Name: Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Öğrenin, Pseudomonas aeruginosa ile akciğer endotel hücrelerinde sitotoksik amiloid üretimini incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem. Bu protokol, hastane kökenli pnömoni sonrası kötü uzun dönem sonuçların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma bölümlerinde NIH hibe HL66299 TH, RB ve SL, HL60024 TS ve MF HL136869 tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan yordamları incelendi ve kurumsal ve hayvan bakımı Komitesi South Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmış ve tüm federal, eyalet ve yerel düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Sıçan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVECs) birincil kültürleri akciğer biyoloji için University of South Alabama'nın merkezi hücre kültür çekirdek tesisinden elde edilmiştir. Hücre yukarıda açıklanan yordamları16kullanılarak hazırlanmıştır.
1. nesil sitotoksik Supernatants
Not: Burada, P. aeruginosaiki farklı soyu kullanırız: ekzoenzimlerden ExoU ve ExoT enfeksiyon ve ∆PcrV, bir tür III salgı sistemi yoksun ve sırasında hedef hücrelere aktarma yetenekli bir bozulmamış türü III salgı sistemi olan PA103 ekzoenzimlerden aşı takip hedef hücrelere aktarma aciz.
<ol><li>Bakteri Vogel-Bonner (VB) ağar kaplamalar17 üzerine çizgi ve 37 ° C'de gecede büyümek<ol>
<li>Tabak hazırlamak için aşağıdaki hisse senedi çözüm (Vogel-Bonner tuzları; 10 x hisse senedi) olun: ölçmek 2 g MgSO4, 20 g sitrik asit (ücretsiz), 100 g K2PO4ve 35 g NaH2PO4. GKD2O 1 L ve basınçlı kap 15dk yavaş egzoz ile için ekleyin.</li>
		<li>450 mL GKD2O 7.5 g agar ve yukarıdaki gibi basınçlı kap koyun.</li>
		<li>Isıyla her iki çözüm de soğutmak için 50 ° C su banyosu yerleştirin.</li>
		<li>10 x VB hisse senedi tuz solüsyonu 50 mL agar için ekleyin.</li>
		<li>Carbenicillin 400 µg/ml (için kullanılan P. aeruginosa suşlarının) ve de şişeye dönen tarafından karıştırın.</li>
		<li>Bireysel steril kültür yemekleri, VB agar çözümde yer 5 mL agar kuvvetlendirmek ve 4 ° C'de bakteriyel tohum güne kadar saklamak izin verir.</li>
		<li>Bakteriyel tohum gün, önceden bir tabak 37 ° c sıcak ve bakteri steril bir döngü kullanarak plaka üzerine çizgi. Yer 37 ° C kuluçka plaka bir gecede.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pozitif floresan griffona simplicifolia ile boyama tarafından PMVEC saflık doğrulayın lektin ve floresan ile negatif boyama Helix pomatia lektin (arteriyel endotelyal hücreler için bir işaretleyici). Aliquot hücreleri ve sıvı azot dondurucuda.</li>
	<li>Deneyler için hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş DMEM) korumak ve hücreleri içeren % 5 CO237 ° C kuluçka büyür. Hücreleri pasajlar 5-15 kullanın.<ol>
<li>Sitotoksik supernatants nesil, 2 x 106 hücreler bireysel 150 cm yemekleri plaka ve 3-4 gün için izdiham elde kadar büyür. Deney (aşağıya bakın) başına iki tabak kullanın.</li>
		<li>Sitotoksik supernatants çözümlenmesi için plaka 1 x 105 6-iyi bireysel kuyu hücrelere çanağı ve dört gün izdiham elde kadar büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant üretmek için bir PMVECs iki 150 cm yemekleri adım 1.3.1 fosfat tamponlu tuz ile yıkama, trypsinize ve sonra hücreleri saymak (Biz bir otomatik hücre sayacını kullanın ve üreticinin iletişim kuralı izleyin; Tablo reçetesibakın). PMVECs ile Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) diğer bulaşık yıkama ve P. aeruginosa enfeksiyon (MOI) 20:1 çokluğu, ya suşu ile enfekte. Bu şekilde elde edilir:<ol>
