ucunun yapışmadığından emin olurken her iki tarafa da nazikçe baskı uygulayın.

Bu, aralarına bir parmak sokarak yapılabilir. İki bant parçasını nazikçe birbirinden ayırın ve yaprağın abaksiyal tarafından alınan kabuğu hemen stoma açma tamponuna kaydırın. Tüm kabuklar toplandıktan sonra ışık altına koyun.

Onları iki saat orada bırakın. Birkaç kabuk alın ve bunları mikroskop slaytlarına yerleştirin. Bir ışık mikroskobu kullanarak, koruyucu hücreleri görmek için lensleri ayarlayın ve açık olduklarından emin olun.

Kabukları 50 ml hücre duvarı sindirim enzimi çözeltisine yerleştirin. Onları 26 santigrat derecede yüzdürün ve inkübe edin. 20 dakika sonra, kabukları enzim çözeltisinden çıkarın ve deiyonize su ile iki kez kısa bir süre durulayın ve taze stoma açma tamponuna koyun.

Kabukları bir havanda sıvı azot ile bir havanda öğütün, bir havaneli ile. Ardından metinde anlatıldığı gibi fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin. Kabukları havanda öğüttükten sonra, özü kabuklarla birlikte bir Oak Ridge santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.

% 100 metanol içinde beş hacim buz gibi soğuk 0.1 mol amonyum asetat ekleyerek fenol ekstrakte edilen proteinleri çökeltin. Proteini gece boyunca 20 santigrat derecede çökelttikten sonra, proteini santrifüjleme ile hasat edin ve metinde açıklandığı gibi pelet yıkamaları yapın. Peleti bir mililitre soğuk aseton içinde yeniden süspanse edin ve iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüjlemeden sonra, aseton süpernatantını atın ve peleti on dakika kurutun. Protein örneğini bir çözünme tamponu içinde çözün. Vorteks ve santrifüjlemeden sonra, süpernatanı toplayın ve protein konsantrasyonunu ölçün.

Bir SDS-PAGE jeli çalıştırın. Ayrı protein bantlarını görselleştirin ve nispi protein kalitesini gözlemleyin. Bu, mezofil ve epidermal hücrelerin enzim sindiriminden önce ve sonra Arabidopsis koruyucu hücrelerinin temsili bir görüntüsüdür.

Mezofil ve epidermal hücrelerin çıkarılmasından önce ve sonra koruyucu hücre canlılığı, enzimatik aktiviteyi ve hücre zarı bütünlüğünü ölçen floresein diasetat kullanılarak gözlemlenebilir. Gördüğünüz gibi, koruyucu hücreler soyulma ve enzim sindiriminden sonra hala canlı. Bu örnek, ABA tedavisine yanıt olarak Arabidopsis'in stoma hareketini göstermektedir.

Koruyucu hücreler tedaviye yanıt verir ve ABA ile 30 dakikalık tedaviden sonra stoma açıklığı %50'den fazla azalır. İşte stoma hareketinin bir zaman seyri. Ek olarak, her zaman noktasında stoma açıklığının temsili bir görüntüsü gösterilir.

Protein tespiti, ayrılması ve nispi bolluk SDS-PAGE tarafından gözlemlenir. Bantlar açık ve belirgindir. Bu yöntemden protein ekstraksiyonunun tekrarlanabilirliğini vurgulamak için dört biyolojik kopya dahil edilmiştir.

Bu yöntem için ilk olarak, koruyucu hücre moleküler değişikliklerini gerçek zamanlı olarak stoma hareketi ile ilişkilendirmeye çalıştığımızda aklımıza geldi. Bir kez ustalaştıktan sonra, stoma koruyucu hücrelerden bir protein örneği birkaç saat içinde hazırlanabilir ve birden fazla deneyde kullanılabilir. Soyma ve kullanım sırasında koruyucu hücrelere büyük miktarda zarar vermemeyi unutmamak önemlidir.

Bu yöntemi takiben, normal ve stres koşullarında bitkilerdeki proteinlerin redux tepkisini incelemek için izobarik etiketleme gibi koruyucu hücre sinyalizasyonunu araştırmak için başka teknikler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlam ve canlı koruyucu hücrelerin nasıl izole edileceğini ve zenginleştirileceğini ve ayrıca aşağı akış çalışmaları için uygun yüksek kaliteli proteinin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.