Name: Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Keşfedin dönem plasentası fetal membranlarından primer insan desidual hücre izolasyon yöntemini. Bu teknik, yüksek verim ve canlılık sağlayarak gebelik komplikasyonları araştırmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu çalışmada kullanılan insan numuneler için bağış, RCWIH BioBank ve Mount Sinai Hastanesi/bunlar bölümü kadın doğum ve jinekoloji teşekkür etmek istiyorum. Küllü su Laboratuvarı, özellikle Dr. Caroline Dunk için onun yardım yöntemi geliştirilmesi ile üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Burroughs hoş geldiniz Fonu (grant #1013759) tarafından desteklenmektedir.

Placentae sağlıklı vadede değil seçmeli cesarean bölüm geçiren işçi kadınlar üzerinden toplanır. Toplama, işleme ve insan örnekleri tek kullanımlık Mount Sinai Hastanesi Etik Kurulu yönergeleri için uygun. Yazılı izni her hastadan elde edilir. Bu çalışmada, Mount Sinai Hastanesi araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlıkları
Not: Tüm adımları bir duman başlık altında yürütülen gerekir ve duman başlıklı yerleşim önce otoklav ile tüm cerrahi aletler sterilize edilmiştir. Tüm diğer malzemeler (şişeler, 50 mL tüpler, vb) % 70 etanol çözüm ile sterilize gerekir. Her zaman giyim kişisel koruyucu ekipman her zaman biyolojik atık (önlük, eldiven, uzun saç geri bağlı, vb) ile çalışırken.
<ol><li>
Enzimatik sindirim çözüm (nihai çözüm: 200 mL)
	<ol>
<li>HBSS - 180 mL pipet / - steril karıştırma mıknatıs 500 mL kabı ekleyin ve yer oda sıcaklığında plaka karıştırma.</li>
		<li>Tartmak ve şu HBSS-/-yavaş yavaş ve sırayla ekleyin: FBS, 20 mL 400 mg Collagenase 2 ([final] 2 mg/mL =), 20 mg soya fasulyesi tripsin inhibitörü ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg Dnaz 1 ([final] 0.15 mg/mL =) ve 200 mg BSA ([final] 1 mg/mL =)</li>
		<li>Karıştırma için Orta hızda ayarlayın ve 10-20 dk (kalay folyo veya parafin film süre karıştırma ile kapak) için karıştırın karışım izin verin.</li>
		<li>Karışık çözüm plastik huni kullanarak 250 mL cam şişe içine dökün ve duman mahallede yer.</li>
		<li>Bir plastik top filtrasyon ünitesi (0,22 mikron membran filtre, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL tüpler (10 tüpler toplam) ve mağaza-20 ° c kadar kullanım ile çözüme geçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 medya (çözüm ve % 10 tam büyüme orta yıkama %2)
	<ol>
<li>RPMI 1640 ve FBS duman başlıklı bir cam şişe içinde birleştirir.</li>
		<li>İçin % 2 FBS çözüm, 490 mL RPMI 1640 ve 10 mL FBS birleştirin.</li>
		<li>% 10 FBS çözüm için 450 mL RPMI 1640 ve 50 mL FBS birleştirir.</li>
		<li>500 mL cam şişe RPMI medya ve FBS (50 mg/mL stok, 0,05 mg/mL çalışma konsantrasyonu) içeren önceki adımdaki içine normocin 500 μL pipet.</li>
		<li>Medya aracılığıyla bir 0,22 mikron membran filtre ve mağaza 500 mL cam şişe 4 ° c kadar kullanmak geçirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>deneme, başlamadan önce 30 dk 20 mL aliquot, Enzimatik sindirim çözüm bir 37 ° C boncuk banyoda dondurulmuş koyun, %2 yer FBS ve 37 ° C boncuk banyo, % 10 FBS RPMI 1640 medyada üzerinde sallanan su banyosu açmak ve 37 ° C için ayarla , 2 g ve set 4 ° c sıcaklık kontrollü santrifüj</li>
</ol>2. dönem plasental zarlar Decidual doku toplanması
<ol><li>Yer HBSS ile şişe +/ +, HBSS-/- ve beş 50 mL tüpler bir rafa duman başlık altında. HBSS 25 mL pipet +/ + bir tüp.</li>
	<li>
Eldivenli ellerini kullanarak, terim plasenta ameliyathane tiyatro taşınmasında kullanılan kapsayıcı üzerinden çıkar. Plasenta bebek bezi pad (anne tarafı yukarı) yerleştirin ve makas ve forseps kullanarak fetal membranlar yayıldı.