<li>P. aeruginosaiçin OD540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL. Bu seyreltme hazırlamak için 1 mL tek kullanımlık küvet 1 mL HBSS ekleyin. Yeterince bakteri 0,25 OD540 bir spektrofotometre kullanarak ölçülen zaman elde edilir kadar 1.1 adımda hazırlanan tabak kapalı kazımak. Bir sonraki adım ne kadar bakteri gerekli olacak bir hesaplama sağlar.</li>
		<li>PMVECs kültür tabağına sayısı belirlendikten sonra (1.4 yukarıdaki adım), bakteri PMVECs içeren ikinci, Sigara trypsinized kültür yemek için eklenecek uygun sayısını belirleyin. Örneğin, PMVECs kültür tabak 1.3 x 107 hücreleri içeren, sonra 1.3 x 107 hücreleri x 20 bakteri/hücre x 1 mL/2 x 108 CFUs hazırlamak belirlediyseniz 1.3 mL bakteri =.</li>
		<li>150 cm çanak tüm yüzeyine sıvıyla kaplı, sonra seyreltilmiş bakteri PMVECs plakasına eklemek bakterilerin 1.3 mL HBSS 20 mL, son bir birime oranında seyreltin.</li>
		<li>Kuluçkaya boşluklar plaka olarak gözlenen hücre monolayer şekillendirme görülebilir kadar % 5 CO2 kuluçka için 4-5 h, 37 ° C'de bakteri ile aşılanmış PMVECs (bkz: Şekil 1 uygun düzeyde boşluk oluşumu için).</li>
		<li>Süpernatant toplamak sonra hücresel enkaz kaldırmak için masa üstü bir santrifüj 2.000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi. Not: Herhangi bir masa üstü santrifüj üreten yeterli G'lik zorla unlysed hücreleri ve büyük hücreli parçaları-ebilmek var olmak kullanılmış için bu adımı cips için.</li>
		<li>Süpernatant süpernatant bakteri kaldırmak için filtreden geçmek sonuna, sonra bağlı 0.2 µm filtresi olan bir şırınga içine dökün.</li>
		<li>Bir aliquot, steril süpernatant sitotoksisite sınamak için kullanın (bkz. 2.1) ve kalanı süpernatant ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sitotoksik Supernatants Analizi
<ol><li>Sitotoksisite tahlil<ol>
<li>6-iyi yemekler PMVECs izdiham kadar büyür. Yıkama wells bir kez HBSS ile daha sonra 1,5 mL (ya PA103 ya da ∆PcrV aşısını hücrelerden toplanan) filtre sterilize süpernatant bireysel wells için ekleyin. Steril HBSS başka bir şey için bir negatif kontrol ekleyin.</li>
		<li>21-24 h CO2 kuluçka plaka yerleştirin, sonra hücre öldürme/sitotoksisite için gözlemlemek (sonraki adıma bakın). Sitotoksisite daha fazla deneme için sergi supernatants kullanın ve bu da hücre öldürme gösterme atın.</li>
		<li>Hücre öldürme Nefelometri<ol>
<li>Ölçü laktat dehidrogenaz (karaciğer) serbest piyasada bulunan karaciğer tahlil kitleri ve üretici kullanarak ölü hücrelerden yordamlar önerilir.</li>
			<li>Alternatif olarak, hücre öldürme mikroskobik ImageJ yazılımını kullanarak ölçmek. Bunun için kayıt mikroskobik görüntüleri ve sağlam hücreleri içeren kültür yemek alanları, sonra hücreler (hücre ölümü bir monolayer gösterge) eksik bölgelerin ölçmek özel bir ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) makro (bkz: ek kodlama dosya kullanarak ). İsterseniz, el ile aşağıdaki gibi makro adımları izleyin:<ol>
<li>Görüntüleri (RGB veya TIFF biçiminde) makro girdi ve doymuş % 15 piksel için karşıtlığı ayarlayın. Kontrast-düzeltilir görüntüleri çoğaltın ve hücre ve gap alanı görüş alanı içinde yüksek karşıtlık görüntüsünü elde etmek için "arka plan çıkarmak" komutunu gerçekleştirir.</li>
				<li>Bu görüntü orijinal görüntüden çıkarma ve ortaya çıkan görüntü görüntü hesap makinesi "Ve" işlevi kullanarak orijinal görüntü ile birleştirir. Siyah (boşluk) ve beyaz (hücreler) maskesi ile eşik görev (en az 0, en çok 5) sonuç görüntü dönüştürmek ve gürültü yansımadan kaldırmak için "ikili aşındırmak" işlevini kullanın.</li>
