Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Bu test serisinin genel amacı, fare oositlerini kullanarak Mayoz I sırasında insan gen fonksiyonunu araştırmaktır. Bu yöntemler, insan üreme alanında, maternal anöploidiye genetik bir yatkınlık olup olmadığı gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fare oositlerini memeli mayozu için bir model olarak kullanmasıdır, bu da gen fonksiyonu çalışmaları için insan yumurtalarına erişilemezliği göz önüne alındığında yararlıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, tüp bebek tedavisi görmüş ve embriyonik anöploidi oranları anne yaşı ile açıklanamayan kadınların ekzomlarını dizilediğimizde aklımıza geldi. Görüntü analizi adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve katı analiz parametrelerinin tanımlanması titizlik ve tekrarlanabilirliğin anahtarı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Doğrulanmış bir klonlama stratejisi kullanarak, ilgilenilen genin tam uzunlukta kodlama dizisini in vitro transkripsiyon vektörünün çoklu klonlama bölgesine yerleştirin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi tek nükleotid polimorfizmleri veya eklemeler ve silmeler oluşturuyorsa DNA'yı mutajize edin. Daha sonra, mutajenize DNA'yı bir bakteri konağına dönüştürün. Üreticinin talimatlarını izleyerek plazmidi izole etmek ve saflaştırmak için bir kit kullanın.

Daha sonra, saflaştırılmış DNA'nın tek kısıtlama enzimi sindirimini kullanarak nihai ürünleri doğrusallaştırın. Sindirilmiş ürünü, doğrulanmış bir DNA temizleme protokolü veya bir kit kullanarak saflaştırın. Ve 30 mikrolitre RNase / DNaz içermeyen suda elute edin.

İn vitro, üreticinin protokolünü izleyerek T7 polimeraz kullanarak DNA'yı kopyalayın. Son olarak, üreticinin protokolünü izleyerek silika matrisli spin-kolon bazlı nükleik asit saflaştırma kiti kullanarak RNA'yı 30 mikrolitre RNase/DNaz içermeyen suda saflaştırın ve elüte edin. Mikroenjeksiyon için oositleri eşit gruplara bölün

Bir gruba deneysel mRNA ve diğer gruba vahşi tip kontrol NPB'leri veya GFP mRNA'sı ile mikroenjekte edin. Cam pipet açıklığının bir oositin çapından biraz daha büyük olduğu yerlerde elle veya ağızla çalıştırılan bir pipetleme cihazı kullanarak, oositleri embriyo kalitesinde mineral yağ ile kaplı bir Petri kabında 100 mikrolitrelik bir damla milrinon içermeyen kültür ortamına aktarın. Daha sonra, Mayoz I'in metafazına yeterli olgunlaşmayı sağlamak için% 5 CO2'de 37 santigrat derecede yedi saat boyunca inkübe edin.

Çanağı yedi dakika boyunca buzun üzerine koyun. Oositleri, 1x PBS'de 400 mikrolitre %2 paraformaldehit içeren şeffaf bir cam spot plakanın kuyusuna aktararak sabitleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

İmmün boyamayı takiben, metin protokolünde açıklandığı gibi, oositleri konfokal bir mikroskopta 40 ila 63x objektif kullanarak görüntüleyin. Çalışma hedefi için optimize edilmiş Z düzlemindeki küçük adımları yakalayın ve metafaz milinin tüm bölgesini görüntüleyin. Kinetokor mikrotübül bağlantı durumunu belirlemek için önce dosyayı ImageJ araç çubuğuna sürükleyerek görüntüyü açın.

Açılan Z serisinde, görüntü açılır menüsüne gidin ve Renk alt sekmesinin altında, tüm kanalları görünür hale getirmek için Kanalları Birleştir'e tıklayın. Analistin, fare oositlerinde kinetokorlara ne tür bağlantıların mümkün olduğunu bilmesi çok önemlidir. Görüntünün kalitesi, bu verileri doğru bir şekilde analiz etme yeteneğinizi büyük ölçüde etkileyecektir.

Görüntünün altındaki düğmeyi kullanarak, her bir Z diliminde hareket edin ve kinetokor mikrotübül ekini belirleyin. Aynı pipet aparatını kullanarak, oositleri yağ altında 100 mikrolitrelik bir damla milrinon içermeyen kültür ortamına aktarın. Daha önce olduğu gibi Mayoz I'in metafazına yeterli olgunlaşmayı sağlamak için oositleri yedi saat inkübe edin.

Daha sonra, oositleri, merkez kuyuda monastrol içeren 700 mikrolitre kültür ortamı ve çevreleyen halkada 400 mikrolitre su içeren bir merkez kuyu organ kültürü kabına aktarın. 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Oositleri üç damla 100 mikrolitre CZB kültür ortamından geçirerek monastrolü durulayın.