	<ol>
<li>Üst üste gelen bebek bezi yastıkları duman kaputa yatıyordu.</li>
		<li>Böylece anne yan yüz kadar plasenta çevirmek için ayrı bir bez kullanın.</li>
		<li>Membran rüptürü nokta bulmak ve membran açılmak ve fumehood yüzeyinde yat izin vermek için insizyon olun. Not: bir kez membran plasenta geri çekilir, decidua koryon katmandaki arka amnion katmanında ile dinlenme kadar yüzü olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir plastik hücre kazıyıcı kullanarak dikkatlice kazımak koryon ve 25 mL HBSS içeren 50 mL tüp yerde kapalı decidual doku +/ +.</li>
	<li>Orta basınç ile membran kazı. Koryon kirlenme neden olabileceğinden çok baskı uygulamayın. Küçük kan pıhtıları yanı sıra, bu decidual bazı hücreler içeren toplamak. Dikkat: decidual toplandıktan sonra plasenta olmalı bir biohazard plastik depo gözünde paketlenmiş ve -20 ° C-dondurucu (göre kurumsal kurallarınızı) uygun bertaraf önce donup kalan ev. Kanlı bezi yastıkları mühür geçirmez plastik bir torbaya sarılmış ve biohazard kasa içinde bertaraf gerekir.</li>
</ol>3. yıkama ve Enzimatik sindirim Decidual doku
<ol><li>Yavaşça 50 mL tüp el sallayarak ve bir 250 Mikron metal elek (250 mikron, boyutu 60 mesh) steril numune (idrar) konteyner üzerinde dinlenme üzerinden geçen tarafından toplanan doku yıkayın.</li>
	<li>Yıkama HBSS ile iki kez tekrar +/ + ve iki kez ile HBSS-/ - her yıkama için taze tüpler. (final yıkar HBSS - ile /-kalsiyum ve magnezyum HBSS içinde mevcut kaldırılması için sağlar + / +, hangi aksi takdirde aşağıdaki Enzimatik sindirim işlemine engel). DİKKAT EDİN. Çamaşır adımları uyguladığınızda, koryon doku kirlenme decidual doku pembe renkte ışık ve amorf, koryon ise beyaz, yoğun ve lifli olduğu belli olacak. Bu nedenle, koryon kirlenme Forseps ile kolayca kaldırılabilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, decidual doku kalın ise, steril 10 cm Çap petri kabına aktarmak ve tabak içinde iki karşıt neşter ile dokusunun kıyma geçin.</li>
	<li>
Yıkanmış doku doku/mL Enzimatik sindirim çözeltisi 100 mg içeren steril 50 mL tüp içinde yer (hazırlıklar bakın).