				<li>Siyah beyaz piksel "alan kesir" ölçüm kullanarak sonuç görüntü içinde için oranını ölçmek. Arsa ve kesirli alanlar her tedavi süresi noktası için maksimal gap alanının yüzde ifade eder.</li>
				<li>Anlamına gelir hesaplamak ve Tukey'nın öğleden hoc testi, p değerleri anlamlı kabul 0,05 daha az ile tek yönlü ANOVA kullanarak karşılaştırın.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>İmmunoblot analiz varlığı amiloid, oligomeric tau ve Aβ kültür supernatants kurmak için kullanın. Kültür supernatants en az 10 kat Elektroforez önce konsantre dışında standart prosedürler10,11,12, kullanan immunoblot çözümlemesi gerçekleştirin.<ol>
<li>Süpernatant konsantre için 1-2 mL süpernatant olan membran 10 kDa molekül ağırlığı cut-off vardır Santrifüjü filtre ünitesi yerleştirin. Filtre ünitenin görüntülenmemesini bir masa üstü santrifüj ve santrifüj 2.000 x konsantrasyon gerekli derecesine kadar g (genellikle 45-60 dakika) elde.</li>
			<li>Konsantre süpernatant11 protein miktarını belirlemek ve örnekleri eşit miktarda jel bireysel kuyu yükleyin.</li>
			<li>Jelleri çalıştırmak, proteinler nitroselüloz için daha sonra A11 Anti-amiloid antikor, T22 Anti-oligomeric tau antikor veya uygun ikincil antikorlar tarafından takip MOAB2 anti-Aβ antikor lekesi sonda. Standart Kemiluminesan yordamları kullanarak lekesi geliştirmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir thioflavin T tahlil yapmak için supernatants içinde amyloids ölçmek için thioflavin T Floresan (ThT) kullanın. Bu ölçümler için filtre sterilize supernatants kullanın.<ol>
<li>Thioflavin T stok çözeltisi (50 x) 8 mg thioflavin T (ThT) askıya tarafından 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlamak. Karıştırma sonra çözüm parçacıklar kaldırmak için 0,22 µm filtre ile filtre.</li>
			<li>Ölçümler için PBS 1 mL spektrofotometre küvet içinde 1 mL 20 µL ThT stokunun ekleyin. Seyreltilmiş örnek bir spectrofluorimeter yerleştirin.</li>
			<li>425 nm uyarma kullanarak ve floresan emisyon 450-575 nm 2 nm aralıklarla üzerinden tarama temel floresans emisyon ölçmek.</li>
			<li>425 nm uyarma kullanarak zaman atlama tarama gerçekleştirmek ve verileri ile 482 nm Emisyon elde her 0,2 s 60 s.</li>
			<li>İlk 20 s zaman atlama tarama ölçer floresans boş küvet içinde. 20 s, tarama duraklatmak ve filtre sterilize süpernatant ile 10 µL küvet için ekleyin. Küvet INVERSION tarafından karıştırın ve geri spectrofluorimeter yerleştirin.</li>
			<li>Son 40 edinme zaman aşamalı tarama devam s veri.</li>
			<li>Zaman atlama tarama tamamlandığında, ayrıntılı olarak 2.1.5.3 aynı ayarları kullanarak bir son floresans emisyon spektrum taraması gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
<li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li>
<li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li>
<li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li>
<li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Med+Assoc%22%5BJournal%5D)">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li>
<li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
<li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Dis+Assoc+Disord%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie%3A+Uncertainties%2C+biology%2C+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

Rapor için hiçbiri.

