Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm³ hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.

Bu mesaj, farklı bağışıklık soylarını ve yaşlanma stratejilerini tanımlamak için kullanılan belirteçler gibi Murine modellerinde İmmünhenototiplemedeki anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, immünofenotiyonla tipleme yapıldığında marker ve yaşlanma hallerinin çeşitli minör modellerine uygulanabiliyor olmasıdır. Bir denge kullanarak C57 Black 6 farelerin vücut ağırlığını izleyin.

Ayrıca, kalibre ölçümü ile donör fareler değişen tümör hacmini izlemek. Protokolü uyarınca biyolojik tehlike başlık içinde hayvan Ötanazi sonra, Iodophor bezleri kullanarak tümörün etrafında deri sterilize. Metin protokolünde ayrıntılı olarak tümörü niçin çıkardıktan sonra, tümörü önceden soğutulmuş 20 mililitre PBS içeren bir petri kabına yerleştirin.

Kan kontamine varsa, başka bir Petri kabına tümör transfer ve PBS ile tümör yıkayın. Tümörü ikiye böl. Herhangi bir ekstra deri, damarlar, kireçlenme ve nekroz çıkarın.

Tümör sadece bozulmamış parçaları seçin ve steril bir 50 mililitre santrifüj tüp yerleştirin. Farmakoloji çalışmaları için ayrı bir hayvan odasına tüp taşımadan önce PBS 20 mililitre ekleyin. Ortotopik implantasyona hazırlanmak için, sağ lateral pozisyonda bir deney tahtası üzerinde tam anestezi kalıntı fare sini tökezle.

Dalak çevresindeki deriyi idodine ile dezenfekte edin ve %75 etil alkol le iyotları de-iyotlayın. Dalak orta noktası bulmak ve dalak ortaya çıkarmak için karın üzerinde 1 santimetre dikey kesi yapmak. Yavaşça, düz ucu cımbız kullanarak dalak altında pankreas dokusunun bir kısmını dışarı çekin.

Ve sutro fare homogreft tümör parçası C fare den alıcı farenin pankreas üzerine 9-O bsorbable cerrahi sütür tarafından. Çift dikiş ile 6-O ipek sütür ile karın kapatın. Sıkıştırma ile homeostaz elde edin.

Tümör implantasyonunu bitirdikten sonra, kanama veya tümör dokusu sızıntısı olmadığı sürece hayvanı sıcak bir kafeste tutun. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmak kadar hayvan izleyin. Anesteziden tam olarak iyileştikten sonra hayvanı hayvan odasına geri döndürün.

Dalak yakınındaki karın palpe ederek tümör değişen fareler izlemek ve ortotopik tümörler taşıyan fareler seçin. Her tümör için, tümör sindirim tampon ile bir C tüp hazırlamak. Tümörün tam olarak sindirilmesini sağlamak için 0,8 gramdan daha az tümör parçaları için 3 mililitre sindirim tamponu kullanın.

Çalışma kodu, tümör, fare kimliği, tedavi grubu ve tümör ağırlığı ile tümör etiket. Fareden tümör toplamak. Tümörü soğuk PBS'de yıkayın ve tümöre bağlı olan dokuyu temizleyin.

Steril 6-iyi plaka bir kuyuda sindirim ortamı tümör yerleştirin. Steril cımbız veya forceps ve bir neşter ile dilim ile yerinde tümör tutun. Tümörü daha küçük parçalara ayıracak kadar iyi dilimleyin.

Şimdi, tümör parçalarını C tüpüne geri yerleştirin ve tabağı yıkamak için kalan sindirim tamponunu kullanın. C-tüp içine sıvı aktarın ve sindirim kadar buz üzerine yerleştirin. Sonra ısıtıcıile dissociator açın.

Tümör dissociation C-tüp baş aşağı boş pozisyonun kol içine yerleştirin. Tüp konumunun durumunu Ücretsiz'den Seçili'ye ayarlayın. Program listesinin görüntülendiği gerekli klasörün seçimine göre bir dissociation programı seçin.