	<ol>
<li>Bir referans noktası olarak decidual doku düzeyini 5-10 mL işareti 50 mL tüp ulaştığından emin olmak.</li>
		<li>Bütün dönem fetal membran toplanan toplam decidua sindirmek için yaklaşık 20 mL Enzimatik sindirim çözeltisi (hazırlanan adım 1.1) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parafin film ile tüpün kapağı kapatın (tüp sıkıca kapatın ve parafin film kapağı ve tüpün üst etrafında sarın) kültür altında hood ve titreyen bir su banyosu (145 rpm içinde 20 dk 37 ° C'de decidual doku kuluçkaya 2 g).</li>
	<li>Kuluçka sonra parafin film kaldırmak ve % 70 etanol ile sindirilir doku içeren boru yüzeyine sterilize ve duman başlık altında getir. Tüp kısaca el salla.</li>
	<li>Hücre süspansiyon metal elekten (250 mikron, boyutu 60 mesh) yeni bir steril numune konteyner içine toplamak. Bir eşit hacmi enzimatik reaksiyon durdurmak için RPMI + % 10 FBS kapsayan %0,1 normocin ile (20 mL) oranında seyreltin. Doğrudan Santrifüjü adıma 4.1 geçin.</li>
	<li>Gerekirse, 20 mL taze Enzimatik sindirim çözeltisi ile yeni bir 50 mL tüp içine geri kalan sindirilmemiş doku yerleştirin ve sindirim (20 dk, su banyosu sallayarak 37 ° C) tekrarlayın.</li>
	<li>İkinci bir sindirim gerekli ise, hücre süspansiyon ile ilk tüp buz (steril tutmaya parafin film ile kapak) yerleştirin. 3.5-3,6 adımı yineleyin ve iki hücre süspansiyonlar birleştirir.</li>
</ol>4. bir tek hücre süspansiyon oluşturma
<ol><li>Hücre süspansiyon (420 g, 4 ° C, 11 dk) santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve RPMI + %2 FBS içeren % 0,1 normocin ("yıkama tampon") 40 mL hücrelerde resuspend. Not: Hücre Pelet gevşek ve kırmızı kan hücresi kontaminasyon nedeniyle jelatinimsi, dikkatle süpernatant Aspire edin. El ile bir pipet ile üst aşama kaldırılması gerekebilir.</li>
	<li>Santrifüjü 420 g 4 ° c de 11 dk için yineleyin.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant (Not Adım 4.2 içinde belirtildiği gibi) kaldırın ve hücre Pelet yıkama arabellek 5 mL resuspend ve 35 mL eritrosit lizis arabellek aynı tüpte ekleyin. Not: Pelet büyük ya da çok kanlı ise, bu iki tüp eritrosit lizis adım için yıkama arabellek 10 mL ekleme ve eşit iki tüpler içine bölünüp her tüpün 35 mL eritrosit lizis arabelleği ekleyerek bölünebilir.</li>
	<li>20 dk. kısaca girdap tüpler başında ve sonunda, kırmızı kan hücreleri parçalayıcı kuluçka için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>4 ° C'de 11 dakika için 420 g, santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Dikkatle, süpernatant kaldırmak ve Pelet yıkama arabellek 40 mL resuspend.</li>
	<li>Hücreleri hücre kümeleri kaldırmak için 70 mikron naylon filtre geçmek.</li>
	<li>4 ° C'de 11 dk için 420 g, santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 10 mL tam orta resuspend (RPMI % 10 + %0,1 normocin içeren FBS).</li>
	<li>
Aşağıda açıklandığı gibi trypan mavi boya-dışlama hemasitometre yordamı kullanarak hücreleri saymak:
	<ol>
<li>Kültür başlık altında hafifçe yukarı ve aşağı 3 x hücre süspansiyon trypan mavi ile birleştirerek daha önce iyice karıştırın için pipet. Bir 1,5 mL tüp hazırlamak hücre süspansiyon, 1:2 (birleştirme 20 μL trypan mavi çözüm) ve decidual hücre süspansiyon, 20 μL seyreltilmiş. Dikkatle trypan mavi-hücre çözümü birkaç kez (Bu çözüm steril değildir) yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.</li>
		<li>Hemasitometre cam coverslip üstte mikroskopla sahne yerleştirin. Not: Bir mikroskop slaytta Izgaralar ile üçlü çizgi tarafından bölünmüş dokuz büyük kareler vermek için hemasitometre var. Her büyük kare 1 mm2lik bir alana sahiptir ve sıvı odasında derinliği 0.1 mm. Bu nedenle, her büyük kare doldurabilirsiniz sıvı hacmi 1 mm * 1 mm olan * 0,1 mm = 0.1 mm310-4 mL =.</li>
		<li>Yavaş yavaş trypan mavi-hücre karışımı 10 μL kılcal eylem hücre karışımı tüm slayta (karışımı de doldurur önce Durdur) dağıtmak için izin hemasitometre, oluk içine ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri (10 X büyütme), mikroskop altında görüntüleyebilir ve (bu hücrelerin vardır) trypan mavi hemasitometre dört büyük dış karelerinin içinde hariç tüm beyaz/yeşil hücreleri saymak. Yolun dokunma hücre sayım sırasında yalnızca sağ dokunma ve üst satırları ama değil, bu sol ve alt çizgiler dokunmadan sayısı. Koyu mavi hücreler sayılmaz; mavi renk trypan mavi boya kolayca plazma zarı ile sitoplazma nüfuz edebilir gibi hücre ölü olduğunu gösterir.</li>