Daha sonra oositleri, 700 mikrolitre kültür ortamı ve merkez halkada proteazom inhibitörü içeren yeni bir merkez kuyu organ kültürü kabına aktarın. Dış halkaya 400 mikrolitre su ekleyin ve üç saat inkübe edin. Daha sonra, oositleri, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de 400 mikrolitre% 2 paraformaldehit içeren şeffaf bir cam spot plakanın kuyusuna aktararak sabitleyin.

Oositleri konfokal bir mikroskopta 40 ila 63x objektif kullanarak görüntüleyin, Z düzleminde bir mikrondan daha az adım yakalayın ve metafaz milinin tüm bölgesini görüntülediğinizden emin olun. Kromozom hizalama durumunu belirlemek için, görüntüleme yazılımını kullanarak görüntü dosyalarını açın. Ardından görüntüyü ImageJ kontrol paneline sürükleyin.

Açık Z serisinde, aleti görüntüdeki iş mili direğinin üzerine yerleştirerek ve resmin üzerine tıklayarak her bir iş mili direğinin sonundaki noktaları kendi Z dilimlerinde işaretlemek için nokta aracını kullanın. Klavyedeki komut düğmesine ve T düğmesine aynı anda basarak bu noktaları ROI Yöneticisine ekleyin. ROI Yöneticisi'nde belirli bir noktayı vurgulayarak ve Ölç düğmesine tıklayarak ayarlanan konumların her biri için belirli koordinatları belirleyin.

Bu, sırasıyla X1, Y1 ve X1, Y2 noktaları olan her nokta için X ve Y koordinatlarını içeren bir Sonuçlar tablosu sağlayacaktır. Ardından, gerçek Z koordinatını belirleyin. Bu, mil kutbunun yığın kalınlığı ile tanımlandığı Z yığınındaki belirli Z diliminin dilim numarasının çarpılmasıyla yapılır.

Bunlar sırasıyla Z1 ve Z2 noktaları olacaktır. Önceden tanımlanmış X, Y ve Z koordinatları ile Pisagor teoremi denklemini kullanarak iş mili uzunluğunu belirleyin. Ardından, iş mili orta bölgesini belirleyin.

Bu, milin uzunluğunun 1/2'si olarak hesaplanır. ImageJ araç çubuğundaki çizgi simgesine tıklayın ve bir iş mili direğinden iş mili orta bölgesine kadar olan bir çizgi çizin. Uzunluk, ImageJ araç çubuğunda görüntülenecektir.

Katı kromozom hizalama parametrelerinin tanımlanması, verilerin tekrarlanabilirliğinde önemli olan sağlam bir nicel analize izin verir. Çizgi ölçüm aracını kullanarak mil orta bölgesinden kromozom mesafesini değerlendirerek kromozom hizalama durumunu belirleyin. ImageJ araç çubuğundaki çizgi simgesine tıklayın ve mil orta bölgesinden kromozoma bir çizgi çizin.

Uzunluk, ImageJ araç çubuğunda görüntülenecektir. İğ orta bölgesinden dört mikrondan daha büyük kromozomlar hizalanmamış olarak kabul edilir. Oositler immün boyama ve görüntülemeye tabi tutulduktan sonra, doğru mikrotübül kinetokor ekleri değerlendirilebilir.

Normal bir bağlantıda, iki değerlikli her bir kardeş kinetokor çifti, zıt kutuplardan iğ mikrotübüllerine bağlanır. En fazla üç farklı türde anormal anormal ataşman gözlemlenebilir. Bir örnek, kinetokore temas eden mikrotübüller olmadığında ortaya çıkar.

Alternatif olarak, mikrotübüller yanlış bir şekilde bağlanarak sintelik veya merotelik ekler üretebilir. Sintelik ekler, tek bir kutuptan çıkan mikrotübüllere bağlı her iki kardeş kinetokar çifti ile oluşur. Merotelik bağlanmalar, bir çiftteki kardeş kinetokorlar zıt kutuplara bağlandığında ortaya çıkar.

Oositler indüklenen yanlış hizalamadan kurtulduktan sonra, kromozomların yeniden hizalanma yeteneği görüntüleme ile değerlendirilir. Bu örnekte, iki değerlikli bir kromozom, iğ orta bölgesinden dört mikrondan daha fazla bir mesafede bulunduğundan yanlış hizalanmış olarak kabul edilir. Gen varyant fonksiyonunu değerlendirmek için hangi tahlilin uygun olduğunu seçerken, incelenen insan gen varyantlarının aşırı eksprese edildiğini ve endojen fare homologlarının aynı anda tüketilmesi gerekebileceğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, gen varyantının yumurta ve embriyo kalitesini nasıl etkilediğini ve bireyin üreme sağlığını etkileyip etkilemediğini anlamak gibi ek soruları yanıtlamak için insanlaştırılmış fare suşları oluşturmak için CRISPR-Cas9 gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, üreme genetiği alanındaki araştırmacıların, insanlarda maternal anöploidiye neden olan diğer nedensel faktörleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Gen tanımlama, güçlü teşhisler ve anöploidileri düzeltme çalışmaları için bir temel sağlayabilir.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.