Programın sona ermesinden sonra, c-tüpünü ayrıştırıcıdan alın ve numuneyi paletlemek için kısa bir süre döndürün. Şimdi, örnekleri tekrar askıya alın ve 50 mililitrelik bir tüpün üstündeki bir hücre süzgecine koyun. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre yiyincesini 10 mililitre yıkama tamponuyla yıkayın.

5 dakika 300 G'de tüpü santrifüj ettikten sonra, süpernatant'ı atın ve 5 mililitre yıkama tamponu ile hücreleri yeniden askıya alın. Canlı hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonu tüp başına veya numune başına 1 milyon hücreye ayarlayın. Metin protokolünde ayrıntılı olarak bağışıklık paneli tasarımı, immünboyama ve floresan eksi bir kontrol gerçekleştirin.

Akış aletleri kullanmadan önce iyice girdap tarafından ısınma iken UltraComp boncuk hazırlayın. Her florokrom konjuge antikorlar için ayrı bir 12 x 75 milimetrelik numune tüpetiket. Her tüp için boyama tampon 100 mikrolitre ekleyin boncuk bir tam damla izleyin.

Antikorekleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi boyama işlemini gerçekleştirin. Sonra her boncuk pelet için boyama tampon 0,5 mililitre ekleyin ve tamamen girdap ile yeniden askıya. Şimdi, verilen deney için hedef doku başına akış sitometriPMT voltaj ayarlayın.

İleri dağılım ve yan dağılım okumaları başına tek boncuk popülasyonu kazanarak veri elde etmek için Akış sitometrisi aracılığıyla numuneyi çalıştırın. Akış hızını saniyede 200 ila 300 olay arasında ayarlayın. FL1 karşı FL1 nokta arsa kullanarak belirli bir floresan FITC konjugasyon antikorları için uygun telafi ayarlayın.

Negatif boncuklar sol alt kadranda, pozitif boncuklar ise sağ üst veya alt kadranda olacak şekilde bir kadranda kapı yerleştirin. Her popülasyonun ortanca floresan yoğunluğu yaklaşık eşit olana kadar tazminat değerlerini ayarlayın. Tüm tüpler için bu adımları tekrarlayın.

Şimdi, gerçek leke örnekleri almaya devam edin. Telafi sihirbazını çalıştırın ve ayarı biçim: tarih, deneme ve baş harflerinizle kaydedin. Pankreas duktal adenokarsinomun ortotopik implantasyonu subkutan implantasyonda görülene benzer hızlı tümör büyümesi ile sonuçlandı.

Temsili hematoksilin ve eozin boyama görüntüleri gösterilir ve deri altı ve ortotopik implantlarda benzer büyüme gösterir. Her iki tip implantasyonun tümör örneğinden makul olarak yüksek canlı hücre verimleri elde edildi. Temsili FACS splat ölü hücreler ve hücre enkaz ayrılmış tümör canlı hücreleri gösterir.

Burada gösterilen, tümör bağışıklık hücrelerinin birkaç önemli alt kümesinin büyük ve numerator hücre popülasyonunun bir bağışıklık profili karşılaştırma sızan bir tümördür. Pankreas kanserinin subkutan karşı ortotopik homogreft gösterilmiştir. Veriler açıkça tümör önemli ölçüde sağlıklı farelerin pankreas ile karşılaştırıldığında bağışıklık hücresi infiltrasyon artış olduğunu göstermektedir.

Buna ek olarak, ortotopik ve deri altı homogreftlerde immün hücre alt kümelerine sızan tümörün farklı yüzdeleri bulundu. Örneğin, ortotopik te deri altı hücrelerden çok daha fazla B hücresi vardır. Bu yordamı çalışırken tüm ilgili malzeme ve reaktifleri önceden hazırladığını unutmamak gerekir.

Bu videoyu izledikten sonra, nasıl murine modelleri için FACS analizi gerçekleştirmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.