		<li>1 ml hücre süspansiyon (X), hücrelerin sayısını hesaplamak için: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = seyreltme faktörü 10.000 dönüştürme faktörü = (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir arzu edilen son konsantrasyon RPMI + % 10 decidual hücrelere seyreltik FBS (büyüme orta). Not: doku kültürü kaplama, 2 * 106 hücreler/iyi pipet plastik bir 6-şey plaka, 10 * 106 hücre içine 10 cm plastik tabak veya cam coverslip için 75.000 hücre içine.</li>
</ol>

<ol><li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+SC+%22Decidualization+and+relevance+to+menstruation%22">Decidualization and relevance to menstruation</a>. , Cambridge University press. 187-212 (1990).</li>
<li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li>
<li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Implantation%3A+Biology+and+Clinical+Aspects%22%5BJournal%5D)">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li>
<li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+natural+killer+cells%3A+key+regulators+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li>
<li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li>
<li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cachectin%2Ftumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li>
<li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li>
<li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li>
<li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes%2C+decidua%2C+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li>
<li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li>
<li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor%3A+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39(2011).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour%5BTitle%5D)+AND+%22Reprodution+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li>
<li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+for+Gynecologic+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li>
<li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+term+and+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li>
<li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li>
<li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li>
<li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li>
<li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li>
<li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour%2C+both+term+and+preterm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Burada açıklanan protokol bir maliyet ve çok erişilebilir ve doğru sözlü birincil decidual hücreleri izole için etkili yöntem tüm insan dönem placentae fetal membranlar toplanan saat gösterir. Bu protokol iki kritik faktörler, (1) decidual (2) ile decidual hücreler boyunca protokolünün işlenme bakım ve fetal membranlar koryon katmanından kazıma verimliliğini bağımlı bir başarıdır. Koryon doku kirlenme yok decidual kazıma sırasında ve belirlenmesi ve herhangi bir kirlenme çamaşır adımları (farkı decidua ve koryon Morfoloj...

Endometrium, biri en aktif yetişkin kadın dokuları, dramatik yumurtalık hormonlar, (E2) östrojen ve progesteron (P4) tarafından yanıt olarak uyarılması her adet döngüsü remodeling uğrar. Decidua olarak da bilinen hamile endometrium, P4 tahrik farklılaşma E2-baskın proliferatif faz takip sonucunda postovulatory aşamasının sonunda oluşan kritik düzeyde önemli bir üreme dokudur. Hormonal faktörler başarılı blastosist implantasyon ve fetal homogreft anne tolerans korumak için rahim plasental arayüzü geliştirilmesi salgılanmasını sorumlu decidual hücrelerdir.
Decidualization implantasyon ve sonraki decidual sarmal damarların remodeling için gereklidir. Endometrium stromal hücreler decidualization P4 ve kamp, kontrol altında geç luteal faz1adet döngüsü sırasında tabi. Bu işlem kan damarları ve damarlara yenileme ve düzenleme kaçakçılığı lökosit rolü düşündüren stroma boyunca yayılır çevresinde başlatılır. Bu hücresel dönüşüm dairesel Morfoloji, artan nükleer boyutu ve kaba endoplazmik retikulum ve Golgi aygıtı2genişleme ile karakterizedir. Decidualized stromal hücreler blastosist implantasyon desteklemek parakrin faktörler üretebilen ve çok sayıda hormonlar (Yani prolaktin), anjiogenik büyüme faktörleri, insülin büyüme faktörü bağlayıcı protein-1 salgılanmasını tarafından karakterize (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (hücre içi kampın uyarıcı), sitokinler, hücre dışı matriks bileşenleri ve gerekli besinlerden plasental implantasyon ve geliştirme3,4,5için,6 .