Burada, basit vitro yöntemleri gösteri sitotoksik amyloids nesil enfeksiyon sırasında organizma neden bir pnömoni ile izin özetlenmiştir. Bu yöntemler içerir bir hücre kültür sitotoksisite tahlil, immunoblotting, Nefelometri hücrenin bir roman mikroskobik yöntemi ve ThT bağlama kullanarak öldürme. Sitotoksik ajanlar analizleri amiloid doğada (Şekil 2 ve Şekil 4) vardır ve bir deli dana12özellikleri sergi göster...

Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj1,izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek2,3,4,5,6. Çoğu durumda, ölüm de dahil olmak üzere böbrek, akciğer, kalp, uç-organ yetmezliği veya karaciğer olaylar yanı sıra inme5,6çeşit tarafından oluşur. Bu hasta popülasyonda yüksek ölüm oranı nedenini asla kurmuştur.
Zatürre de topluluk-elde olarak sınıflandırılır veya hastane edinilen (nozokomiyal) ve zatürre neden olabilir ajanlar bakteri, virüs, mantar ve kimyasallar içerir. Bakteri Pseudomonas aeruginosanozokomiyal pnömoni önemli nedenlerinden biridir. P. aeruginosa doğrudan hedef hücreleri7,8sitoplazma için ekzoenzimlerden olarak adlandırdığı çeşitli efektör moleküllerin aktarmak için bir tür III salgı sistemi kullanır Ayagin Gram-negatif bir organizmadır. Pulmoner endotel hücreleri enfeksiyon sırasında ekzoenzimlerden endotel bir formu Mikrotubul ilişkili protein tau9,10,11,12 de dahil olmak üzere çeşitli hücre içi proteinlerin hedef. , ağır pulmoner ödemi kaynaklanan endotel bariyer arıza lider, pulmoner fonksiyon ve oftentimes, ölüm düşmüştür.
Daha önce belirtildiği gibi ilk pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj takip ilk 12 ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Bu fenomeni açıklamak için bir potansiyel uzun ömürlü toksin bazı tip zavallı uzun vadeli sonuca yol açar ilk enfeksiyon sırasında oluşturulan bir mekanizmadır. İki gözlem bu olasılığı destekler. Bakterilerin antibiyotik13tarafından öldürdükten sonra bir hafta için çoğalırlar başlangıçta P. aeruginosa ile kabul edilen ilk, kültürlü pulmoner endotel hücreleri başarısız. İkincisi, uzun ömürlü prionlar ve aracıları prion özelliklere sahip çeşitli insan ve hayvan hastalıklarında, özellikle sinir sistemi14,15ile ilişkili hastalıklar gösterdi.
