Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Bu yöntem, pulmoner bakım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin hastane kaynaklı pnömoniden kurtulan hastaların neden bu kadar kötü uzun vadeli sonuçları var? Bu yöntemin avantajı, basit ve güvenilir olmasıdır, bu da laboratuvara gelen herkese öğretilebileceği ve ertesi gün yararlı ve tekrarlanabilir veriler üretebilecekleri anlamına gelir. Bu analitik yöntemler, kültürlenmiş hücrelerin in vitro enfeksiyonu hakkında bilgi sağlamak için uygulanabilse de, hayvan modellerine ve insan hastalara da uygulanabilir.

Sitotoksik süpernatan üretmek için, 150 santimetrelik bir endotel hücresi tabağını HBSS ile yıkayın ve bir P.aeruginosa kolonisini 540 nanometrede 0.25'lik bir absorbansa seyreltin. Bakteri hücrelerini daha da seyreltin, böylece 20 mililitre HBSS'de 20 ila bir enfeksiyon çoğalmasına izin verin ve bakterileri endotel hücrelerinin plakasına tohumlayın. Daha sonra enfekte olmuş hücreleri dört ila beş saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.

Bakterilerin ve endotel hücrelerinin inkübasyonunun uygun bir süre boyunca gerçekleşmesi esastır. Kuluçka çok kısaysa, amiloidler süpernatanın içine salınmayacaktır. Kuluçka çok uzunsa, hücreler aslında parçalanacak ve tüm içeriklerini süpernatana bırakacaktır.

Uygun bir inkübasyon süresi için kullandığımız gösterge, endotel tek tabakasında boşlukların oluşmasıdır. Işık mikroskobu ile hücre tek tabakasında boşluklar gözlemlenebildiğinde, herhangi bir hücresel kalıntıyı gidermek için süpernatanı santrifüjleme için hasat edin. Süpernatanı 0.2 mikron filtre ile donatılmış bir şırıngaya boşaltın ve kirletici bakterileri gidermek için süpernatanı filtreden geçirin.

Daha sonra sitotoksisite testi için 1,5 mililitre steril süpernatan ayırın ve numunenin geri kalanını eksi 80 santigrat derecede dondurun. Hasat edilen süpernatantın sitotoksisitesini değerlendirmek için, 1.5 mililitrelik filtre sterilize edilmiş süpernatanı, birleşik bir pulmoner mikrovasküler endotel hücre kültürü içeren altı oyuklu bir plakanın tek bir oyuğuna ekleyin. Plakayı 21 ila 24 saat boyunca bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.

Daha sonra tedavi edilen bölgelerin görüntülerini elde edin ve kültürleri kontrol edin. Görüntüleri özel bir imagej makrosuna aktarın ve kontrastı %15 doymuş piksellere ayarlayın. Kontrastı ayarlanmış görüntüleri çoğaltın ve hem bozulmamış hücrelerin hem de görüş alanı içindeki boşluk alanının yüksek kontrastlı görüntülerini elde etmek için arka planı çıkar'ı kullanın.

Bu yüksek kontrastlı görüntüyü orijinal görüntüden çıkarın ve elde edilen görüntüyü orijinal görüntüyle birleştirmek için görüntü hesaplayıcıyı ve işlevi kullanın. Birleştirilmiş görüntüyü, boşlukları siyah ve bozulmamış hücreleri beyaz olan bir maskeye dönüştürmek için eşik işlevini kullanın. Ve görüntüdeki herhangi bir gürültüyü gidermek için ikili aşındırma işlevini kullanın.

Ardından, elde edilen görüntüdeki siyah piksellerin beyaza oranını ölçmek için alan kesrini kullanın. Ve her bir tedavi zaman noktası için kesirli alanları, maksimum boşluk alanının yüzdesi olarak çizin ve ifade edin. Süpernatan içindeki amiloidleri ölçmek için, bir mililitrelik spektrofotometre küvetinde bir mililitre PBS'ye 20 mikrolitre taze hazırlanmış ve filtrelenmiş 50X thioflavin T stok çözeltisi ekleyin ve seyreltilmiş numuneyi bir spektroflorometreye yükleyin.

425 nanometre uyarma kullanarak temel floresan emisyonunu ölçün. Floresan emisyonunun 450 ila 575 nanometre arasında iki nanometrelik artışlarla taranması. Ardından cihazı, 60 saniye boyunca her 0,2 saniyede bir veri toplama ile 425 nanometre uyarma ve 482 nanometre emisyon kullanarak hızlandırılmış bir tarama gerçekleştirecek şekilde ayarlayın.

20 saniye sonra taramayı duraklatın ve küvete 10 mikrolitre filtre sterilize süpernatan yapın. Ters çevirerek karıştırdıktan sonra, küveti spektroflorometreye yeniden yükleyin ve son 40 saniye boyunca zamana dayalı taramaya devam edin. Zaman atlamalı çekimin tamamlanmasının ardından, orijinal tarama ayarlarını kullanarak son bir floresan emisyon spektrumu taraması gerçekleştirin.

Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin birleşen katmanlarına P. aeruginosa eklenmesi, hücreler arasında boşluk oluşumuna neden olur. Tedavinin ilk 12 saatinde gösterildiği gibi süpernatan sitotoksisiteyi değerlendirmek için imagej kullanılarak, hala sağlıklı birleşik hücre tek katmanları, mikroskobik alan içindeki tüm beyaz bölgeler olarak görselleştirilebilir. Bununla birlikte, PA 103 ile enfekte olmuş kültürlerden toplanan süpernatantın eklenmesinden 18 saat sonra, tek tabakadaki boşluklar, 36 saatlik tedaviye kadar doğrusal bir şekilde artan hücrelerden yoksun kültür kabı alanı ile tespit edilebilir, bu noktada neredeyse hiç sağlam hücre gözlenemez.

Sitotoksisitenin bir belirteci olarak laktat dehidrojenaz salınımı kullanılarak benzer sonuçlar elde edilebilir. Laktat dehidrojenaz ile ilk olarak sitotoksik süpernatantın eklenmesinden 18 saat sonra tespit edilir ve maksimum hücre öldürme 36 saatte ölçülene kadar doğrusal bir şekilde artar. Süpernatanlar ayrıca immünoblot analizi ile veya süpernatanlarda sitotoksik amiloidlerin varlığını belirlemek için amiloid bağlanmasının neden olduğu doğrulayıcı değişikliklere bağlı tioflavin T floresan yoğunluğundaki değişikliğin ölçülmesiyle de değerlendirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, endotel hücrelerinin sitomonsis aeruginosa ile enfeksiyonunu takiben sitotoksik süpernatanların nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ek olarak, bu süpernatanlarda bulunan sitotoksinleri karakterize etmek ve analiz etmek için gereken tahlil türleri konusunda bilgili olmalısınız.