Decidual hücre nüfus yalnızca decidualized stromal hücreler oluşur değil ama büyük, gebelik özgü decidual lökosit nüfus da içerir. Decidualization geçici lokalize ödem ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, T-hücreleri, dendritik hücreleri ve makrofajlar akını içerir. En büyük lökosit subpopulation tüm maternal lökosit Infiltrating sitokinler kaynağı olan decidua ve decidualization sürecinde yardım ve artış anjiogenik faktörler yaklaşık % 50-70 oluşan rahim NK hücreleri olduğunu gebelik7boyunca numarası. Makrofajlar, bağışıklık hücreleri, ikinci büyük subpopulation olmak ve gebelik8sırasında artış implantasyon site içinde bulundu. Onlar sitokinler kaynağıdır ve büyüme faktörleri gibi koloni uyarıcı faktör (CSF-1)9, tümör nekrozis faktör α (TNFα)10 ve prostaglandin (SY) E11.
Hamilelik boyunca ve terim emek önce decidua sitokinler ve kemokinler sorumlu anne periferik lökosit harekete geçirmek ve emek başlatmak için rahim dokuların içine sonraki geçiş için büyük bir kaynaktır. Hayvan çalışmaları gösterdi kadar fare decidua içinde düzenlenir, çok sayıda pro-inflamatuar sitokinlerin doğum sırasında gibi TNF-a, Il-6, IL-12 ve IL-1b12. İçinde insan decidua, pro-inflamatuar sitokinlerin IL-1b, Il-6 ve Il-8 (büyük nötrofil chemoattractant) sırasında emek değil emek13' te kıyasla daha yüksek ifade sergi. Bunlar salgılanan sitokinler sonuç bir harekete geçirmek ve lökosit akını decidual dokular14; decidual makrofaj ve nötrofil infiltrasyon her iki insan ve fare bir artış decidual infiltrasyon myometrial 4'e katlanmış büyük bir çağlayan bu iki bitişik rahim dokulara arasında etkinleştirme gösteren önceki dönem doğum sırasında görülür 15. bunlar lökosit infiltre PGs myometrium16eşzamanlı kasılmaları aktive yeteneğine sahip üretmek, membran başlatmak için matriks metalloproteinazların (MMPs) rüptürü17,18, hem de pro-inflamatuar sitokinlerin rahim etkinleştirme işlemi ('sitokin fırtına') yükseltmek için.
Decidual hücrelerinin, erken gebelik ve terim, vasıl belgili tanımlık harekete geçirmek-emek katılan maternal-fetal tolerans Bakımı implantasyon sürecinde kritik bir rol oynuyor gibi birçok önemli işlevleri nedeniyle farklı patolojileri sırasında ortaya çıkabilir gebelik. Örneğin, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı ve tekrarlayan gebelik kaybı nedeniyle (1) infertilite decidual olgunlaşma hatasından kaynaklanabilir; (2) intrauterin büyüme kısıtlama (IUGR) ve preeklampsi uygunsuz geliştirme ve decidua/plasenta veya decidual myometrial kavşağında güvenliği aşılan vasküler dönüştürme işlev bozukluğu nedeniyle; (3) erken doğum yanı sıra hangi erken decidual aktivasyon neden olabilir.