Uzun ömürlü sitotoksik ajanlar potansiyel üretim akciğer enfeksiyonu sırasında İnceleme yöntemleri hiç tarif edilmistir. Burada özetlenen basit vitro deneyleri bir dizi kullanılabilir Sitotoksin üretim ve enfeksiyon bir ortak zatürre neden Ajan, P. aeruginosakullanarak aşağıdaki etkinlik araştırma için. Bu deneyleri enfeksiyon zatürre neden diğer aracıları kullanarak aşağıdaki olası Sitotoksin indüksiyon araştırmak için kolayca adapte olmalı ve üretilen supernatants-meli da var olmak tamamen Sitotoksin etkilerini araştıran için yararlı organ ya da hayvan. Son olarak, büyük olasılıkla burada özetlenen deneyleri hayvan ve insan biyolojik sıvıları Sitotoksin üretimi sırasında zatürree için test etmek için adapte olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Tavşan anti beta amiloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 amiloid oligomer antikoru</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-tau oligomer antikoru</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.22 mikron şırınga filtreleri</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Keçi antitavşan IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Suşları PA103 ve& Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>Bu P. aeruginosa suşları, Wisconsin Üniversitesi Tıp Fakültesi, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>, FITC Griffonia lektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0.22 mikron nitroselüloz</td><td>BioRad</td><td>162-0112'den</td> <td>elde edilmiştir.</td></tr><tr><td>Tip 2 kollajenaz</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin Disodyum tuzu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosetrifügasyon yoğunlaştırıcıları - 10.000 MW kesme</td><td>Milipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum fosfat heptahidrat</td><td>MP Biyomedikal</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

yöntemleri için algılama sitotoksik amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre pseudomonas aeruginosa tarafından

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Pnömoni sırasında akciğer doku enfeksiyonu sonraki uç organ yetmezliği yol açabilir uzun ömürlü Sitotoksin üretiminde sonuçları olan. Sitotoksin akciğer enfeksiyonu sırasında üretilen hipotezi test etmek vitro deneyleri geliştirdik. İzole sıçan pulmoner endotel hücreleri ve bakteri Pseudomonas aeruginosa model sistemleri olarak kullanılır ve endotel hücreleri enfeksiyon bakteri tarafından takip cytoxins üretim ve ardından hücre kültürü kullanarak gösterilmiştir doğrudan Nefelometri laktat dehidrogenaz deneyleri ve bir roman mikroskobik yöntemi kullanmak ImageJ teknoloji kullanarak. Bu Sitotoksin amiloid doğası thioflavin T bağlama deneyleri ve immunoblotting ve A11 Anti-amiloid antikor kullanarak immunodepletion tarafından sunuldu. İmmunoblotting kullanarak daha fazla analizleri oligomeric tau ve Aβ üretilen ve endotel hücreleri enfeksiyon P. aeruginosatarafından takip tarafından yayımlanan olduğunu gösterdi. Bu yöntemler için insan klinik örneklerin analizleri kolayca adapte olmalıdır.

Sitotoksin supernatants P. aeruginosabakteri ile enfekte hücre içinde varlığı için tahlil için bir basit vitro tahlil geliştirilmiştir. Temel olarak, enfekte hücreleri kültür ortamından 4 h bakteriyel eklenmesinden sonra toplanır, bakteri filtresi sterilizasyon süpernatant kültürünün tarafından kaldırılır ve daha sonra steril süpernatant hücreleri yeni bir popülasyon için eklenir. Hücreleri sonra süpernatant eklenmesi sonra 21-24 h gözlenir ve hücre öldürme sayılabilir.<...

Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Bu yöntem, pulmoner bakım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin hastane kaynaklı pnömoniden kurtulan hastaların neden bu kadar kötü uzun vadeli sonuçları var? Bu yöntemin avantajı, basit ve güvenilir olmasıdır, bu da laboratuvara gelen herkese öğretilebileceği ve ertesi gün yararlı ve tekrarlanabilir veriler üretebilecekleri anlamına gelir. Bu analitik yöntemler, kültürlenmiş hücrelerin in vitro enfeksiyonu hakkında bilgi sağlamak için uygulanabilse de, hayvan modellerine ve insan hastalara da uygulanabilir.Sitotoksik süpernatan üretmek için, 150 santimetrelik bir endotel hücresi tabağını HBSS ile yıkayın ve bir P.aeruginosa kolonisini 540 nanometrede 0.25'lik bir absorbansa seyreltin. Bakteri hücrelerini daha da seyreltin, böylece 20 mililitre HBSS'de 20 ila bir enfeksiyon çoğalmasına izin verin ve bakterileri endotel hücrelerinin plakasına tohumlayın. Daha sonra enfekte olmuş hücreleri dört ila beş saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.Bakterilerin ve endotel hücrelerinin inkübasyonunun uygun bir süre boyunca gerçekleşmesi esastır. Kuluçka çok kısaysa, amiloidler süpernatanın içine salınmayacaktır. Kuluçka çok uzunsa, hücreler aslında parçalanacak ve tüm içeriklerini süpernatana bırakacaktır.Uygun bir inkübasyon süresi için kullandığımız gösterge, endotel tek tabakasında boşlukların oluşmasıdır. Işık mikroskobu ile hücre tek tabakasında boşluklar gözlemlenebildiğinde, herhangi bir hücresel kalıntıyı gidermek için süpernatanı santrifüjleme için hasat edin. Süpernatanı 0.2 mikron filtre ile donatılmış bir şırıngaya boşaltın ve kirletici bakterileri gidermek için süpernatanı filtreden geçirin.Daha sonra sitotoksisite testi için 1,5 mililitre steril süpernatan ayırın ve numunenin geri kalanını eksi 80 santigrat derecede dondurun. Hasat edilen süpernatantın sitotoksisitesini değerlendirmek için, 1.5 mililitrelik filtre sterilize edilmiş süpernatanı, birleşik bir pulmoner mikrovasküler endotel hücre kültürü içeren altı oyuklu bir plakanın tek bir oyuğuna ekleyin. Plakayı 21 ila 24 saat boyunca bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.Daha sonra tedavi edilen bölgelerin görüntülerini elde edin ve kültürleri kontrol edin. Görüntüleri özel bir imagej makrosuna aktarın ve kontrastı %15 doymuş piksellere ayarlayın. Kontrastı ayarlanmış görüntüleri çoğaltın ve hem bozulmamış hücrelerin hem de görüş alanı içindeki boşluk alanının yüksek kontrastlı görüntülerini elde etmek için arka planı çıkar'ı kullanın.Bu yüksek kontrastlı görüntüyü orijinal görüntüden çıkarın ve elde edilen görüntüyü orijinal görüntüyle birleştirmek için görüntü hesaplayıcıyı ve işlevi kullanın. Birleştirilmiş görüntüyü, boşlukları siyah ve bozulmamış hücreleri beyaz olan bir maskeye dönüştürmek için eşik işlevini kullanın. Ve görüntüdeki herhangi bir gürültüyü gidermek için ikili aşındırma işlevini kullanın.Ardından, elde edilen görüntüdeki siyah piksellerin beyaza oranını ölçmek için alan kesrini kullanın. Ve her bir tedavi zaman noktası için kesirli alanları, maksimum boşluk alanının yüzdesi olarak çizin ve ifade edin. Süpernatan içindeki amiloidleri ölçmek için, bir mililitrelik spektrofotometre küvetinde bir mililitre PBS'ye 20 mikrolitre taze hazırlanmış ve filtrelenmiş 50X thioflavin T stok çözeltisi ekleyin ve seyreltilmiş numuneyi bir spektroflorometreye yükleyin.425 nanometre uyarma kullanarak temel floresan emisyonunu ölçün. Floresan emisyonunun 450 ila 575 nanometre arasında iki nanometrelik artışlarla taranması. Ardından cihazı, 60 saniye boyunca her 0,2 saniyede bir veri toplama ile 425 nanometre uyarma ve 482 nanometre emisyon kullanarak hızlandırılmış bir tarama gerçekleştirecek şekilde ayarlayın.20 saniye sonra taramayı duraklatın ve küvete 10 mikrolitre filtre sterilize süpernatan yapın. Ters çevirerek karıştırdıktan sonra, küveti spektroflorometreye yeniden yükleyin ve son 40 saniye boyunca zamana dayalı taramaya devam edin. Zaman atlamalı çekimin tamamlanmasının ardından, orijinal tarama ayarlarını kullanarak son bir floresan emisyon spektrumu taraması gerçekleştirin.Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin birleşen katmanlarına P. aeruginosa eklenmesi, hücreler arasında boşluk oluşumuna neden olur. Tedavinin ilk 12 saatinde gösterildiği gibi süpernatan sitotoksisiteyi değerlendirmek için imagej kullanılarak, hala sağlıklı birleşik hücre tek katmanları, mikroskobik alan içindeki tüm beyaz bölgeler olarak görselleştirilebilir. Bununla birlikte, PA 103 ile enfekte olmuş kültürlerden toplanan süpernatantın eklenmesinden 18 saat sonra, tek tabakadaki boşluklar, 36 saatlik tedaviye kadar doğrusal bir şekilde artan hücrelerden yoksun kültür kabı alanı ile tespit edilebilir, bu noktada neredeyse hiç sağlam hücre gözlenemez.Sitotoksisitenin bir belirteci olarak laktat dehidrojenaz salınımı kullanılarak benzer sonuçlar elde edilebilir. Laktat dehidrojenaz ile ilk olarak sitotoksik süpernatantın eklenmesinden 18 saat sonra tespit edilir ve maksimum hücre öldürme 36 saatte ölçülene kadar doğrusal bir şekilde artar. Süpernatanlar ayrıca immünoblot analizi ile veya süpernatanlarda sitotoksik amiloidlerin varlığını belirlemek için amiloid bağlanmasının neden olduğu doğrulayıcı değişikliklere bağlı tioflavin T floresan yoğunluğundaki değişikliğin ölçülmesiyle de değerlendirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, endotel hücrelerinin sitomonsis aeruginosa ile enfeksiyonunu takiben sitotoksik süpernatanların nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ek olarak, bu süpernatanlarda bulunan sitotoksinleri karakterize etmek ve analiz etmek için gereken tahlil türleri konusunda bilgili olmalısınız.

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Balczon, R., ve diğerleri. Pulmoner Endotel Hücrelerinin Pseudomonas aeruginosa Tarafından Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidleri Saptama Yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, amiloid beta tabaka yapılarına bağlanan bir floresan boya olan tiyoflavin T kullanılarak, virülan bakterilerle enfekte olmuş pulmoner endotel hücrelerinden alınan kültür süpernatantlarındaki amiloidleri ölçmek için protokolü göstermektedir. Başlangıca kıyasla floresandaki bir artış, kültür süpernatanında...

Bakteriyel Enfeksiyona Bağlı Amiloidlerin Tiyoflavin T Floresansı Kullanılarak Ölçülmesi

Kaynak: Balczon, R., ve diğerleri. Pulmoner Endotel Hücrelerinin Pseudomonas aeruginosa Tarafından Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidleri Saptama Yöntemleri. J. Vis. Deneyim (2018)Bu video, Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonunu takiben pulmoner endotel hücrelerinden sitotoksik süpernatant üretme prosedürünü göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinlerin konakçı hücre yapısını nasıl bozduğunu ve sitotoksik amiloid oligomerlerinin süpernatana salınmasını nasıl indüklediğini özetlemektedir.

Sıçan Pulmoner Endotel Hücrelerinin Bakteriyel Enfeksiyonunu Takiben Sitotoksik Amiloidlerin Elde Edilmesi

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Pseudomonas aeruginosa bakterisinin intratrakeal enjeksiyonu ile bir fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu model pnömoni sırasında akciğer hasarını taklit eder ve klinik olarak önemlidir.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Burada, pseudomonas aeruginosaküçük koloni varyantı kültüre bir büyüme durumu açıklar. Ayrıca p. aeruginosa tarafından üretilen eksopolisakkarit aljinatının saptanması ve nicelliği için geleneksel üronik asit karbazol testi ve aljinatspesifik monoklonal antikor (mAb) bazlı ELISA kullanılarak iki ayrı yöntem tanımlanmıştır.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Öğrenin, Pseudomonas aeruginosa ile akciğer endotel hücrelerinde sitotoksik amiloid üretimini incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem. Bu protokol, hastane kökenli pnömoni sonrası kötü uzun dönem sonuçların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Daha fazla video keşfet