Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Bu boyama prosedürünün genel amacı, fare jejunum kriyokesitlerinde tutam hücrelerini görselleştirmektir. Bu yöntem, parazit enfeksiyonu sırasında memeli bağırsağında tutam hücrelerinin çoğalmasının nasıl gerçekleştiği gibi gastroenteroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sınırlı histrolojik deneyime sahip araştırmacıların yüksek kaliteli tutam hücre görüntüleri elde edebilmesidir.

Yeni formalinle sabitlenmiş bir fare kadavrasının pelvik organlarını açığa çıkararak başlayın. Rektumun ucunu anüsten kesin ve mezenteri keserek bağırsakları vücuttan ayırın. Jejunumu izole etmek için, bağırsakları mide antrumunun anal tarafından dört santimetre kesin ve kalan ince bağırsağın anal yarısını atın.

Yıkama prosedürünü kolaylaştırmak için jejunumu ikiye bölün. 20 mililitrelik bir şırıngaya 20 mililitre% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisi yükleyin ve eğimi çıkarılmış olarak 18 gauge düz bir iğne takın. Daha sonra, bağırsak içeriğini temizlemek ve bağırsak lümen yüzeyini sabitlemek için kırpılmış jejunumun bir ucundan% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisi enjekte edin.

PBS enjekte ederek bağırsak lümenini yıkayın. Ardından, PBS'yi değiştirmek için sıvı jelatin çözeltisi ile yıkayın. Klipsli jejunumun bir ucunu 6-0 naylon kesik dikiş kullanarak dikiş ligasyonu ile kapatın.

Jejunumu sıvı jelatin ile doldurun ve karşı ucunu dikiş ligasyonu ile kapatın. Daha sonra, jejunumun uzunluğu boyunca dört dikiş düğümü bağlayın. Dokuları 50 mililitre% 15 sükroz içinde% 10 tamponlu nötr formalin çözeltisinde% 4 santigrat derecede gece boyunca bekletin.

Ertesi gün, her iki ucu bağlı üç sosis benzeri jejunem parçası elde etmek için jejunumu dikiş düğümlerinden kesin. Parçaları bir kriyo kalıpta hizalayın, ardından gömme bileşiği ile örtün. Kriyomoldu sıvı nitrojen ile soğutulmuş izopentan içinde dondurun.

Jejunum bölümlerini hazırlamak için, hem kriyostat odası sıcaklığını hem de nesne sıcaklığını eksi 22 santigrat dereceye ayarlayarak başlayın. Donmuş doku bloğunu en az 15 dakika boyunca kriyostat odasındaki bir kriyokalıba yerleştirin. 15 dakika sonra, jejunumun enine kesitini ortaya çıkarmak için bloğu bir jiletle ikiye bölün.

Bloğun yarısını bir kriyostat adaptörüne monte edin. Jelatin dolgulu jejunumu 30 mikron kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri 3 mililitre PBS içeren 35 milimetrelik bir kültür kabına nazikçe aktarmak için donmuş forseps kullanın.

Bölümleri her biri 3 mililitre PBS-T ile beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, serbest yüzen bölümleri içeren tabağa 3 mililitre taze hazırlanmış antijen alma solüsyonu ekleyin. Daha sonra kapağı kapatın, çanak ile kapak arasındaki boşluğu bir vinil bant şeridi ile kapatın ve 50 santigrat derecede bir hibridizasyon inkübatöründe sallamadan üç saat inkübe edin. İmmüno-boyamadan sonra, PBS'deki lekeli bölümlerin tabağını stereoskopik bir mikroskoba aktarın.

200 mikrolitre PBS'yi MAS kodlu beyaz cam slaytın ortasındaki bir damlacığa yerleştirin. Ardından, bir jejunum bölümünü tabaktan damlacığa aktarmak için bir P200 pipet ucu kullanın. Bölüm hizalamasını ayarladıktan sonra, bölümü çevreleyen kalan tüm PBS'yi aspire edin.

20 mikrolitre sulu montaj ortamı ekleyin ve ortamın üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Kapak kayma kenarlarını hemen ksilen bazlı montaj ortamı ile kapatın ve konfokal mikroskopiye başlamadan önce iki ila üç saat kurumasını bekleyin. Jejunumun jelatin dolgusu, yuvarlak disk şeklini korur ve villusun dik pozisyonunu korur.

Jelatin dolgunun yokluğunda, jejunal bölümler bükülme eğilimindedir ve villusun geriye doğru sallanmasına izin verir. pY1798, zar, makara şeklindeki somanın sitoplazması ve sağlam sinyal yoğunlaşmasının bir tutam hücresinin çıkıntılı tutamına karşılık geldiği güçlü lekeli luminal uç dahil olmak üzere tüm tutam hücrelerini tekrarlanabilir bir şekilde tanımlar. Phalloidin, bağırsak fırçası sınırını oluşturan mikrovilluslarda bulunan filamentli aktin için yüksek afiniteye sahiptir.

Phalloidin, tutamdan uzanan bir kökçük kütlesine karşılık gelen kalınlaşmış fırça kenarlığını tekrarlanabilir ve belirgin bir şekilde işaretler. pY1798 sinyallerinin belirgin şekilde kalınlaşmış, falloidin pozitif fırça kenarlığı ile tutarlı bir şekilde birlikte lokalizasyonu, bu protokolün, bir villus üzerinde mi yoksa bir kriptte mi bulunduklarına bakılmaksızın tutam hücrelerini başarıyla tanımladığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir.

Düşük emisyonlu nokta jelatini, serbest yüzen kriyo-kesitler ve düşük sıcaklıkta antijen alımının kombinasyonu, diğer proje dokularının immüno-boyaması için uygulanabilir.