İnsan in vivo çalışmalar, etik ve pratik sınırlamalar ile birleştiğinde bu önemli bozuklukların ışığında birincil insan decidual hücre hatları kurulması vitro analiz amacı ile daha iyi anlaşılması için gerekli olan ve gebelik komplikasyonları klinik yönetiminin iyileştirilmesi. Bu nedenle, bizim araştırma amacı insan birincil decidual hücreleri yüksek hücre verim ve dönem placentae fetal membranlar toplanan canlılığı ile yalıtım için izin veren bir protokol geliştirmekti. Decidual, belirli alt türlerinden yalıtma hangi hücreleri için bu geçerli protokol açıkça bir zaman ve cost effective yöntemi açıklanır var olmak kullanılmış için a değişiklik-in vitro analizler. Bereket karakterizasyonu ve fenotip terim ve karşılaştırma birinci veya ikinci üç aylık dönem için decidual alt nüfusun insan gebelik boyunca onların rolleri tanımlama için önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Hank' Kalsiyum ve magnezyum içeren dengeli tuz çözeltisi</td><td>Tesiste hazırlanır (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' Kalsiyum ve magnezyum içermeyen dengeli tuz çözeltisi</td><td>Tesiste hazırlanmıştır (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bebek bezi pedleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Büyük cerrahi makas</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Büyük cerrahi forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tek kullanımlık hücre sıyırıcı (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (boyut 60 gözenek) metal elek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Plastik saplı tek kullanımlık neşter (# 21)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Steril plastik petri kabı (çap 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Steril numune kabı (idrar kabı, 4,5 oz)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Naylon filtre (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Eritrosit lizis tamponu</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi,% 0.4 çözelti</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 kültür ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastik üst filtrasyon ünitesi (0,22 mm membran, 500 mL)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz 2, liyofilize toz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü, toz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNaz tozu</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA tozu)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>İplik diski konfokal mikroskop - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Akış sitometresi - Görüntü Akışı MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA yazılımı</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC konjuge Vimentin antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>APC H7-konjuge CD45 antikoru</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjuge Sitokeratin antikoru</td><td>MACs Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP konjuge Sitokeratin 7 antikoru</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Sabitlenebilir Canlılık boyası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin birincil antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 birincil antikoru</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Sitokeratin birincil antikoru</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Sitokeratin 7 birincil antikoru</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Keçi IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ikincil antikor</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

dönem placentae fetal membranlar birincil insan decidual hücre izolasyon

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Decidua olarak da bilinen hamile endometrium, kritik düzeyde önemli bir üreme dokudur. Decidual hücreleri, esas olarak decidualized stromal hücreler ve bağışıklık hücreleri, oluşan salgısı ve hormonal ve inflamatuar faktörlerin hangi başarılı blastosist implantasyonu, plasental gelişimi için kritik olan ve bir rol oynamak için sorumlu term ve preterm emek başlangıcında. Birçok gebelik komplikasyonları farklı hücre popülasyonlarının decidua oluşan ince bir denge tedirginlikler ortaya çıkabilir. Belirli decidual hücre tipleri oranındaki değişikliklere çok önemli bu işlemler bozabilir ve gebeliğin embriyo implantasyonu başarısız, intrauterin büyüme kısıtlama, preeklampsi gibi ciddi komplikasyonlar riskini artırmak ve Preterm emek. Burada özetlenen protokolü bir maliyet ve zaman birincil insan decidual hücrelerin izolasyonu için etkili yöntem dönem placentae fetal membranlar toplanan gösterir. Enzimatik sindirim ve decidual doku nazik mekanik bozulma birleştirerek, yüksek verim decidual hücre hemen hemen hiçbir koryon kirlenme ile elde edildi. Önemlisi, izole decidual hücreleri ile karakterize (stromal hücreler (55-%60), lökosit (% 35), epitel (% 1) veya (% 0.01) Trofoblast hücreleri) ve çok renkli görüntüleme Akış Sitometresi tahlil tarafından doğrulandı yüksek canlılık (% 80) yapılmaktadır. Bu iletişim kuralı için decidua parietalis belirli ve birinci ve ikinci üç aylık placentae için adapte edilebilir. Bir zamanlar decidual hücreler farklı decidual hücre alt nüfus içinde gebelik komplikasyonları rolünü anlamak amaçlayan deneysel uygulamalar için kullanılabilir.

Verimlilik ve izole hücre canlılığı doğrulamak için onlar iki yöntemlerle karakterize: Akış Sitometresi ve immunocytochemistry (ICC). 4 hücre popülasyonlarının hedef; pan-lökosit marker CD45 decidual bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanılan, cytokeratin epitel/endotel hücreleri algılamak için kullanılan ve son olarak, cytokeratin 7 herhangi algılamak için kullanılan decidualized stromal hücreler anti-vimentin antikor tarafından algılandı potansiyel Trofoblast (koryon veya plasenta)...

