Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Bu yöntem, mezenkimal kök hücrelerin doğrudan sinovyal sıvıdan saflaştırılması için bir prosedür sağlayarak kök hücre alanındaki sıralama protokolündeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, MACS'ın tavşan sinovyal sıvısından izolasyonu ve saflaştırılması için basit ve ekonomik bir protokol oluşturmuş olmamızdır. Genel olarak araştırmalarda, bu yöntem sayesinde büyük çaba sarf ediyoruz, çünkü hücre popülasyonunun çoğaltılması, tek bir hücre süspansiyonu üretilmesine bağlıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, klinik uygulamalar için FDA tarafından şu anda yalnızca manyetik olarak aktive edilen hücre sıralama yönteminin onaylandığını fark ettiğimizde aklımıza geldi. Bu prosedüre metin protokolünde açıklandığı gibi hayvan anestezisi ile başlayın. Tavşanın dizinden eklem sinovyal sıvısının toplanmasını sağlamak için, diz çevresinde yaklaşık beş ila beş santimetre büyüklüğünde bir alan seçin.

Güvenli bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak tavşan tüylerini bu alanın etrafından tıraş edin. Alternatif olarak, prosedür bölgesini povidon iyot çözeltisi ve% 75 etanol ile üç kez dezenfekte edin. Ardından, alan iyice kuruduktan sonra steril örtüler uygulayın.

Lateral eklem boşluğundan diz eklemi boşluğuna bir ila iki mililitre izotonik salin solüsyonu enjekte etmek için steril bir hipodermik şırınga kullanın. Dizinizi üç ila dört kez hareket ettirin ve ardından tüm sinovyal sıvıyı oda sıcaklığında aspire edin. Dört saat içinde kalıntıları temizlemek için sinovyal sıvıyı 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden süzün.

Tavşan SF-MSC'lerini kültürlemek için, filtrelenmiş sıvıyı 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde toplayın ve oda sıcaklığında on dakika boyunca 1.500 rpm'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve peleti PBS ile yıkayın. Peletin tamamı ile kültür ortamı ile yeniden süspanse edildikten sonra, ortamı 100 mililitrelik tabaklara yerleştirin.

Bulaşıkları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. 48 saat sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için bulaşıkları taze ortamla doldurun. Ortamı iki hafta boyunca haftada iki kez pasaj sıfır olarak değiştirin.

İlk kaplamayı takip eden 14 gün sonra, kültür kaplarında birçok koloni oluşmuş olmalıdır. Çapı iki milimetreden daha büyük kolonileri seçin. Seçilen kolonilerin bulunduğu yeri, çanak tabanındaki çevrelerini izleyerek işaretleyin.

Hücre sıyırıcılar kullanarak iki milimetreden daha az genişlikteki kolonileri atın. Seçilen kolonileri bir klonlama silindiri kullanarak yaklaşık beş mikrolitre% 0.25 tripsin ile sindirin ve kolonileri geçiş için yeni bir kaba aktarın. Hücreler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin.

Ardından, her yemeğe bir ila iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Hücre ayrılmasına izin vermek için bulaşıkları iki ila üç dakika inkübe edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini etkisiz hale getirmek için eşit miktarda kültür ortamı ekleyin.

Hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve süzüntüyü 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca 600 kez G'de döndürün. Hücre peletini MACS Çalıştırma Tamponunda yeniden askıya alın.

Manyetik etiketleme yapmak için, bir hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede on dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire ettikten sonra, toplam on milyon hücre başına 80 mikrolitre yeniden süspansiyon tamponu ekleyin.

Toplam on milyon hücre için, bir monoklonal anti-tavşan CD90 antikoru ile konjuge edilmiş 20 mikrolitre mikroboncuk ekleyin. Manyetik boncukları ve hücreleri tüplerde eşit şekilde karıştırın. Daha sonra karanlıkta 15 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Tüpe on milyon hücre başına bir mililitre tampon ekleyin ve daha sonra hücreleri yıkamak için dört santigrat derecede on dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. Peletleri on milyon hücre başına 500 mikrolitre tamponda yeniden süspanse edin.

Kolu, kolon kanatları önde olacak şekilde manyetik ayırıcının manyetik alanına yerleştirin. Manyetik ayırıcı kolonunu on milyon hücre başına 500 mikrolitre tamponla durulayın. Tek hücreli süspansiyonu sütuna aktarın.