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Bu hücre izolasyon protokolünün genel amacı, yüksek verimli son hücre canlılığına sahip birincil yaprak döken hücreleri izole etmek için bir yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, blastosist implantasyonunda yaprak döken rolü ve doğumun başlatılması gibi insan üremesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca hamilelikle ilgili çeşitli patolojiler hakkında bilgi sağlayabilir.Bu tekniğin temel avantajı, yüksek canlılık son verimine sahip birincil yaprak döken hücrelerin izolasyonu için zaman ve maliyet etkin bir yöntem sağlamasıdır. Başlamak için, bir rafta beş adet 50 mililitrelik tüp ve çeker ocakta iki şişe HBSS ve HBSS bırakın. Daha sonra uygun şekilde etiketlenmiş tüpe 25 mililitre HBSS pipetleyin.Ardından, üst üste binen çocuk bezlerini davlumbazın içine yerleştirin. Daha sonra plasenta terimini kaptan çıkarın ve çeker ocak içine yerleştirin. Plasentayı, anne tarafı yukarı bakacak şekilde bebek bezi pedinin üzerine yerleştirin.Plasenta anne tarafı aşağı bakacak şekilde, plasentayı çevirmek için ek bir bebek bezi kullanın. Membran yırtılma noktasını arayın ve membranın açılmasına ve davlumbaz yüzeyinde düz bir şekilde durmasına izin vermek için makas ve forseps kullanarak kesiler yapın. Ardından, yaprak döken dokuyu koryondan nazikçe sıyırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.Dokuyu 25 mililitre HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın Ayrıca küçük kan pıhtılarını da toplamayı unutmayın, çünkü bunlar ayrıca bazı yaprak döken hücreler içerir. Toplanan dokuyu yıkamak için 50 mililitrelik tüpü hafifçe sallayın, ardından dokuyu 250 mikrometrelik metal bir elekten geçirin. Yıkama işlemini HBSS ile iki kez tekrarlayın, ardından taze tüplerde HBSS ile iki yıkama yapın.Koryon kontaminasyonu, iplik benzeri şekli ve daha açık rengi nedeniyle kolayca görülebilir ve yıkandıktan sonra çıkarılabilir. Yıkadıktan sonra, dokuyu 20 mililitre enzimatik sindirim solüsyonu içeren steril 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve tüm fetal membran teriminden elde edilen tüm desiduayı sindirin. Tüpün kapağını kapatmak için parafin film kullanın.Daha sonra tüpü çalkalanan bir su banyosunda 37 santigrat derecede inkübe edin. Zamanlayıcıyı 20 dakikaya ayarlayın. Kuluçka bittiğinde parafin filmini çıkarın.Sindirilmiş dokuyu içeren tüpün yüzeyini sterilize etmek için %70 etanol kullanın ve çeker ocak altına yerleştirin. Tüpü kısa bir süre çalkalayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu metal bir elekten geçirerek yeni bir steril numune kabına geçirin.Enzimatik reaksiyonu durdurmak için hücre süspansiyonunu eşit hacimde bir kültür ortamı ile seyreltin. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri 420 G'de dört santigrat derecede 11 dakika santrifüjleyin.Gerekirse, kalan sindirilmemiş dokuyu 20 mililitre taze enzimatik sindirim solüsyonu içeren 50 mililitrelik yeni bir tüpe koyun ve sindirim işlemini tekrarlayın. Sindirim ikinci kez yapılırsa, hücre süspansiyonu ile ilk tüpü buz üzerinde bırakın. İkinci sindirim tamamlandığında, her iki hücre süspansiyonunu birleştirin.Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin. Süpernatanı çıkarmak için manuel bir pipet gerekebilir. Daha sonra, hücre peletini yıkama tamponunda yeniden askıya alın.Hücreleri yıkadıktan sonra santrifüj işlemini tekrarlayın. Santrifüjleme işleminin sonunda, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini beş mililitre yıkama tamponu ve 35 mililitre eritrosit lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için, inkübasyonun başında ve sonunda tüpü kısaca girdaplayın.Ardından, hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı aspire edin ve peleti 40 mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin, ardından hücre kümelerini dışlamak için hücreleri 70 mikrometrelik bir naylon filtreden geçirin.Santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Santrifüjleme yapıldıktan sonra süpernatanı aspire edin. Daha sonra hücre peletini 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin.Tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak bir hemositometre ile hücre sayısını sayın. Desidual hücre popülasyonunun hücre tipi bileşimini belirlemek için, çok renkli bir görüntüleme akışı sitometrisi geçit stratejisi geliştirilmiştir. Analiz, seri geçit kullanılarak hücre çiftlerinin ve hücre kalıntılarının dışlandığını gösterir.Kalıntı içermeyen tek hücre popülasyonu elde edildikten sonra, hücre canlılığı, sabitlenebilir bir canlılık boyası kullanılarak belirlenir. Analiz, mavi geçit ile gösterilen toplam yaprak döken hücre popülasyonunun% 80 canlılığını göstermektedir. Daha sonra, izole edilen yaprak döken hücreler, florofor konjuge fare monoklonal antikorları ile boyanır.Bu, stromal, immün, epitel ve trofoblast hücre belirteçlerinin varlığını ve canlılık boyasını analiz etmek içindir. Bu belirteçler yaprak döken hücre tiplerini belirleyecektir. Akış sitometrisi floresan görüntüleri, dört belirteç ve canlılık boyasının tümü için pozitif olarak boyanmış bir hücreyi gösterir.Bu belirteçler daha sonra yaprak döken hücre popülasyonundaki her bir hücre tipinin yüzdesini belirlemek için kullanılır. İlginç bir şekilde, Vimentin pozitif stromal hücreler en yüksek hücre popülasyonunu oluştururken, hemen hemen hiç trofoblast hücresi yoktur. Bu sonuçlar, izole edilmiş birincil insan yaprak döken hücrelerin saflığını ve yüksek canlılığını göstermektedir.Burada, elde edilen nokta grafikleri, pozitif hücre tipi popülasyonları için geçiti göstermektedir. Floresan eksi bir kontrol, gerçek pozitif yaprak döken hücre popülasyonlarını doğru bir şekilde kapılamak için kullanılır. Daha sonra, yakalanan eğirme diski konfokal mikroskopi görüntüleri, yaprak döken hücre popülasyonunun esas olarak trofoblast hücre kontaminasyonu olmayan Vimentin pozitif stromal hücrelerden oluştuğunu göstererek akış sitometrik sonuçlarını doğrulamak için kullanılır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, yaprak döken hücreler, gen ve protein ekspresyonunu incelemek için çeşitli şekillerde analiz edilebilir, bu da gebelik komplikasyonlarında meydana gelen hücresel değişiklikleri daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir.

isolation-primary-human-decidual-cells-from-fetal-membranes-term

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) yönergelerine uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanarak insan amnion epitel hücrelerini (hAEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Burada açıklanan, insan maternal-fetal arayüzü olan decidua basalis ve decidua parietalis'in sızan lökositlerini izole etmek ve daha fazla incelemek için bir protokoldür. Bu protokol, hücre yüzeyi belirteçlerinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi ile kanıtlandığı gibi aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Burada açıklanan, farelerin maternal-fetal arayüzündeki (uterus, desidua ve plasenta) dokuların sızan lökositlerini izole etmek ve analiz etmek için bir protokoldür. Bu protokol, çoğu hücre yüzeyi işaretleyicisinin bütünlüğünü korur ve akış sitometrisi analizi de dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yeterli canlı hücre verir.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Bu yazıda izolasyon ve bu dokulardan mezenkimal kök / stromal hücreler (MSC) genişlemesi, ardından insan terim plasenta, fetal ve maternal dokuların diseksiyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Bu çalışmada yalıtım ve kültür vitro decidualization tahlil yapmak için insan endometrium stromal hücre için doğrulanmış ve en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar. Ayrıca, bu çalışmada çift insan endometrium stromal hücreler kullanarak belirli bir gen için verimli bir şekilde devirme detaylı bir yöntem sağlar.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

Keşfedin dönem plasentası fetal membranlarından primer insan desidual hücre izolasyon yöntemini. Bu teknik, yüksek verim ve canlılık sağlayarak gebelik komplikasyonları araştırmalarına olanak tanır.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Daha fazla video keşfet