Bu etiketlenmemiş hücreleri atmak için negatif hücrelerin manyetik alandan geçmesine izin verin. Kolonu on milyon hücre başına 500 mikrolitre tamponla bir ila iki kez yıkayın ve akışı atın. Kolonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Sütuna on milyon hücre başına bir mililitre tampon ekleyin. Ardından, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu hemen kolona itin. Ayrıştırılmış fraksiyonu zenginleştirebilen CD90 pozitif hücrelerin saflığını artırmak için yukarıda belirtilen prosedürü ikinci bir manyetik ayırıcı kolonla tekrarlayın.

Hücre süspansiyonunu on dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Manyetik olarak aktive edilen hücre sıralamasından sonra hücreleri 100 mililitrelik kaplara aşılayın. Bulaşıkları 37 Santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir hücre inkübatörde inkübe edin.

Birincil kültürün% 80 ila 90'ının birleşmesi sağlandığında, yaklaşık yedi ila on günde, yapışan hücreleri% 0.25 tripsin EDTA ile sindirin ve ikinci geçişi yapmak için bir ila iki seyreltmede geçirin. Hücreleri, in vitro tahliller için kullanılabilecek üçüncü geçişe geçirmek için aynı yöntemi kullanın. Burada, ters mikroskop altında MACS'den önce ve sonra tek katmanlı kültürlenmiş tavşan SF-MSC'lerinin morfolojisi gösterilmektedir.

Sıralamadan önce, yapışık tavşan sinovyal sıvı hücre popülasyonları heterojenlik gösterir. Oval, uzun iğ, kısa iğ ve yıldız morfolojisi gibi çeşitli hücre tipleri ve boyutları içerirler. İkinci ve altıncı pasajın ana morfolojisi, bir iğ morfolojisidir.

CD90 ile MACS'yi takiben, hücre popülasyonları homojen bir morfoloji sergiler. Alt kültür ile hücre sayısı artar. Akış sitometrisi analizi, tavşan SF-MSC hücrelerinin MSC belirteçleri CD44 ve CD105 için pozitif olduğunu gösterdi.

Endotel hücre belirteci CD34 ve hematopoietik hücre belirteci CD45 için negatif iken. Sonuçlar, MACS'den önce tavşan SF-MSC popülasyonunun yaklaşık% 40 MSC hücrelerinden oluştuğunu gösterdi. MACS'den sonra, zenginleştirilmiş popülasyon% 99'dan fazla MSC hücresi içeriyordu.

Burada, MAC sıralamasından önce ve sonra CD90 pozitif markörün akış sitometrisi analizi gösterilmektedir. Alizarin Kırmızı boyama, mineralize nodüllerin üç hafta boyunca osteojenik indüksiyon altında oluştuğunu gösterdi. Üç haftalık adipojenik indüksiyondan sonra, hücre içi Yağ Kırmızı O boyaması ile lipidden zengin vakuol birikimi tespit edildi.

Ağaç haftaları süren kondrojenik indüksiyondan sonra, hücre peleti histolojik olarak Toluidin Mavisi boyaması ile test edildi. Pozitif asidik proteoglikan, kondrosit benzeri hücreleri karakterize etti. Üç haftalık indüksiyondan sonra, osteoblast belirtecinin, adipojenik belirtecin ve kondrojenik belirtecin nispi mRNA ekspresyonu tespit edildi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila dört saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Yeni Zelanda beyaz tavşan sinovyal sıvısından mezenkimal kök hücrelerin basit izolasyonu ve saflaştırılması hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü denerken, çapı iki mililitreden daha büyük olan kolonileri seçmeyi unutmamak önemlidir.

Ayrıca, etiketli bir hücreye bağlı istenmeyen hücreler manyetik boncuk üzerinde kalacağından, immünomanyetik sıralamadan önce tek hücreli bir süspansiyon üretin. Bu prosedürü takiben, mezenkimal kök hücrelerin saflaştırılmasının güvenliğini ve etkinliğini ele alan ek soruları yanıtlamak için floresan ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik eklem kıkırdağı rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların eklem kıkırdak onarımında ideal CD hücrelerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

İşlemlerin kemer soğutma tezgahında yapıldığını ve bu işlem yapılırken mutlaka eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu tekniğin etkileri eklem kıkırdağı hasarının tedavisine kadar uzanır, çünkü sinovyal sıvıdan türetilmiş MASC, eklem kıkırdak rejenerasyonu için umut verici adaylardır.